Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных

 

Использование: биотехнология, сухая живая вакцина против листериоза сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: при получении бактериальной массы листерий используют питательную среду на основе перевара Хоттингера. В питательную среду входят перевар Хоттингера, пептон, натрий фосфорнокислый двузамещенный, дрожжевой экстракт. Глубинное культивирование проводят в течение 7 - 9 ч со снижением окислительно-восстановительного потенциала среды после засева, поддержанием парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода и дозированной подачей глюкозы при лимитировании роста листерий глюкозой. Использование данной питательной среды и режима культивирования листерий позволяет удешевить вакцину и повысить накопление жизнеспособных бактерий со стабильными биологическими своствами. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве сухой живой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения живой бивалентной вакцины против листериоза овец и коз.

Существующий способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных обладает рядом недостатков: процесс культивирования довольно продолжителен (18-20 ч) и не обеспечивает высокого накопления бактерий, в том числе и жизнеспособных, он трудоемок, не позволяет использовать современное оборудование и приборы, что сказывается на качестве препарата, а также на эффективности производства.

Не обнаружено достаточно эффективного способа изготовления живой сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных, приближающегося к современному промышленному уровню производства биопрепаратов.

Целью изобретения является сокращение времени выращивания культуры, снижение себестоимости препарата, а также повышение качества, стабильности и стандартности биологических свойств вакцины.

Цель достигается за счет того, что периодическое глубинное культивирование листерий проводят в оптимизированной питательной среде в течение 7-9 ч в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде и высушивают.

Способ осуществляется следующим образом. В стерильный ферментер загружают жидкую оптимизированную по составу для листерий (штаммы УСХИ-19 и УСХИ-52) питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 18,0-22,0 Пептон 0,8-1,2 Натрий фосфорно- кислый двузамещен- ный 0,7-0,9 Дрожжевой экстракт 0,4-0,6 Глюкоза 0,15-0,25 Вода дистиллиро- ванная до 100,0 Готовая стерильная питательная среда должна содержать 160-180 мг% аминного азота и иметь рН 7,4-7,6 ед. рН.

Питательную среду в ферментере засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают при температуре (37±0,5)^оС в течение 7-9 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -200 -150 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 10-20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют 10%-ным раствором NaOH, дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15-0,25% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой защитной средой на калий-фосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

П р и м е р 1. Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров. Для культивирования листерий используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 18,0 Пептон 0,8 Натрий фосфорно- кислый двузаме- щенный 0,7 Дрожжевой экстракт 0,4 Глюкоза 0,15 Вода дистиллиро- ванная До 100,0 Питательная среда содержит 160 мг% аминного азота и имеет рН 7,4. Среду засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при 36,5^оС в течение 7 ч. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -200 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 10% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 6,0 млрд. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой защитной средой на калий-фосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

П р и м е р 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров. Для культивирования листерий используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 20,0 Пептон 1,0 Натрий фосфорно- кислый двузаме- щенный 0,8 Дрожжевой экстракт 0,5 Глюкоза 0,20 Вода дистиллиро- ванная До 100,0
Питательная среда содержит 170 мг% аминного азота и имеет рН 7,5. Среду засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при 37^оС в течение 8 ч. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -175 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалки, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют с помощью 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,20% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 24,0 млрд. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой защитной средой на калий-фосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

П р и м е р 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров. Для культивирования листерий используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 22,0 Пептон 1,2
Натрий фосфорно-
кислый двузаме- щенный 0,9 Дрожжевой экстракт 0,6 Глюкоза 0,25
Вода дистиллиро- ванная До 100,0
Питательная среда содержит 180 мг% аминного азота и имеет рН 7,6, Среду засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при 37,5^оС в течение 9 ч. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -150 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,25% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 10,0 млрд. Полученную культуру концентрируют, разводят сахарозо-желатиновой защитной средой на калий-фосфатном буферном растворе, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают.

П р и м е р 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных. Для культивирования листерий используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 16,0 Пептон 0,7
Натрий фосфорно-
кислый двузаме- щенный 0,6 Дрожжевой экстракт 0,3 Глюкоза 0,14
Вода дистиллиро- ванная До 100,0
Питательная среда содержит 150 мг% аминного азота и имеет рН 7,3. Среду засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при 36^оС в течение 6 ч. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -230 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 5% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,10% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Концентрация микробных клеток в 1 см³ составляет 0,8 млрд.

П р и м е р 5. Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных. Для культивирования листерий используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. Перевар Хоттингера 24,0 Пептон 1,4
Натрий фосфорно-
кислый двузаме- щенный 1,0 Дрожжевой экстракт 0,7 Глюкоза 0,30
Вода дистиллиро- ванная До 100,0
Питательная среда содержит 190 мг% аминного азота и имеет рН 7,7. Среду засевают культурой листерий, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при 38^оС в течение 10 ч. После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до -120 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,30% при лимитировании роста листерий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Концентрация листерий в 1 см³ среды составляет 4,0 млрд микробных клеток.

Технологические параметры изготовления серий сухой живой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных, указанные в примерах, приведены в таблице.

Применение интенсифицированного способа культивирования с использованием усовершенствованной питательной среды позволяет повысить накопление жизнеспособных бактерий при сокращении времени выращивания с 18-20 ч до 7-9 ч.

Вакцина, полученная этим способом, более стабильна по биологическим свойствам, в том числе и по иммуногенности.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЛИСТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий засев вакцинного штамма листерий, культивирование при 36,5 - 37,5^oС в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера с поддержанием рН 7,4 - 7,6 и дробной подачей глюкозы с последующим концентрированием и лиофилизацией полученной бактериальной суспензии, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 7 - 9 ч в жидкой питательной среде, дополнительно содержащей пептон, натрий фосфорнокислый двузамещенный и дрожжевой экстракт при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Перевар Хоттингера - 18,0 - 22,0
Пептон - 0,8 - 1,2
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7 - 0,9
Дрожжевой экстракт - 0,4 - 0,6
Глюкоза - 0,15 - 0,25
Вода дистиллированная - До 100
причем после засева окислительно-восстановительный потенциал среды снижают до (-200) ^oC (-150)мВ, затем до конца процесса культивирования поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 10 - 20% от насыщения кислородом воздуха, а подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15 - 0,25% при лимитировании роста листерий глюкозой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3