Способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

 

Использование: в нефтяной промышленности, сельском хозяйстве и экологии, может быть использовано для биологической рекультивации земель, подвергнутых загрязнению нефтью и нефтепродуктами. Сущность изобретения: способ включает введение в почву бактериальной культуры в смеси с минеральным удобрением. В качестве бактериальной культуры используют природный штамм Mycobacterium Sp 5 кВ в количестве 15·10⁶- 15·10⁷ клеток на 1 г нефтепродуктов. Бактериальную культуру вносят в жидкой форме или на стерильном органическом субстрате носителе в виде бактериального препарата с содержанием бактерий 10¹⁰- 10¹¹ клеток в 1 г (или мм) препарата. При необходимости почву предварительно известкуют до рН 6,0 6,5, а также вносят органические удобрения. 2 з.п. ф-лы, 1 ил. 5 табл.

Изобретение относится к нефтяной промышленности, сельскому хозяйству и экологии и может быть использовано для биологической рекультивации земель, подвергнутых загрязнению нефтью и нефтепродуктами в результате аварий и эксплуатационных потерь при добыче, транспортировке и, главное, хозяйственной деятельности человека. Нефть и, практически, все нефтепродукты оказывают резкую депрессию функциональной активности почвенной флоры и фауны, тем самым исключая почву, как объект природопользования. Восстановление естественного плодородия загрязненных нефтью почв требует значительно большего времени и усилий по сравнению с другими техногенными загрязнениями. Этой проблеме посвящены многочисленные научные исследования и разработки; среди последних наиболее действенным способом считается искусственное введение в очищаемую почву специально подобранных штаммов микроорганизмов, способных в большей или меньшей степени активно окислять (ассимилировать) саму нефть или продукты ее переработки дизельное топливо, керосины и т.д. Такие микроорганизмы вносятся в почву в составе прочих ингредиентов; штаммы микроорганизмов, их количество, состав сопутствующих ингредиентов, форма препарата, технология изготовления относятся в большинстве случаев к разряду ноу-хау.

Известен бактериальный препарат "Путидойл", предназначенный для очистки нефтезагрязненных земель и водоемов. Препарат "Путидойл", взятый в качестве прототипа, изготовляется на основе бактериальной культуры природного штамма Pseudomonas putuda-36 [1, 2] Препарат указывает на его высокую биологическую эффективность. Однако он обладает рядом существенных недостатков.

1. Препарат "Путидойл" представляет собой сухую бактериальную массу и для его предварительного "оживления" необходим трудоемкий комплекс мероприятий, выполняемых в полевых условиях: подогрев большого количества воды (5м ³) до температуры 18-28^оС (практически, до 28^оС), обеспечение аэрирования в течение 12-16 ч, перемешивание.

2. Кроме того, была показана низкая эффективность бактериального препарата "Путидойл" при процессах микробного самоочищения. К тому же, он угнетающе действует на естественный микробный биоценоз (см.Новиков Ю.В. Комзолова Н.В. "Исследование бактериального препарата "Путидойл", предназначенного для очистки водоемов от нефти". Водные ресурсы 1992 N 2 с.121-123).

Целью предлагаемого изобретения является создание бактериального препарата "Нафтокс", лишенного указанных недостатков прототипа и способного активно окислять нефть и нефтепродукты, создавая таким образом предпосылки для использования очищенных почв в хозяйственных целях и улучшения экологической обстановки окружающей среды. В изобретении приводятся некоторые параметры практических способов применения препарата "Нафтокс".

Цель достигается использованием для очистки почв от нефтезагрязнений штамма Mycobacterium Sp-5kB, выделенного из природных источников и отличающегося высокой степенью утилизации нефти и нефтепродуктов.

Сравнительная скорость утилизации нефти, дизельного топлива и авиационного керосина штаммами Ps.putida-36 и Mycobacterium Sp-5kB приведена в табл. 1.

Род Mycobacterium имеет ряд преимуществ по сравнению с другими микроорганизмами в процессе микробиологической деградации нефти в природных условиях. Микpоорганизмы этого рода, пpи высокой окислительной активности, обладают способностью аккумулировать углеводороды в клетках с одновременным эмульгирование в случае культивирования в водных средах. Это утверждение правомочно, вероятно, и относительно таких сред, как почвенный раствор.

