Рекомбинатная плазмидная днк ppr - tgatg - hil - 1 beta - tsr, обеспечивающая синтез рекомбинантного интерлейкина-1 и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека

 

Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, молекулярная биология и генно-инженерная биотехнология. Сущность изобретения: сконструирована методами генной инженерии рекомбинантная плазмида pPR-TGATG-hIL-Iβ-tsr, которая обеспечивает высокоэффективный синтез интерлейкина-1 бета человека в клетках E. coli под контролем регуляторной области PROR бактериофага лямбда. С помощью плазмиды pPR-TGATG-hIL-Iβ-tsr получен штамм E coli ВКПМ В-5830, продуцирующий интерлейкин-1 бета человека в количестве 5 10 мг чистого интерлейкина на 1 г влажного веса клеток, что составляет 10 12% от суммарного клеточного блока. Удельная активность выделенного интерлейкина составляет 2×10⁸ международных единиц интерлейкина-1 бета на 1 мг очищенного препарата. 2 с.п.ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую микробиологический синтез рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека и штамм E.coli, содержащий эту рекомбинантную плазмиду, продуцент интерлейкина-1 бета.

Цитокины (интерлейкины, см. ниже) это достаточно большая группа веществ, представленная в основном гликопептидами с Mw 15-20 КД, которые продуцируются различными клетками организмов высших млекопитающих, в том числе и человека, и действуют на реакции иммунной системы (Sporn and Roberts, 1991). Цитокины можно разделить на две большие группы лимфокины (синтезируются лимфоцитами) и монокины (синтезируются моноцитами). Кроме того, существует термин "интерлейкин", который присваивается только наиболее изученным с молекулярной и биологической точки зрения цитокинам.

К настоящему времени выделены и всесторонне охарактеризованы 11 интерлейкинов.

Предпринятые широкие исследования интерлейкинов позволили показать существование в организме новой системы регуляции иммунных и воспалительных реакций организма, в которой интерлейкины играют роль медиаторов. Выяснилось также, что синтез интерлейкинов происходит лишь в ответ на стимул и манифестирует начало ответной реакции иммунокомпетентных клеток. Интерлейкины обладают широким спектром активностей. Они являются стимуляторами лимфоцитов, тем самым обеспечивают необходимый уровень иммунитета, способствуют развитию температурной реакции организма, активируют синтез острофазовых белков (С-реактивный белок и др.), привлекают в область поражения клетки воспаления, стимулируют образование кроветворных элементов, принимают участие в обновлении костной и хрящевой тканей, обеспечивают защиту организма от опухолевых клеток, опосредуют реакции центральной и периферической нервной систем и многие другие функции.

При старении организма, инфекционных и злокачественных заболеваниях и других патологических процессах происходит нарушение интерлейкиновой регуляции, что приводит к резкому снижению защитных реакций. Так например, при СПИДе полностью отсутствует интерлейкин-2, а при ожоговой болезни снижается синтез ряда интерлейкинов, такая же картина наблюдается при анемиях и лейкопениях. С другой стороны, многие аутоиммунные заболевания, аллергические состояния характеризуются повышенной продукцией интерлейкинов. К ним прежде всего относятся заболевания щитовидной железы, артриты, вирусные и бактериальные менингиты и другие. В ряде клинических и экспериментальных исследований было показано, что экзогенное введение интерлейкинов способствует защите организма от радиации, инфекции (в тех случаях когда антибиотики оказываются неэффективными), септического шока и других состояниях.

По крайней мере некоторые из интерлейкинов (в частности, hIL-1beta и hIL-1alpha) оказывают на организмы млекопитающих ярко выраженное протекторное действие от радиоактивного излучения. В настоящее время этот эффект неоднократно продемонстpирован за рубежом и в нашей стране, разрабатываются медицинские аспекты его применения.

Большое значение интерлейкины имеют при пересадке костного мозга.

К настоящему времени показана возможность эффективного применения интерлейкинов для диагностики и лечения ряда заболеваний. Однако единственным источником получения этих веществ в препаративных количествах, необходимых для их применения в медицине, являются искусственно созданные бактериальные штаммы-продуценты рекомбинантных интерлейкинов.

Получены генно-инженерные продуценты интерлейкинов-2 (см. в частности, Дебабов и др. 1987), -3, -4, фактора некроза опухолей. Готовятся к выпуску интерлейкин-2 и фактор некроза опухоли. Проходят испытания на безвредность колоние-стимулирующие факторы.

Как правило, образующийся в результате микробиологического синтеза рекомбинантный интерлейкин характеризуется наличием дополнительного остатка метионина. В случае отщепления N-концевого метионина рекомбинантного полипептида N-терминальной аминопептидазой бактериальной клетки интерлейкин, синтезируемый микробиологическим способом, может быть использован как для фундаментальных исследований молекулярных механизмов взаимодействия с клеточными рецепторами, так и в практической медицине.

