Штамм гриба hypomyces rosellus - продуцент липидов с одновременным присутствием органического пигмента

 

Использование: изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, в частности, в пищевой, медицинской, фармацевтической промышленностях и производстве парфюмерно-косметических средств, а также и в лакокрасочной промышленности. Сущность изобретения: разработан новый штамм Hypomyces rosellus Л-1 (ВКПМ F - 672) - продуцент липидов с одновременным присутствием органического пигмента. Преимуществом является замена дефицитных растительных масел и натуральных красителей равноценными компонентами, получаемыми биотехнологией, которая позволяет получать их в необходимом количестве с определенными свойствами и значительно ниже по стоимости. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, представляет собой новый штамм микроскопического гриба - продуцент липидов высокой степени ненасыщенности и органического пигмента, может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, в частности в пищевой, медицинской, лакокрасочной промышленностях и косметологии.

Образование биомассы многих микроорганизмов сопровождается в той или иной степени накоплением в ней жировой компоненты - липидов. Известен штамм гриба Claviceps purpurea ВНИИА-312А, используемый в качестве продуцента липидных фракций, максимально приближенных по составу к хлопковому маслу.

Недостатком известного штамма является отсутствие свойства продуцировать пигменты и при синтезировании биомассы требуются дорогостоящие питательные среды, в частности значительное количество сахарозы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм дрожжей Rhodotorula aurantiaca Н-188 или штамм Rhodotorula glutinis VI, продуцирующий одновременно с липидами - каротиноиды.

Недостатком этих штаммов является то, что накопленные липиды содержат жирные кислоты, состав которых малоценен, а пигменты класса каротиноидов обладают ограниченной цветовой гаммой.

Цель изобретения - получение штамма Hypomyces rosellus Л-1, продуцирующего липиды высокой степени ненасыщенности, что приближает их по составу к природным маслам, в частности к арахисовому. Одновременно данный штамм образует органический пигмент хиноновой природы, который обеспечивает более широкую цветовую гамму и в составе биомассы или после его извлечения из биомассы может быть использован в качестве красителя, равноценно заменяющего природные.

Штамм Hypomyces rosellus Л-1 получен отбором индуцированных 2-аминопурином мутантов и последующей селекции по признаку максимального липидообразования, связанного с ауксотрофией по основным коферментам, и идентифицирован как Hypomyces rosellus с использованием соответствующей литературы.

Штамм Hypomyces rosellus Л-1 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" и ему присвоен N F-672, в качестве продуцента липидов и органического пигмента.

Штамм Hypomyces rosellus ВКПМ F-672 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-мофрологические признаки. При выращивании на плотных средах при температуре 22-24^оС; рН 5,4-6,5 и возрасте культуры 72-86 ч мицелий характеризуется кондиеносцами прямыми разветвлениями. Конидиогенные клетки ампуловидные, расположены в мутовках. Конидии холобластические, образующиеся в результате последовательной симпоидальной пролиферации вершины конидиогенной клетки - симпфулоконидии, одноклеточные, позднее с 1-3 поперечными перегородками. Овальные или цилиндрические с закругленными концами, у основания часто с небольшим сосочком 24-32 х х9-13,5 мкм. Хламидоспоры обильные, округлые. В парных культурах совместными штаммами образуют сумчатую стадию. Субикулюм распростертый, сначала белый, позднее приобретает желтую, коричневую или красную окраску, плотный. Перитеции тесно скученные или разбросанные, вначале погруженные в субикулюм, позднее поверхностные. Сумки цилиндрические. Аскоспоры веретеновидные, двухклеточные, с перетяжкой на концах длинными придатками, бородавчатые, бесцветные, 28-40 х 6,5-7,5 мкм.

Сусло-агар. Колонии широко растущие, рыхлые пушистые, с неровным краем, сначала белые, затем коричнево-желтые с обильными малиновыми участками, затем малиновые. Спороношение обильное, в виде белого налета по всей поверхности колонии. Обратная сторона колонии и среда карминно-красные до темно-пурпурных.

Среда Чапека с сахарозой. Колонии широко растущие, очень рыхлые, сначала белые, затем местами розовые или желтоватые. Спороношение необильное. Среда окрашена в бледно-розовый цвет.

Среда Чапека с 0,5%-ного кукурузного экстракта. Колонии широко растущие, пушистые, сначала белые, быстро приобретающие розовато-малиновую окраску с коричнево-желтыми участками. Спороношение обильное, в виде белого налета по всей поверхности колонии. Обратная сторона колонии и среда темно-красные с желтовато-коричневыми участками.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм H.r. аэроб, СО₂ способствует увеличению выхода целевого продукта, максимальная рН среды 8, минимальная - 4,5, а оптимальная рН 5,4-6,5. Интенсивный рост штамма наблюдается в интервале температур 18-28^оС, слабый рост при температуре 5-10^оС и 30^оС, рост отсутствует при температуре 0 и 35^оС. Усваивает нитраты калия и аммония, мочевину, пептон, гидролизат казеина, соевую муку, ксилозу, глицерин, магний. Крахмал гидролизует, в очень слабой степени гидролизует целлюлозу. Штамм длительно хранится при лиофилизации в сахарозо-желатиновой среде, температура хранения +2+5 ^оС.

Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером использования штамма Hypomeces rosellus Л-1.

П р и м е р 1. Для культивирования в колбе емкостью 500 мл готовят питательную среду следующего состава г/л: этанол 10,0; сусло 16^оБ - 200,0; вода водопроводная до 100 мл. Процесс выращивания штамма осуществляют при температуре 25^оС при рН 6,2 в течение 72 ч. Выход сырой биомассы 10 г/л при содержании липидов 27% и органического пигмента бордового цвета 1,92 мас.%.

П р и м е р 2. Штамм Hypomyces rosellus Л-1 выращивают в колбе емкостью 1 л на термостатированной качалке при +20^оС. В колбу наливают 100 мл среды следующего состава, г/л: NaH₂PO₄ - 7,0; KH₂PO₄ - 6,8; MgSO₄- 0,7; декстран 5,0; ферментативный гидролизат БВК - 20,0.

Процесс ведут при температуре 22^оС и рН - 6,5. Выход сырой биомассы 8 г/л при содержании липидов 26 мас.% и органического пигмента 1,5 мас.%.

П р и м е р 3. Выращивание штамма осуществляли в ферментере емкостью 100 л. Предварительно посевную культуру выращивали на питательной среде, г/л: сусло 16^оБ 500, кальций углекислый 30, агар 17, вода до 1 л.

Для получения посевной культуры гриба колба с жидкой питательной средой засевается смывом с агаризованной среды в пробирках (1 косяк на 2 колбы). Культивируют при температуре 26±1^оС в течение 72 ч на качалке 220 об/мин.

Для проведения выращивания Hypomy-ces rosellus в ферментере-100 л готовят среду следующего состава, г/л: сусло 300, крахмал 50, сернокислый аммоний 40, сернокислый магний 5, хлористый калий 5, калий фосфорнокислый двузамещенный 5, углекислый кальций 3, протосубтилиновый гидролизат БВК 20, вода водопpоводная до 1 л. Среду стерилизуют при 1 атм 1 ч.

Ферментер засевают культурой продуцента в количестве 5% от объема. Устанавливают режим аэрирования 1:3, 100 об/мин мешалки и осуществляют выращивание культуры гриба при температуре 26^оС и рН 5,8 в течение 72 ч.

Полученную биомассу фильтровали через ткань, сушили на воздухе при комнатной температуре 24^оС в течение 3-4 дней до постоянного веса.

Высушенную биомассу с содержанием влаги не более 6% измельчают и помещают в бумажный пакетик, экстрагируют в аппарате Сокслета в течение 5 ч, используя в качестве растворителя низкомолекулярные предельные углеводороды для того, чтобы избежать одновременного экстрагирования органического пигмента.

Полученный экстракт высушивают путем испарения растворителя в вытяжном шкафу. Растворитель, с присутствующими в нем липидами отгоняют для разделения чистого растворителя и липидов. Определяют количественный выход липидов и сухого остатка, содержащего органический пигмент. Экстрагированную окрашенную биомассу многоступенчато обрабатывают спирто-эфирной смесью для получения кристаллического чистого пигмента, содержание которого составляет до 2,5 мас.%.

Количественное содержание жирных кислот в липидах определяют газо-жидкостной хроматографией. Целевой продукт - липиды содержат 74% свободных жирных кислот следующего состава,%: миристиновая С_14:0 0,1; пальмитиновая С_16:0 13,5; пальмитолеиновая С_16:1 0,7; гексадекадиеновая С_16:2 в сумме с изогептадекановой С_17:0 0,6; стеариновая С_18:0 4,0; олеиновая С_18:1 50,2, линолевая С_18:2 30,5; арахиновая С_20:0 в сумме с линолевой С_18:3 0,6; эйкозеновая С_20:1 0,2 и сходны по составу с арахисовым маслом. Сравнительные данные приведены в таблице.

Данный штамм продуцирует липиды и органический пигмент при накоплении биомассы, что позволяет рассматривать вопрос о разработке биотехнологического процесса в условиях непрерывного двухстадийного культивирования. При этом полученная биомасса обладает постоянством жирнокислотного и фракционного состава липидов и органического пигмента во всех фазах роста, что обеспечивает стандартный состав продуктов.

Липиды имеют высокое содержание непредельных жирных кислот и могут служить заменителем растительных масел в технических целях. Особенно ценно наличие значительного содержания олеиновой ( 50% ) и линолевой (≈ 30%) кислот, что позволяет разработать способ выделения этих кислот в чистом виде для дальнейшего их использования в лекарственных препаратах. Чистый органический пигмент может быть использован для окрашивания пищевых продуктов, напитков и различных парфюмерно-косметических средств. Высушенная тщательно измельченная биомасса, содержащая остаточный пигмент может быть использована в лакокрасочной промышленности.

Таким образом, использование изобретения обеспечивает получение хозяйственно-ценных продуктов для пищевой, медицинской, фармацевтической промышленности и производства парфюмерно-косметических средств.

Формула изобретения

Штамм гриба Hypomyces rosellus ВКПМ F-672 - продуцент липидов с одновременным присутствием органического пигмента.

РИСУНКИ

Рисунок 1