Способ получения ингибитора бромелайна

 

Использование: изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ингибитора бромелайна. Сущность способа заключается в том, что пролиферирующие верхушки плодов ананаса экстрагируют водой в соотношении сырье - растворитель 1:(2-4) и далее проводят очистку на сефарозе с иммобилизованной протеиназой цистеинового типа в ацетатном буфере pH 4,4-4,6, отмывание сорбента осуществляют 0,1 М фосфатным буфером pH 7,6-7,8, содержащем 0,5 м хлористого натрия, а целевой продукт элюируют 0,01 N раствором гидроксида натрия, содержащем 0,1 м хлористого натрия. Технический результат заключается в упрощении способа.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ингибиторов ферментов, в частности ингибитора цистеиновых протеиназ из растительного сырья ингибитора бромелайна.

Ингибиторы цистеиновых протеинах растений находят широкое применение в медицине и научных исследованиях. Эти ингибиторы обнаружены в источниках как животного, так и растительного происхождения. Они выделены из эпидермиса, внутренних органов, из плазмы крови животных и человека. Ингибиторы обнаружены в клубнях картофеля, семенах риса и кукурузы, в стеблях ананаса.

В качестве прототипа выбран способ получения ингибитора бромелайна (цистеиновая протеиназа ананаса из сока стеблей ананаса), заключающийся в измельчении стеблей ананаса, отжимании из них сока с последующим двустадийным осаждением ацетоном. Затем ацетоновый порошок стебля ананаса подвергается гель-хроматографии на сефадексе G-75 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ сефадексе при рН 7,55 [1] Известный способ является сложным, предусматривающим двустадийное осаждение ацетоном и последующую очистку препарата ингибитора в две стадии. Кроме того, использование ацетона увеличивает опасность производства, особенно в странах с жарким климатом.

В связи с изложенным, технический результат будет заключаться в упрощении способа.

Предлагаемый способ получения ингибитора бромелайна заключается в следующем. В качестве источника сырья используют отходы промышленной переработки ананасов (пролеферирующие верхушки плодов ананаса), извлечение белков осуществляют путем экстракции водой. При этом соотношении сырья и экстрагента составляет 1:(2-4) г/мл. Сырье с экстрагентом помещают в гомогенизатор, измельчают и затем экстрагируют в течение часа при комнатной температуре, перемешивая механической мешалкой. Полученную массу отжимают, центрифугируют и осветленный раствор белков, подкисленный до рН 4,4-4,6 пропускают через колонку с иммобилизованной на сефарозе протеиназой цистеинового типа, например, бромелайном, уравновешенную 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,60. Неспецифически сорбированные белки удаляют 0,1 м фосфатным буфером, рН 7,6-7,8, содержащим 0,5 М NaCl. Эволюцию связанного на колонке ингибитора осуществляют 0,01 н раствором NaOH, содержащим 0,1 М NaCl, рН 11,5 12,0. При этом следует отметить важное значение соблюдения всех этих условий выделения ингибитора. Многочисленные попытки выделения ингибитора при условиях, отличающихся от вышеописанных не приводили к получению ингибитора. Так, связывание ингибитора бромелайна осуществляют исключительно при рН 4,4-4,6, а элюцию ингибитора с носителя можно осуществить только в узком интервале сильнощелочных значений рН 11,5-12,0.

П р и м е р 1. К 250 г измельченной массы пролиферирующих верхушек ананаса добавляют 500 мл воды и проводя дальнейшее измельчение в гомогенизаторе. Экстрагирование продолжают при перемешивании механической мешалкой в течение часа при комнатной температуре с добавлением еще 500 мл воды. Полученную массу отжимают через несколько слоев марли, центрируют при 3000 xg один час. Получают 920 мл раствора, содержащего 1500 мг белка с удельной активностью 0,0086 и. ед/мг. За единицу ингибиторной активности (и.ед.) принято такое количество ингибитора, которое полностью подавляет активность 1 мг активного бромелайна. Супернатант подкисляют до рН 4,4-4,6 уксусной кислотой и наносят на колонку с 50 мл сефарозы с иммобилизованным бромелайном, уравновешенную 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,60. Неспецифически сорбированные белки удаляют 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,60, содержащим 0,5 М NaCl. Эволюцию связанного ингибитора с иммобилизованного бромелайна осуществляют 0,01 н раствором NaOH, содержащим 0,1 М NaCl. Выход ингибитора достигает 94% увеличение ингибиторной активности по сравнению с исходной в 389 раз. Молекулярная масса ингибитора около 6 кДа, очищенный ингибитор эффективно действует на папаин, фицин, бромелаин, трипсин.

П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но весовое соотношение сырье:растворитель составляет 1:4, а в качестве сорбента используют иммобилизованный на сефарозе 6В папаин. В результате выход ингибитора составляет 90% увеличение ингибиторной активности по сравнению с исходной 388 раз.

Сводные данные об эффективности способа отражены в таблице.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА БРОМЕЛАЙНА путем экстракции измельченных отходов промышленной переработки ананасов с последующим хроматографическим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют пролиферирующие верхушки плодов ананаса, экстракцию проводят водой при массовом соотношении сырье: растворитель 1:2-4, а выделение целевого продукта осуществляют аффинной хроматографией на сефарозе с иммобилизованной протеиназой цистеинового типа в ацетатном буфере pH 4,4-4,6, отмывания сорбента проводят 0,1 М фосфатным буфером pH 7,6-7,8, содержащим 0,5 М хлористого натрия, а элюцию целевого продукта 0,01 н. раствором гидроокиси натрия, содержащем 0,1 М хлористого натрия при pH 11,5-12,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1