Аналогами предлагаемого изобретения можно считать штаммы E. coli [pLNIL1beta] (Kronheim et al. 1986); E.coli [pILPbeta] (March et.al. 1985); E. coli W3110 [P_L-Mu IL-1beta] (Wingfield et al. 1986) продуценты рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека и содержащиеся в соответствующих бактериальных клетках рекомбинантные плазмиды, обозначения которых приведены в квадратных скобках в названии рекомбинантного штамма. В составе указанных плазмид структурная часть гена интерлейкина-1 бета человека находится под транскрипционным контролем раннего промотора бактериофага лямбда (p_L), а инициация трансляции соответствующего белкового продукта осуществляется в результате взаимодействия рибосом с гибридным участком, включающим каноническую химически синтезированную SD-последовательность (Kronheim et al. 1986), либо SD-последовательность гена бета-галактозидазы E.coli (March et al. 1985), либо SD-последовательность гена ner бактериофага Mu (Wingfield et al. 1986). Гибридный участок содержит также химически синтезированный ATG-кодон, расположенный в результате генно-инженерного конструирования непосредственно перед первым аминокислотным кодоном зрелого интерлейкина-1 бета человека Ala¹¹⁷, образующегося в условиях in vivo результате посттрансляционного процессинга пре-проинтерлейкина-1 бета человека.

Максимальный выход целевого продукта был зарегистрирован Кронхеймом и соавт. (Kronheim et al. 1986) в том случае, когда в условиях термоиндукции при 42^оС рекомбинантные клетки E.coli продолжали биосинтез интерлейкина-1 бета в течение 15-20 ч. При этом доля образующегося целевого полипептида достигла 30% от суммарных клеточных белков, но весь интерлейкин-1 бета был локализован во фракции нерастворимых клеточных полипептидов, что значительно затрудняло последующее выделение целевого продукта способами, пригодными для приготовления препаратов для медицины (в частности, использовались ионные детегенты типа SDS и/или гуанидингидрохлорид) (Kane and Hartley, 1988).

Из всех аналогов прототипом можно считать штамм, описанный Kikumoto et al. 1987. Он является наиболее близким по техническому решению к предлагаемому штамму синтезирует до 10-12% интерлейкина от суммарных белков бактериальной клетки, интерлейкин-1 бета входит в состав водорастворимой фракции клеточных белков. Однако детальный анализ выделенного рекомбинантного продукта показывает наличие в его составе 20% непроцессированных белковых молекул, содержащих N-концевой остаток Met, не присутствующий у природных молекул интерлейкина-1 бета, что может приводить к некоторым нежелательным последствиям медицинского применения целевого белка.

Целью представленной группы изобретений является получение штамма-продуцента интерлейкина-1 бета человека, позволяющего обеспечить высокий выход интерлейкина-1 бета, неотличимого по структуре от природного, и получить препарат, не содержащий примесей, пригодный для медицинских целей.

Цель достигается конструированием новой рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr с регулируемой копийностью (фиг.1), которая обеспечивает экспрессию гена hIL-1beta под контролем регуляторной области p_Ro_R бактериофага лямбда, имеет длину 7,3х10³ н.п. состоит из большого (6,6х10³ н.п.) EcoRI-SalGI фрагмента векторной плазмиды pPR53-tsr (Mashko et al. 1991) и малого (0,7х10³ н. п. ) EcoRI-SalGI фрагмента плазмиды pPR-TGATG-hIL-beta (Mashko et al. 1991) и характеризуется следующими признаками: содержит участок, ответственный за инициацию репликации и ее регуляцию (ori pSC101), а также генетический локус, обеспечивающий стабильное наследование и правильное распределение малокопийной плазмиды между дочерними клетками при делении бактерии (par pSC101) из исходной векторной плазмиды pSC101 (Bernardi and Bernardi, 1984); участок, ответственный за репликацию плазмиды ColE1, в котором промотор праймерной РНК-РНК II (Davison, 1984) в результате олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза (Kunkel, 1985) заменен на промотор p_L бактериофага лямбда (Sanger et al. 1982), что делает репликацию и тем самым увеличение копий образованной рекомбинантной плазмиды, зависящей от условий депрессии указанного фагового промотора; ген термочувствительного репрессора (cIts857) фага лямбда; ген устойчивости к ампициллину (Ap^R) плазмиды pBR322 (Sutcliffe, 1979); тандем ро-независимых терминаторов транскрипции фага fd (ter_fd); промотор p_R фага лямбда, участки инициации трансляции и первые аминокислотные кодоны (22 и 72, соответственно) генов cro (cro') фага лямбда и cat (cat') транспозона Tn9 E.coli, а также фрагмент клонированный ранее кДНК (Котенко и др. 1989), кодирующий последовательность зрелого интерлейкина-1 бета человека (hIL-1beta) и модифицированный в результате сайт-специфического мутагенеза таким образом, что перед первым аминокислотным кодоном зрелого интерлейкина Ala¹¹⁷ во вновь образованном структурном гене был расположен дополнительный метиониновый, ATG, кодон, которому предшествовал фрагмент межцистронной области генов trpE-trpD E.coli (ON): ._->3', где жирным шрифтом выделен дополнительный инициирующий формилметиониновый кодон, ATG, а подчеркнут кодон Ala¹¹⁷ структурной части зрелого интерлейкина-1 бета человека; соединение модифицированного таким образом гена hIL-1 beta с кодирующей частью генов cro'-cat' было осуществлено таким образом, что в результате в полученной плазмиде под контролем промотора p_R оказался гибридный оперон, в котором дистальным к промотору геном является структурная часть hIL-1beta, а проксимальным открытая трансляционная рамка считывания гибридного гена cro'-cat'-ON, перекрывающаяся своим терминирующим кодоном, TGA, с инициирующим, ATG, кодоном интерлейкина-1 бета, как это имеет место в природной межцистронной области генов trpE-trpD E.coli, а терминация транскрипции мРНК образованного гибридного оперона с частично перекрывающимися цистронами осуществляется на тандеме терминаторов транскрипции фага fd; при этом в результате конструирования перед структурным геном hIL-1beta, и тем самым в кодирующей части гибридного цистрона cro'-cat'-ON, образован участок связывания рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность: 5'-.AGGAGACTTTCTGATG.->3', где AGGAG-SD последовательность гена trpD e.coli; плазмида имеет уникальные участки узнавания рестриктаз EcoRI, координата которого выбрана за точку отсчета (1) на фиг.1, SalGI (969), KpnI (3862), PstI (5278), два сайта расщепления рестриктазой BamHI (534, 979).