Культурально-морфологические особенности выделенного штамма следующие. Мелкие, толстые, слегка изогнутые палочки с округлыми краями, спор и капсул не образует. При культивировании на качалке или в ферментере образует кокковидные элементы. Размеры 2,5 х 0,2 мкм. Грамм-положительные (окрашивается нечетко). Аэробы. Колонии на поверхности агара оранжево-розовые, сухие, с неровными краями; сердцевина колонии ярче. Пpи глубинном засеве агаровых сред поверхностные колонии розоватые в форме звездочек. Кислото- и спиртоустойчивые. Желатин не разжижают.

Микобактерии имеют повсеместное распространение в районах добычи и переработки нефти. Установлено 13 видов микобактерий, способных утилизировать нефть.

Микобактерии основная микрофлора активного ила очистных сооружений нефтеперерабатывающих заводов.

Микобактерии способны ассимилировать не только нормальные алканы, но и сопутствующие составляющие нефти: циклические соединения фенол, бензойную кислоту, нафталин, циклогексан, высшие жирные кислоты. Чрезвычайно важным обстоятельством является то, что нередко указанные субстраты являются более предпочтительными источниками углерода и энергии, чем углеводы, например, глюкоза.

Микобактерии не требовательны, в отличие от псевдомонад или других родов бактерий, к условиям внешней среды; их находят не только в верхних горизонтах почв, но даже на глубине 25-550 м глинистых отложений.

Рассматриваемый штамм микобактерий опробирован соответствующей медицинской службой и допущен для широкого использования. Штамм Mycobact.Sp-5 kB депонирован во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под N 375 А.

В процессе выполнения настоящей разработки были проведены исследования по "приживаемости" разных родов и штаммов бактерий в почвах, пропитанных нефтью. Установлено, что у большинства внесенных в такую почву бактерий (различные виды псевдомонад, включая Ps.putida-36) лишь около 10% остаются в жизнеспособном состоянии не более 30 дней, в то время как не менее 50% от числа внесенных клеток микобактерий оставались жизнеспособными в течение 120 дней.

Окисление в почве углеводородов химическим или биологическим способом может приводить к образованию фитотоксических продуктов со всеми вытекающими отсюда негативными последствиями агрономического плана. Иначе говоря: для биологических объектов исходные нефтяные субстраты могут оказаться менее токсичными, чем промежуточные продукты их окисления.

Сравнение действия Ps. putida-36 и Mycobacterium-5 kB показало, что в процессе культивирования на 2% дизельном топливе и керосине (жидкие, аэрируемые культуры) в ферментационной жидкости накапливаются токсические соединения, ингибирующие рост растений, причем в ферментационной жидкости предлагаемой культуры таких токсинов содержится значительно меньше, чем в культуре пpототипа (см.данные табл.2).

Таким образом, из данных, приведенных в табл.2, преимущество предлагаемого штамма микобактерий по сравнению с культурой прототипа очевидно.

Предлагаемый штамм микобактерий может быть использован в виде бактериального препарата "Нафтокс". Препарат "Нафтокс" получают по известной технологической схеме, принятой для производства препаратов азотфиксирующих бактерий (Позднякова А.И. Хотянович А.В. и др. авт.св. N 922104, 1982 N 15). Нейтрализованный до рН 6,8-7,0 гамма-стерильный торф в полиэтиленовых пакетах инокулируют жидкой культурой нефтеокисляющих бактерий с одновременным введением источника углерода и энергии в данном случае н-алканов С₁₅-С₂₀ в количестве 1-2% от массы сухого торфа, перемешивают и инкубируют при 18-20^оС; конечная влажность "Нафтокса" 55-60% Гарантийный срок годности "Нафтокса" 6 мес. В одном грамме препарата содержится не менее 10⁹-10¹⁰ клеток микобактерий 5КВ.

Известно, что главным фактором заселения почвы интродукцируемыми микроорганизмами является скорость их размножения в данном субстрате. Однако выживаемость (сохранность) данного штамма в почве или других сходных субстратах, как правило, не коррелируется со скоростью размножения. Между тем, в случае микробиологического метода очистки почв от нефтяных загрязнений важно сохранить жизнеспособность бактерий на возможно длительный срок.

