Способ получения антигена против некробактериоза крупного рогатого скота

 

Использование: ветеринарная микробиология, лечебно-профилактический препарат, штаммоспецифический антиген из возбудителя некробактериоза, профилактика некробактериозной инфекции. Сущность изобретения: для получения антигена предусмотрено использование местного или подобранного для каждого конкретного хозяйства штаммов возбудителя некробактериоза, которые выращивают в анаэробных условиях с целью получения микробной суспензии. Процесс культивирования заканчивают на стадии, в которой полученная культура характеризуется максимальной оптической плотностью и патогенностью для лабораторных животных (белые мыши). Антиген, извлеченный из анактивированной бактериальной массы и представляющий собой цитоплазматическую фракцию, обладает выраженной активностью в реакции непрямой иммунофлуоресцении с гомологичными сыворотками крови и с гетерологичными того же вида. Полученный антиген обладает по сравнению с полисахаридными антигенами иммуногенной активностью и вызывает невосприимчивость к заражению у 50 80% белых мышей через 14 20 дней после их иммунизации, а также предохраняет крупный рогатый скот от заражения некробактериозом в течение 6 мес после вакцинации (срок наблюдения). 2 табл.

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и касается получения антигена из возбудителя некробактериоза, который может быть использован в производстве диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Некробактериоз инфекционное заболевание крупного рогатого скота, овец, ягнят, лошадей. Пораженность стада в отдельных хозяйствах достигает 40-50 Симптоматические средства лечения не защищают животных от повторного заражения некробактериозом, в связи с чем становится очевидным актуальность проблемы получения высокоактивного антигена и использование его в составе профилактических и лечебных препаратов.

Известен способ получения вакцины для профилактики и лечения некробактериоза овец и коз, содержащей инактивированные формалином антигены из штаммов Bacteroides nodosus, F. necrophorum, Clostridium perfringens, Stapn. aureus и адъювант-фосфат кальция [1] Однако вакцина "Pietivac" обладает невысокой эффективностью.

Известен также способ получения вакцины для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота на основе инактивированного формалином эндотоксина F. necrophorum [2] К недостаткам этой вакцины относятся низкая активность взятых в качестве антигенов эндотоксинов и вследствие этого непродолжительность иммунитета.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения антигена для профилактики некробактериоза, включающий культивирование вирулентного штамма F. necrophorum, его инактивацию, отделение микробных клеток от культуральной жидкости и экстракцию антигена при механической дезинтеграции клеток (ультразвук) [3] Однако известный антиген не проявляет высоких протективных свойств.

Целью изобретения является получение активного штаммово-специфического антигена из возбудителя некробактериоза.

Для этого используется бактериальная суспензия из местных штаммов возбудителя некробактериоза с оптимальной оптической плотностью и биологической активностью. Применяются относительно щадящие методы обработки бактериальной массы (лизис, гомогенизирование), способствующие сохранению активности клеточных компонентов. В качестве антигена используется цитоплазматическая фракция, содержащая липо-, полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты, являющиеся инициаторами иммунного ответа у привитых животных.

Для осуществления способа используют местные штаммы возбудителя некробактериоза, которые по своим культурально-морфологическим, тинкториальным и биологическим свойствам не отличаются от штаммов, депонированных во Всесоюзном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов. Их выращивают для получения бактериальной массы, которую инактивируют формалином, затем осаждают центрифугированием. Полученный осадок, содержащий бактериальные клетки, разводят в дистиллированной воде в соотношении 1: 20 и подвергают лизису замораживанием оттаиванием. Лизированную бактериальную массу дополнительно подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе, затем центрифугируют. Полученный после центрифугирования осадок, содержащий клеточные оболочки, отбрасывают, а цитоплазматическую фракцию, состоящую из белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов, используют в качестве антигена.

Культуру F. necrophorum выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37^оС. Критерием качественного культивирования является показатель степени размножения (2-3 ед.) бактериальной суспензии и ее патогенность, которая выявляется внутрибрюшинным введением проб белым мышам в дозе по 0,5 мл и гибелью их через 24-48 ч.

П р и м е р 1. Для приготовления антигена производят предварительный подбор штаммов путем серологической идентификации и выявления антител против возбудителя некробактериоза в сыворотках крупного рогатого скота.

Антигенную активность штаммов и подбор их для конкретного хозяйства проводят путем взятия проб крови от 5-10 животных из неблагополучного по некробактериозу хозяйства и испытания их в реакции непрямой иммунофлуоресценции. При этом отбирают штаммы с высокой антигенной активностью (титр антител 1:640, 1:1280 и выше).

Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37^оС.

В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН.

Критериями качественного культивирования являются: увеличение количества бактериальных клеток от 1-2 млн./см³ до 10⁷ 2˙10⁷ микроб.кл./см³; содержание сырой бактериальной массы, равное 16-18 г на 1 л среды; проявление патогенной активности в полученной культуре, которая выявляется внутрибрюшинным введением проб белым мышам в дозе 0,5 мл и гибелью их через 24-48 ч.

Полученная таким образом культура позволяет получать антиген с выраженной активностью.

В бактериальную суспензию добавляют 0,3% формалина и выдерживают при 4^оС в течение 24 ч для инактивации. После контроля биологической стерильности высевами на питательные среды микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20 000 g. Для получения антигена используют осадок, который ресуспензируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20. Полученную взвесь трижды замораживают и оттаивают при температуре 50 и 37^оС, что приводит к полному лизису всех микробных клеток. Бактериальную массу дополнительно подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе в условиях охлаждения до 0^оС. В качестве антигенного после центрифугирования при 1,5 тыс. g, в течение 30 мин. Специфическая активность антигена представлена в табл. 1 и 2.

Иммуногенность антигена определяют на белых мышах подкожной вакцинацией в дозе 0,2 мл. Вакцинированных и невакцинированных (контрольных) животных через 14 дн. после иммунизации заражают титрованной культурой возбудителя в дозе 10 ЛД₅₀ гомологичного штамма в объеме 0,2 мл под кожу корня хвоста.

Как видно из табл. 1 и 2, выделенная фракция в сочетании с масляным адъювантом обладает высокой специфической и иммуногенной активностью.

Использование способа позволяет получать антиген некробактериозного возбудителя, обладающий высокой специфичностью, иммуногенной активностью, он прост в исполнении, так как не требует специального оборудования (термостатированных колонок, дезинтегратора).

Полученный таким способом антиген из различных местных штаммов возбудителя испытан с положительным результатом в ряде неблагополучных хозяйств на крупном рогатом скоте для профилактической вакцинации против некробактериоза.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, включающий культивирование вирулентного штамма Fusobacterium necrophorum, его нактивацию, отделение микробных клеток от культуральной жидкости, экстракцию антигена с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют штамм Fusobacterium necrophorum, выделенный из местного очага и вызывающий гибель мышей, при внутрибрюшинном введении через 24 48 ч, культивирование проводят до накопления 10⁷ 2 · 10⁷ микр. кл/см³, экстракцию антигена осуществляют путем последовательного трехкратного замораживания оттаивания клеток и затем гомогенизацией в водной среде, полученный гомогенат центрифугируют при 15000 20 000 g и из супернатанта выделяют целевой продукт, представляющий собой цитоплазматическую фракцию.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2