Цель достигается также созданием штамма E.coli C600 [pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr] (регистрационный номер во Всесоюзной коллекции культур промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ВКПМ В-5830) продуцента рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека, синтезирующего до 10-12% интерлейкина от суммарных белков бактериальной клетки через 2-3 ч после переноса бактерий, растущих на питательной среде при 28^оС, на температуру 42^оС. При этом весь синтезируемый новым штаммом интерлейкин локализован в водорастворимой фракции клеточных белков, что позволяет упростить процедуру выделения интерлейкина и получить препарат интерлейкина с удельной активностью 2х10⁸ МЕ/мг белка, пригодный для медицинских целей.

Полученный в результате выделения целевой полипептид имеет на N-конце следующую аминокислотную последовательность: 80% молекул Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-.

и 20% молекул Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-.

Данная гетерогенность рекомбинантных полипептидов по N-концу соответствует природной гетерогенности молекул интерлейкина-1 бета, выделяемых из природных источников (Kikumoto et al. 1987; Tocci et al. 1987). В выделяемых из экстрактов растворимых белков штамма-продуцента препаратах рекомбинантного интерлейкина-1 бета высокочувствительными методами определения белковой первичной структуры не обнаружено молекул с дополнительным N-концевым метионином, синтезируемым в качестве предшественника зрелого интерлейкина-1 бета в бактериальной клетке и детерминированного созданной структурой экспрессирующегося модифицированного гена hIL-1beta. Таким образом, структура получаемого рекомбинантного полипептида была идентична его природному аналогу.

Штамм получают трансформацией реципиентного штамма E.coli С600 (F^-, thi, thr, leuB6, supE44, lacY1, tonA21) рекомбинантной плазмидой pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при 28^оС и определением активности рекомбинантного интерлейкина-1 бета в экстрактах клеток трансформантов после депрессии p_R-промотора, достигаемой культивированием штамма в течение 2-3 ч при 42^оС. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы E.coli ВНИИгенетика VL902, E.coli ВНИИгенетика VL903 (Дебабов и др. 1987) и другие производные E.coli К12, а также E.coli BL21 (Maniatis et al. 1989) и другие производные E.coli В.

Штамм E.coli ВКПМ В-5830 характеризуется следующими признаками: 1. Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы (1,2-1,3)х(2,0-6,0) мкм, слабоподвижные, способные к образованию нитевидных форм, грамотрицательные, неспороносные.

2. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера или L-бульоне образуют ослизненные, круглые, слабоматовые колонии. При выращивании в жидких средах типа L-бульона или М9 с казаминовыми кислотами образуют равномерную взвесь.

3. Физиолого-биохимические признаки. Клетки способны к росту в диапазоне температур от 5 до 35^оС (оптимум 32^оС) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют аминокислоты и углеводы (например, глюкозу). Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта и аминокислот.

4. Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.

5. Устойчивость к бактериофагам. Плазмидный штамм при культивировании в условиях пониженной температуры (28-32^оС) устойчив к заражению фагом лямбда с операторными участками o_L и o_R дикого типа вследствие наличия в составе плазмиды гена-репрессора cIts857.

6. Штамм содержит рекомбинантную плазмиду pPR-TGATG-hIL-beta-tsr с регулируемой копийностью и продуцирует интерлейкин-1 бета человека.

7. Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до 1 месяца), при серии последовательных пересевов (в течениe не менее 6 месяцев) и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком, а также без него при температуре 28^оС не происходит потери и перестройки малокопийной (5-7 копий на геномный эквивалент) плазмиды, что обусловлено наличием и функционированием в составе плазмиды малокопийного репликона и генетического локуса par плазмиды pSC101. При росте клеток в условиях термоиндукции (при температуре 42^оС) и вследствие этого транскрипции праймерной РНК I мутантного репликона ColE1 осуществляется неконтролируемый рост копийности плазмиды до 120-150 копий на геномный эквивалент через 2-3 часа культивирования (Mashko et al. 1991) и вследствие этого лизис бактериальных клеток через 6-8 часов.

Отличия предлагаемых технических решений заключаются в следующем. Структурная часть гена интерлейкина-1 бета человека входит в состав гибридного оперона, экспрессия генов которого контролируется регуляторной областью p_Ro_R бактериофага лямбда. Данный оперон располагается в составе рекомбинантной ДНК бирепликонной плазмиды, репликация которой при температуре 28^оС осуществляется под контролем репликона pSC101, а при повышении температуры под контролем мутантного репликона ColE1-типа, в котором синтез праймерной РНК происходит под контролем промоторнооператорной регуляторной области p_Lo_L бактериофага лямбда. Наличие в составе той же рекомбинантной плазмиды гена-регулятора cIts857 позволяет осуществлять экспрессию цистронов гибридного оперона и одновременно амплификацию плазмиды после накопления бактериальной биомассы повышением температуры культивирования клеток с 28-32 до 42-45^оС. Поскольку за время 2-3 ч термоиндукции происходит значительное увеличение копийности рекомбинантной плазмиды одновременно с эффективной транскрипцией и трансляцией целевого продукта, то следствием этого является быстрое накопление значительных количеств рекомбинантного интерлейкина-1 бета, в то же время недостаточных для его агрегации и локализации во фракции нерастворимых клеточных белков. Использование описанного штамма-продуцента позволяет получать препарат рекомбинантного интерлейкина-1 бета, не содержащего молекул с дополнительным остатком метионина на N-конце, не обладающих биологической активностью (Kikumoto et al. 1987) и способных вызывать нежелательные аутоиммунные реакции при медицинском использовании препарата. Это обстоятельство выгодно отличает описанный вариант бактериального продуцента от штамма-прототипа (Kikumoto et al. 1987).

Указанное отличие от прототипа позволяет обеспечить стабильное накопление целевого продукта с биологической активностью 2х10⁸ МЕ/мг белка, не отличимого по своим биологическим и физико-химическим свойствам от своего природного аналога, в условиях крупномасштабного культивирования и позволяет получить препарат, пригодный для медицинских целей.

Процесс биосинтеза интерлейкина-1 бета человека включает стадии получения посевного материала, основную ферментацию и выделение биомассы используемой в качестве источника интерлейкина. Выращивание посевного материала и основную ферментацию E.coli ВКПМ В-5830 осуществляют в аэробных условиях на традиционно используемых для культивирования E.coli питательных средах, содержащих ассимилируемые источники углерода, азота, минеральные соли, стимуляторы роста, например, в виде триптона, дрожжевых автолизатов или экстрактов. В питательные среды вносят ампициллин в концентрации 100 мг/л.

Биомассу выращивают при рН 6,75-6,9 и температуре 28^оС до концентрации, определяемой составом питательной среды и массообменными характеристиками ферментера. Затем температуру в ферментере повышают до 42^оС и продолжают процесс на протяжении 2-3 ч. За это время синтезируется до 10-12% интерлейкина-1 бета от суммарных клеточных белков.

После завершения процесса ферментации бактериальные клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием и ресуспендируют в соответствующем буферном растворе, после чего разрушают с помощью ультразвуковой обработки или другими известным способом. Разрушенные клетки подвергают центрифугированию и используют водорастворимую фракцию для последующего выделения целевого продукта. Для этого проводят подкисление водорастворимой клеточной фракции до рН 4,0 и две стадии гидрофобной хроматографии на фенильных сорбентах, фенил-Сефарозе CL4В и фенил-Суперозе-12. Уже на первой стадии при подкислении водорастворимой фракции разрушенных клеток до рН 4,0 95% IL-1beta оставалось в супернатанте, тогда как большинство бактериальных белков и нуклеиновых кислот удалялось при центрифугировании. Данная процедура при высоком выходе целевого белка позволяла обеспечить его 80%-ную чистоту. Две последующие хроматографии на гидрофобных сорбентах сначала при нейтральных, а затем кислых значениях рН позволили получить электрофоретически чистый препарат с удельной активностью около 2х10⁸МЕ/мг, что хорошо коррелировало с известными данными, полученными для выделенного из природных источников hIL-1beta (Tocci et al. 1987). Чистота препаратов hIL-1beta в процессе выделения анализировалась с помощью SDS-PAGE (фиг.2). Выделенный белок элюировался в виде гомогенного пика при HPLC-хроматографии на колонке Pro RPC ("Pharmacia") при рН 2,0 в градиенте ацетонитрила. Использованный метод выделения обеспечивал 60%-ный выход целевого белка, что составляло 5-10 мг интерлейкина-1 бета из 1 г влажной биомассы. Определение N-концевой последовательности полученного белка проводили методом Эдмана на автоматическом сиквенаторе "Beckman-890".