На чертеже представлена сравнительная характеристика рассматриваемых штаммов, интродуцированных в нефтезагрязненную почву (15 кг авиационного керосина в 1 м³ почвы).

Из приведенных данных следует, что рассматриваемые штаммы четко различаются по выживанию в почве в течение длительного времени: Pseudomonas putida 36 в начале более интенсивно накапливает клетки, однако их титр быстро снижается. Снижение числа клеток Mycobacterium идет относительно медленно. Несомненно, что "атакуемость" нефтепродуктов определяется не только удельной ферментотативной активностью данного штамма микроорганизмов, но и их количеством. Пpи разработке препарата "Нафтокс" исходили из общего положения о том, что эффективность препарата определяется количеством бактерий в этом препарате и их способностью сохранять высокий и относительно стабильный титр в почвах, подвергаемых биологической очистке.

Помимо этого Mycobacterium Sp-5КВ отличается от штамма Pseudomonas-Putida 36, равно как и от других штаммов этого рода, высокой технологичностью. Технологичность штамма обеспечивает высокий и стабильный титр его в препарате и в почве в течение длительного времени, что имеет основополагающее значение при промышленном выпуске и практическом использовании биопрепарата.

С целью определения минимального количества нефтеокисляющих бактерий, необходимого для практически полного окисления нефтепродуктов в почве, были выполнены модельные опыты с применением дизельного топлива и авиационного керосина, вносимых в почву с последующей инокуляцией такой почвы разными количествами нефтеокисляющих бактерий. Результаты представлены в сводной табл. 3. Продолжительность опыта 3 мес; температура 20-22^оС; влажность почвы 60% от полной влагоемкости; рН 6,5.

Таким образом, полученные данные показывают, что для практически полного разложения дизельного топлива и авиационного керосина в почве достаточной и необходимой нагрузкой нефтеокисляющих бактерий является 10⁵-10⁷ клеток на грамм почвы; причем при содержании углеводородов до 10 кг/м³ эта величина составляет не менее 10⁵, до 50 кг/м³ не менее 10⁶ и от 50 до 100 кг/м³ не менее 10⁷ вносимых клеток на один грамм очищаемой почвы.

В практике проведения очистительных работ рациональнее оперировать количеством препарата и нагрузкой бактериальных клеток на единицу веса (1 г) нефтепродуктов в загрязненной почве (табл.4).

Способ очистки почвы от нефтяных загрязнений с помощью бактериальных препаратов осуществляется с предварительным проведением агрохимической характеристики рекультивируемых площадей, включающей анализ содержаний усвояемых форм азота, фосфора, калия, органического вещества (гумуса), величины рН, влажности. Исходя из полученных данных, в почву дополнительно вносят необходимые минеральные и органические удобрения, известь, а при недостатке влаги проводят полив. Эти агрохимические анализы и мероприятия должны быть проведены не только с целью создания оптимальных условий жизнедеятельности автохтонной и интродуцируемой микрофлоры, но также для последующего успешного выращивания сельскохозяйственных культур на очищаемых от нефти площадях.

Препараты в твердофазной или жидкой формах вносят, как правило, предварительно смешивая их с наполнителем плодородной (садовой) почвой или компостом. Большой объем массы полученной смеси удобнее распределить, используя для этого соответствующие сельскохозяйственные машины. Использование плодородной земли или компоста в качестве наполнителей способствует стартовому размножению бактерий препарата, увеличивая титр, что благоприятным образом сказывается на интенсивности разложения нефти и нефтепродуктов в почве.

