Способ получения комплекса супероксиддисмутазы и каталазы из эритроцитов крови человека

 

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к энзимологии. Целью изобретения является интенсификация способа. Поставленная цель достигается тем, что эритроциты крови человека отмывают физиологическим раствором, центрифугируют при 2500 g в течение 15 мин, лизируют эритроциты равным объемом дистиллированной воды в течение 4 ч при температуре -4°С. В лизат добавляют 0,3 - 0,5% мочевины по объему. Затем лизат эритроцитов обрабатывают смесью хлороформа и этанола в соотношении лизат - хлороформ - этанол 1 : 0,15 : 0,25 в течение 40 - 60 мин. Центрифугируют, удаляют осадок. К надосадочной жидкости добавляют 0,1 н. раствор соляной кислоты до рН 3,7 - 4,2. Осадок выдерживают 10 - 12 ч, повторно центрифугируют. К полученной надосадочной жидкости добавляют ацетон в соотношении 1 : 1 при температуре -4°С. Далее повторно центрифугируют, осадок растворяют в фосфатном буфере с рН 7,4 - 7,8, проводят диализ против фосфатного буфера с последующей стерилизующей фильтрацией целевого продукта. Целевой продукт содержит 1 фракцию каталазы и 2 фракции супероксиддисмутазы. Электроферетическая чистота 99%, содержание супероксиддисмутазы 33,3%, каталазы 66,6%, примесей 0,1%. Предложенный способ позволяет сократить время получения целевого продукта по сравнению со способом-прототипом с 50 - 56 до 26 - 36 ч.

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к энзимологии.

Целью изобретения является интенсификация способа.

Способ осуществляется следующим образом.

5 л эритроцитов крови человека отмывают 0,85-1,0%-ным раствором хлористого натрия, центрифугируют при 2500g в течение 15 мин, лизируют эритроциты равным объемом дистиллированной воды в течение 4 ч при температуре 4^оС. В лизат добавляют ионы Cu⁺² и Zn⁺² (из расчета 50 мг уксуснокислой меди и 200 мг уксуснокислого цинка на 1 л смеси). Для стабилизации фермента каталазы в смесь добавляют 0,3-0,5% мочевины по объему, тщательно размешивают в течение 15 мин. Затем лизат эритроцитов обрабатывают смесью хлороформа и этанола, охлажденных при минус 20^оС, в соотношении лизат-хлороформ-этанол 1:0,15:0,25 при непрерывном помешивании в течение 40-60 мин. Центрифугируют при 2500g, удаляют осадок гемоглобина. К надосадочной жидкости добавляют 0,1 н.раствора соляной кислоты до рН 3,7-4,2. Осадок формируют в течение 10-12 ч, повторно центрифугируют. К полученной надосадочной жидкости, содержащей целевой продукт, добавляют ацетон в соотношении 1:1 при температуре минус 4^оС. Время созревания осадка 2 ч. Далее центрифугируют при 2500g в течение 20 мин. Осадок растворяют в 80-100 мл KNa-фосфатном буфере с рН 7,4-7,8. Затем проводят диализ против 0,15 М фосфатного буфера с последующей стерилизующей фильтрацией целевого продукта через пластины ЕК.

Целевой продукт содержит 1 фракцию каталазы и 2 фракции супероксиддисмутазы. Электрофоретическая чистота 99% содержание супероксиддисмутазы 33,3% каталазы 66,6% примесей 0,1% Удельная активность супероксиддисмутазы 2500-3000 ед. на 1 мг белка, каталазы 30000-40000 ед. активности на мг белка.

П р и м е р. 5 л эритроцитов крови человека отмывают 0,85%-ным раствором хлористого натрия, центрифугируют при 2500g в течение 15 мин. Затем лизируют эритроциты равным объемом дистиллированной воды (5 л) в течение 4 ч при 4^оС. В лизат добавляют 500 мг уксусно-кислой меди и 2 г уксусно-кислого цинка. Затем в лизат вносят навеску мочевины 50 г, тщательно размешивают 15 мин. В смесь (10 л) добавляют 2,5 л спирта и 1,5 л хлороформа, охлажденных до -20^оС при непрерывном перемешивании в течение 40 мин. Затем центрифугируют при 2500g, удаляют осадок. В супернатанте устанавливают рН 0,1 н. раствором соляной кислоты до рН 4,0. Формируют осадок в течение 11 ч. Сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием при 2500g. Из полученной надосадочной жидкости (7,5 л) осаждают комплекс ферментов охлажденным ацетоном в количестве 7,5 л. Осадок созревает 2 ч. Повторно центрифугируют при 2500g в течение 20 мин. Осадок растворяют в 100 мл КNa-фосфатном буфере. Далее проводят диализ против 0,15 М фосфатного буфера с последующей стерилизующей фильтрацией целевого продукта.

Предложенный способ позволяет ускорить процесс получения целевого пpодукта по сравнению с прототипом с 50-56 до 26-36 ч.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА путем отмывки эритроцитов физиологическим раствором, центрифугирования в течение 15 мин, обработки осадка эритроцитов равным объемом дистиллированной воды с последующими очисткой лизата и стерилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью интенсификации способа, после обработки осадка эритроцитов дистиллированной водой к лизату добавляют мочевину в конечной концентрации 0,3 0,5% выдерживают 15 мин, затем лизат обрабатывают смесью хлороформ: этанол в соотношении лизат: хлороформ: этанол 1 0,15 0,25 при непрерывном перемешивании, центрифугируют к надосадочной жидкости добавляют 0,1 н раствор соляной кислоты до pH 3,7-4,2, выдерживают в течение 10-12 ч повторно центрифугируют, к надосадочной жидкости, содержащей целевой продукт, добавляют ацетон в соотношении 1 1.