Определение биологической активности рекомбинантного интерлейкина-1 бета проводилось по его комитогенному действию на пролиферацию мышиных тимоцитов в стандартном тесте (Mizel and Mizel, 1981; Rosenwasser et al. 1986) с некоторыми модификациями, как описано ранее (Котенко и др. 1989). За одну единицу биологической активности интерлейкина-1 бета принималась доза препарата, обеспечивающая 50% от максимальной пролиферации мышиных тимоцитов в стандартных тест-системах, как подробно описано в лабораторных протоколах (Mizel, 1979).

Изобретение иллюстрируется фиг.1-3.

На фиг. 1 показана физико-генетическая карта рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr. Рекомбинантная плазмида сконструирована с использованием следующих фрагментов ДНК: (1) TaqI-BglII-фрагмент, несущий ген cIts857 фага лямбда, p_R и p_RM промоторы и 20 N-кoнцевых кодонов гена cro, cro', (от 37165 до 38100 н.п. ДНК фага лямбда; Sanger et al. 1982); (2) кодирующий участок гена cat из pBR325 (775 н.п. фрагмент TaqI; Bolivar, 1978), фланкированный двумя сайтами BamHI, аналогично соответствующему гену в плазмиде рСМ4 (Close и Rodriguez; 1982); (3) фрагмент BamHI-SalI плазмиды pPR-TGATG-1 (прибл. 420 н.п.) (Mashko et al. 1990); SalI-KpnI фрагмент ДНК, несущий HindII фрагмент плазмиды pSC101 (4521-7449 н.п. на кольцевой карте pSC101; Bernardi и Bernardi, 1984), содержащий ori- и par участки (данный фрагмент ДНК был предварительно интегрирован в SmaI-сайт, расположенный в составе полилинкера плазмиды pUC18 (Yanish-Perron et al. 1985); (4) ClaI-SalI фpагмент (прибл. 2100 н.п.) плазмиды pPR-TGATG-1 (Mashko et al. 1990), несущий ген устойчивости к ампициллину и генетический локус ColE1-подобной плазмиды, обеспечивающий репликацию ДНК, в котором промотор праймерной РНК (PHKII, Davison, 1984) (3087-3205 н.п. на кольцевой карте плазмиды pBR322, Sutcliffe, 1979) заменен на фрагмент ДНК, содержащий p_L-промотор фага лямбда и локус nutL (положение 35,653-32,513 в ДНК фага лямбда, (Sanger et al. 1982), а также фланкирующий этот фрагмент ДНК SalI сайт заменен на сайт KpnI с помощью соответствующего линкера.

На фиг. 2 показаны электрофореграммы клеточных белков в 0,1% SDS 12,5% ПААГ, получаемых в ходе очистки hIL-1beta из клеток E.coli С600 [pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr] Образцы кипятили 15 мин в буфере для нанесения образцов (60 мМ Трис-HCl рН 6,8) (2,3% SDS) 10% глицерин (5% 2-меркаптоэтанол) и полученные надосадочные жидкости анализировали согласно Laemmli (1970). Полосы белка проявляли путем прокрашивания в Кумасси синем. 1. Белковые маркеры (набор маркеров для белкового электрофореза, Pharmacia) с мол.весами 94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кДа; 2. Суммарные белки клеток продуцента после термоиндукции в течение 2 ч; 3. Надосадочная жидкость, содержащая водорастворимые клеточные белки, подкисленная до рН 4,0; рекомбинантный hlL-1beta, полученный после двух стадий хроматографической очистки на фенильных сорбентах.