П р и м е р 1. На поверхность почвы, площадь 1 га, содержащую 100 кг/м³ дизельного топлива или авиационного керосина, разбрасывают с помощью навозоразбрасывателя 100 т компостной смеси, содержащей 300 кг препарата "Нафтокс", приготовленного на основе стерильного торфа и содержащего 10¹¹ клеток бактерий в одном грамме. Смесь готовят отдельно, используя для этого смешивающие устройства. Рекультивируемую площадь запахивают на глубине 25-30 см. Через один месяц проводят глубокое дискование (25-35 см) и, в случае необходимости, орошают площадь таким количеством воды, чтобы влажность почвы составляла 60% от ее полной влагоемкости. После полива, через 3-5 дней, проводят боpонование; при необходимости эту операцию проводят 2-3 раза за сезон, не допуская образования корки на поверхности почвы. В том случае, если очистка почвы начата в весеннее время, в августе-сентябре высевают озимые культуры; если операция по очистке начата в летнее время, то посев производят следующей весной, предпочтительнее используя для этого кормовые травы (смесь). Степень очистки после проведения указанных мероприятий составляет за 18 сут 46,8% П р и м е р 2. 1 га рекультивируемой площади, содержащей 10 кг/м³ авиационного керосина, опрыскивают 630 л водной суспензии препарата "Нафтокс". Для этого предварительно смешивают 30 л жидкого препарата, содержащего 10¹⁰ клеток/мл, с 600 м воды; обработанную площадь запахивают на глубину 20-25 см и далее поступают как описано в примере 1. Утилизация углеводородов нефти за указанный выше срок составляет 24% П р и м е р 3. В загрязненную нефтью почву (10 кг/м³) вносят только минеральные удобрения в количестве N₈₀P₇₀ и поступают, как описано в примере 1. Степень разложения нефтяных углеводородов за 18 сут составила 12% от исходного количества.

П р и м е р 4. Загрязненную нефтепродуктами почву увлажняют до 60% полной влагоемкости, так как в примерах 1, 2, 3. Степень разложения нефтепродуктов составила лишь 3,5% Результаты приведенных примеров сведены в табл.5, из которой следует, что предлагаемый штамм Mycobacterium-5KB и разработанный на его основе биопрепарат "Нафтокс" являются эффективным средством ускоренной очистки почв от нефти и нефтепродуктов, улучшения экологической обстановки и возврата земель в сельскохозяйственное пользование.

В результате целенаправленных микробиологических исследований из образцов, отобранных в зонах многолетних антропогенных загрязнений путем селекции были отобраны штаммы микроорганизмов, использующих нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода.

Культуры микроорганизмов прошли лабораторную проверку на их способность окислять нефть и нефтепродукты, в результате которой был отображен наиболее активный штамм микобактерий 5 КВ. На основе этого штамма разработана технология получения препарата (коммерческое название "НАФТОКС") и наработаны опытные партии этого препарата в жидкой форме и на твердом органическом субстрате-носителе.

После всесторонней лабораторной проверки препарат был испытан в полевых условиях на полигоне нефтебазы "Ручьи", загрязненном легкими нефтепродуктами и смесью нефтеотходов (СНО), в количестве от 17 до 65 кг/м³ почвы.

В процессе проводимых испытаний препарата бактериальная нагрузка на очищаемую почву была постоянной (10⁷ клеток/1 г почвы); переменными были органические и минеральные компоненты, вносимые в почву одновременно с препаратом НАФТОКС.

Результаты испытаний показали, что внесение бактериальной культуры 5КВ ускоряет деградацию нефтезагрязнений. Этот процесс усиливается минеральными и особенно органическими удобрениями (органическим субстратом-носителем). За 48 сут проведения очистительных работ зафиксировано снижение уровня загрязнения на 63,5% тогда как в контрольном варианте лишь на 12% Исследования также показали, что штаммы, используемые в качестве биологической основы в препарате "Нафтокс", являются абсолютно не патогенными (заключение лаборатории микробиологии ВНИТИАФ от 20.05.91 г.). Более того, лабораторные исследования показали, что применение препарата "Нафтокс" в определенной степени способствует повышению плодородия рекультивируемых земель.

Таким образом, показана несомненная эффективность бактериального препарата "Нафтокс" и перспективность в использовании его для ускорения биологической очистки почв и грунтов от нефтяных загрязнений.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ, включающий введение бактериальной культуры в смеси с минеральным удобрением, отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют природный штамм Mycobacterium ВНИИСХМ 375А в количестве 15 · 10⁶ 15 · 10⁷ клеток на 1г нефтепродуктов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактериальную культуру вносят в почву в жидкой форме или на стерильном органическом субстрате-носителе с содержанием бактерий 10¹⁰ 10¹¹ клеток в 1 г (или 1 мл) препарата.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что почву предварительно известкуют до рН 6,0 6,5 и вносят органические удобрения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4