На фиг. 3 показана схема конструирования плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta, кДНК гена hIL-1beta, которая была клонирована в составе вектора лямбда gt10 с использованием EcoRI линкеров и в последующем переклонирована на фаг M13tg130 (Kieny и др. 1983) с образованием фагов M13tg130-IL-1beta-3' и М13tg130-IL-1beta-5' (Котенко и др. 1989). В ДНК первого из полученных фагов клонированный ген был расположен между сайтами EcoRI и AccI, после чего участок расщепления AccI был затем заменен на сайт BamHI c использованием соответствующих линкеров. ДНК фага М13tg130-IL-1beta-5' содержала EcoRI-HindIII фрагмент кДНК, соответствующий 5'-концевому участку hIL-1beta. Полученная таким образом ДНК была в дальнейшем подвергнута сайтспецифическому мутагенезу: PstI сайт был встроен непосредственно перед GCA кодоном аминокислоты Ala¹¹⁷ и из полученной рекомбинантной фаговой ДНК SacI-HindIII фрагмент кДНК был переклонирован в полученную ранее ДНК фага M13tg131-ON (Mashko et al. 1990). GCA кодон аминокислоты Ala¹¹⁷ был состыкован с ATG кодоном межцистронного участка trpE-trpD E.coli, находящемся на фаге M13tg131-ON, с помощью гидролиза ДНК рестриктазами SacI и PstI, удалением образующихся одноцепочечных 3'-концевых олигонуклеотидов с помощью Кленовского фрагмента А ДНК полимеразы I E.coli и рециклизации рекомбинантной молекулы ДНК ДНК-лигазой фага Т4. Полученная рекомбинантная молекула ДНК была обозначена как M13tg131-ON-IL-1beta-5'. EcoRI-HindIII-фрагмент фага M13tg131-ON-IL-1beta-5' и HindIII-BamHI-фрагмент фага M13tg130-IL-1beta-3' использовались как 5'- и 3'-концевые фрагменты гена hIL-1beta, включенного в экспрессионный вектор pPR-TGATG-1 (Mashko et al. 1990) с целью получения плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta. Эндонуклеазы рестрикции. ДНК-лигаза фага Т4 и Кленовский фрагмент ДНК полимеразы I E. coli являлись коммерческими препаратами Научно-производственной ассоциации "Fermentas", Вильнюс, Литва. Методы энзиматической обработки ДНК, выделения плазмид, электрофореза ДНК в агарозном и полиакриламидном гелях проводились как описано Maniatis et al, 1982. Обозначения AI, BI, EI, HIII, PI, ScI, SlI оносятся к сайтам рестрикции AccI, BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SacI и SalI, соответственно; cI ген, кодирующий репрессор cIts857 фага лямбда; ON синтетический олигонуклеотид (Mashko et al. 1990), включающий межцистронный участок trpE-trpD E.coli; p_lac промотор лактозного оперона E.coli на векторе фагов серии М13, p_RM промотор фага лямбда, обеспечивающий экспрессию гена cI; t_fd терминатор транскрипции фага fd.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr.

Для решения поставленной задачи в качестве исходных использовались препараты ДНК: 1) рекомбинантного бактериофага M13tg130-IL-1beta, полученного ранее (Котенко и др. 1989) на основе вектора M13tg130 (Kieny et al. 1983) путем клонирования кДНК гена hIL-1beta между участками расщепления EcoRI и AccI;
2) фага M13tg130-IL-1beta-5', в котором 5'-концевой фрагмент гена hIL-1beta интегрирован в состав вектора M13tg130 после гидролиза ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII;
3) фага M13tg131-ON (Mashko et al. 1990), в котором химически синтезированный олигонуклеотид с межцистронной областью генов trpE-trpD E.coli расположен в полилинкерном участке фага M13tg131 (Kieny et al. 1983) между участками EcoRI и SacI. При этом в области перекрывания кодонов TGATG 3'-концевой остаток "G" является первым из последовательности, узнаваемой SacI (GAGCT'C);
4) экспрессионного вектора плазмиды pPR-TGATG-1 (Mashko et al. 1990);
5) бирепликонного вектора с терморегулируемой копийностью плазмиды pPR53-tsr (Mashko et al. 1991).

Конструирование целевой плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr осуществляют в два этапа: первый состоит в конструировании промежуточной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta, а второй состоит из введения EcoRI-SalGI фрагмента полученной плазмиды, содержащей структурный ген зрелого интерлейкина-1 бета, модифицированный для экспрессии методом конструирования гибридных оперонов с частично перекрывающимися генами (Mashko et al. 1990), в состав вектора pPR53-tsr взамен С-концевой области гена cat.

Схема конструирования рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-IL-1beta включает в себя следующие этапы (фиг.3).

Модификацию фага M13tg130-IL-1beta заменой участка расщепления PstI из полилинкера исходного векторного фага на сайт узнавания BamHI. Для этого рекомбинантную ДНК расщепляют PstI, образующиеся 3'-однонитевые концы удаляют с использованием ДНК-полимеразы I E. coli, присоединяют BamHI-линкеры ("Pharmacia") и после гидролиза ДНК BamHI и циклизации молекул ДНК-лигазой Т4, отбирают рекомбинанты, имеющие соответствующий участок узнавания рестриктазой. Таким образом в составе ДНК фага M13tg130-IL-1beta-3' уникальный участок гидролиза BamHI оказывается в 3'-нетранслируемой области гена hIL-1beta.

Далее проводят сайт-специфический мутагенез фага M13tg130-IL-1beta-5', в результате которого перед первым кодоном биологически активного белкового продукта гена hIL-1beta, Ala¹¹⁷, образуется участок узнавания PstI. Мутагенез проводят по стандартной методике (Maniatis et al. 1989), при этом используют синтезированный твердофазным фосфитамидным методом олигонуклеотид:
5'-d(ATCGTACAGGTGCTGCAGCACATAAGCCTC).

Структуру рекомбинантных бактериофагов, отобранных гибридизацией in situ с меченным по [³²P] олигонуклеотидом, определяют по методу Сенгера (Sanger et al. 1977). ДНК нескольких таких фагов, в точном соответствии с планом эксперимента, содержат уникальный участок расщепления PstI перед первым аминокислотным кодоном биологически активного интерлейкина. При этом последний "G" из последовательности, узнаваемой PstI (CTGCA'G), является одновременно первым нуклеотидом N-концевого Ala¹¹⁷-кодона (GCA) целевого белка. Один из таких рекомбинантов, обозначенный M13tg130-IL-1beta-5'M, используют в дальнейших экспериментах.

SacI-HindIII фрагмент ДНК бактериофага N13tg130-IL-1beta-5'M, содержащий 5'-концевую область гена hIL-1beta с введенным с помощью мутагенеза сайтом расщепления PstI, был интегрирован в состав ДНК фага M13tg131-ON, из ДНК которого с помощью обработки ДНК-полимеразой I E.coli был предварительно удален участок расщепления PstI, расположенный в полилинкере исходного фагового генома. Интеграцию осуществляют при расщеплении измененной ДНК M13tg131-ON, рестриктазами SacI+ + HindIII, как схематически показано на фиг.3. Необходимое соединение ATG-кодона гена trpD, расположенного в составе химически синтезированного ранее (Mashko et al. 1990) олигонуклеотида, и первого кодона интерлейкина-1 проводят после обработки полученной рекомбинантной ДНК рестриктазами SacI и PstI, удаления одноцепочечных концов ДНК-полимеразой I и циклизации молекул ДНК-лигазой. Полученные таким образом бактериофаги подвергают непосредственному определению первичной структуры и ДНК одного из целевых вариантов (M13tg131-IL-1beta-5') используют на следующей стадии в качестве донора 5'-концевого фрагмента гена hiL-1beta.

На последнем этапе конструирования pPR-TGATG-hIL-1beta в состав плазмиды pPR-TGATG-1 интегрируют кодирующую часть зрелого интерлейкина-1 бета с расположенной на ее 5'-конце синтетической последовательностью межцистронной области trpE-trpD E.coli. В качестве донора гена hIL-1beta при этом используют EcoRI-HindIII фрагмент фага M13tg131-IL-1beta-5' (5'-концевой фрагмент цистрона) и HindIII-BamHi-фрагмент ДНК M13tg130-IL-1beta-3' (3'-концевая область гена). Интеграцию полноразмерного гена осуществляют после расщепления ДНК вектора рестриктазами EcoRI + BamHI.

На заключительном этапе сборки целевой рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr описанную выше плазмиду pPR-TGATG-hIL-1beta используют в качестве донора гена hIL-1beta для клонирования в вектор pPR53-tsr (Mashko et al. 1991), как описано выше.

П р и м е р 2. Получение штамма E.coli ВКПМ В-5830 продуцента рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека.

Плазмиду pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr, обеспечивающую синтез рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека, трансформацией (см. Maniatis et al. 1989) вводят в клетки штамма E.coli С600. Эффективность трансформации клеток E.coli С600 составляет около 10⁶ клонов на 1 мкг нативной ДНК плазмиды. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) после культивирования клеток в течение суток при 28^оС. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату ДНК pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм E.coli ВКПМ В-5830 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

П р и м е р 3. Определение продуктивности штамма E.coli ВКПМ В-5830 продуцента рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека.

Для определения продуктивности штамма E.coli ВКПМ В-5830 плазмидосодержащие клетки выращивают при 28^оС на скошенной агаризованной стандартной среде Хоттингера или на L-бульоне, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл с 75 мл среды Хоттингера, содержащей 5 г/л глюкозы и 100 мг/л ампициллина. Культуру выращивают на качалке при интенсивном перемешивании при температуре 28^оС в течение 6-8 ч до плотности посевной культуры 2-3 оптические единицы при А₅₄₀.

Ферментацию проводят в ферментере объемом 2 л, оснащенном системами измерения и регулирования температуры, рН, парциального давления кислорода, скорости вращения мешалки и подачи воздуха для аэрации. В ферментер со стерильной питательной средой вносят посевной материал в количестве 5-7,5% и проводят ферментацию при интенсивном перемешивании и аэрации, начальной температуре 28^оС, рН 6,7-6,9, который стабилизируют с помощью 8% раствора аммиака. Парциальное давление растворенного кислорода поддерживают на уpовне 25-30% путем регулирования скорости вращения мешалки и расхода воздуха в диапазоне 0,5-1,5 объема на объем культуральной жидкости в минуту.

Для выращивания культуры используют питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза 20,0, MgSO₄ x 7H₂O, CaCl₂ 0,01, NaCl 1,0, бульон Хоттингера до 1 л. Исходный рН среды 6,75-7,0.

После внесения посевного материала процесс ферментации ведут при 28^оС и, когда оптическая плотность клеточной суспензии при А₅₄₀достигает 10 оптических единиц, температуру повышают до 42^оС и продолжают пpоцесс еще в течение 2-3 ч.

После завершения ферментации биомассу выделяют центрифугированием из предварительно охлажденной до 12^оС культуральной жидкости и используют для получения интерлейкина-1 бета. Собранные центрифугированием клетки разрушают кипячением 2-3 мин в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащим 1% додецилсульфата натрия из расчета 1 г биомассы на 10 мл буфера. Осадок отделяют центрифугированием, супернатант разводят не менее чем в 1000 раз 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,2, содеpжащим 2%-ный бычий сывороточный альбумин, и подвергают количественному анализу на биологическую активность, а также анализируют методом электрофореза в SDS-PAAG. Продуктивность штамма составляет не менее 10-12% рекомбинантного интерлейкина-1 бета от суммарных бактериальных белков, а в пересчете биологической активности на мг препарата выделенного интерлейкина удельная активность составляет 2х10⁸ МЕ. При выделении целевого продукта выход его составляет 60% при этом указанная удельная активность обеспечивает выход 5-10 мг чистого интерлейкина на 1 г влажного веса клеток.

П р и м е р 4. Определение биологической активности рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека.

Определение биологической активности рекомбинантного интерлейкина-1 бета проводят по его комитогенному действию на пролиферацию мышиных тимоцитов в стандартном тесте (Mizel S. 1981; Rosenwasser L. 1981) с некоторыми модификациями. Для каждого эксперимента готовят три параллельные культуры мышиных тимоцитов С57BLxCBACF1 в концентрации 5х10⁶ клеток и инкубируют в присутствие образцов интерлейкина в различных концентрациях в течение 72 часов в атмосфере 5% СО₂ в планшетах для иммунологических исследований. Объем инкубационной смеси составляет 2 мл. Смесь содержит среду Игла с добавлением 1% термоинактивиpованного альбумина человека, 2 мМ L-глутамина, гентамицина в концентpации 80 мкг/м. Полимиксина В в концентpации 5 мкг/мл и конканавалина А в концентpации 0,5 мкг/мл.

В течение последних 16 ч культивирования клетки инкубируют с ³Н-тимидином в концентрации 5 мкKи/мл.

Клетки переносят на фильтp из стекловолокна с помощью клеточного харвестера Titertek. Каждый фильтр помещают в пробирку, содержащую 5 мл сцинтилляционной жидкости и включение ³Н-тимидиновой метки определяют в жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack Beta 1719 (LKB).

За одну единицу биологической активности интерлейкина-1 бета принимают ту концентрацию интерлейкина-1 бета, которая обеспечивает 50% увеличение (от максимально возможного) пролиферации мышиных тимоцитов для данной тест-системы. В пересчете на мг препарата выделенного интерлейкина активность составляет 2х10⁸ МЕ.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPr-TGATG-hIL-1beta-tsr, обеспечивающая синтез рекомбинантного интерлейкина-1 длиной 7,3 х 10³ н.п. и содержащая большой EcoRI SalGI фрагмент векторной плазмида pPR 53-tsr размером 6,6 х 10³ н.п. малый E corI SalGI фрагмент плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta размером 0,7 х 10³ н.п. oripSC101 участок, ответственный за инициацию репликации p SC101 и ассоцированный с ним локус par; мутантный участок, ответственный за репликацию плазмиды Col E1, в котором промотором праймерной РНК является регуляторная область P_LO_L бактериофага лямбда; cIts857 - ген термочувствительного репрессора фага лямбда; terfd тандем fo-независимых терминаторов транскрипции фага fd; промоторно-операторная область tP_RO_R фага лямбда, участки инициации трансляции и первые аминокислотные кодоны 22 и 72 соответственно, генов cro(croʹ) фага лямбда и cat(catʹ) транспозона Tn9 E.coli; гибридный оперон, состоящий из цистрона croʹ-catʹ, частично перекрывающийся с геном, кодирующим зрелый интерлейкин-1 бета человека, имеющим дополнительный N-концевой Met кодон перед первым кодоном, соответствующим Ala препроинтерлейкина; искусственно созданную структуру межцистронной области с перекрывающимся терминирующим и инициирующим кодонами проксимального и дистального к промотору генов, обеспечивающую трансляционное сопряжение генов гибридного оперона; 5ʹ-AATTCGAACAGGAGACTTTCTGATG...-3ʹ; уникальные сайты регистрикции: E coR, координата которого выбрана за точку отсчета 1, Sal G I 969, KpnI - 3863, Pst I 5278, два сайта расщеплений рестриктой Bam HI 534, 979.

2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5830 продуцент рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека.