Способ получения биологически активного вещества, обладающего противоопухолевой, иммуномодулирующей и интерфероногенной активностью

 

Изобретение относится к медицине, в частности онкологии и иммунологии. Цель - способ получения из ткани пуповины пула белков с широким спектром биологического действия, обладающего способностью подавлять опухолевый рост in vivo, иммуномодулирующей и интерфероногенной активностями. Полученный из ткани пуповины плода человека по описанному методу спиртового осаждения белков препарат подавляет рост перевиваемых опухолей животных in vivo, стимулирует первичный иммунный ответ, усиливает функциональную активность Т-лимфоцитов и моноцитов крови человека и индуцирует сывороточный интерферон у животных. Способ получения экстракта белков из ткани пуповины плода человека отличается тем, что выделен путем улучшения белков с широким спектром биологического действия, обладающий противоопухолевым действием in vivo иммуномодулирующей и интерфероногенной активностями. 4 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности онкологии и иммунологии.

Цель выделение из ткани пуповины пула белков с более широким спектром биологического действия, обладающего способностью ингибировать опухолевый рост in vivo, иммуномодулирующей и интерфероногенной активностями.

Известны различные способы выделения активных веществ из тканей животных, которые можно рассматривать в качестве аналогов предлагаемого метода. (Патент США N 4770877, 1988; авт. св. N 1227198, 1986; Патент ФРГ 3326387, 1985).

Отличием указанных аналогов по сравнению с представляемой заявкой является более узкий спектр биологической активности выделенных веществ и гетерологичность используемых тканей животных для человека.

Прототипом к предлагаемой заявке является патент ЕР N 0200090 А2, 1986, где методом кислотно-спиртового осаждения из ткани пуповины и плаценты человека получены растворимые кислотно-спиртовые полипептиды, подавляющие рост опухолевых клеток в клеточных культурах человека, но не влияющие на пролиферацию нормальных фибробластов человека. Помимо ингибиции роста опухолевых клеток in vitro выделенные полипептиды способствовали заживлению ран и ожогов.

Предлагаемый способ выделения экстракта белков из ткани пуповины (БЭП) осуществляется по методу осаждения белков органическими растворителями. Пул замороженных пуповин плодов человека оттаивают на водяной бане при 37^оС, затем тщательно размельчают и в течение 2 ч отмывают от крови холодной проточной водой. Затем ткань многократно промывают дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой и взвешивают. Ткань в количестве 300-500 г подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, после чего добавляют соответственно 200-330 мл раствора буфера и помещают в металлический гомогенизатор. В качестве буфера используют 0,2 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0. Сразу после гомогенизации в течение 8-10 мин к гомогенату вновь добавляют буфер до соотношения 1:2 и суспензию оставляют на ночь при постоянном перемешивании на электромагнитной мешалке. Затем гомогенат центрифугируют при 8-9 тыс. об/мин в течение 40 мин и отделяют надосадочную жидкость. К последней с целью осаждения белков медленно, при беспрерывном перемешивании, добавляют равный объем охлажденного 96^о этилового спирта, и после инкубации в течение одного часа центрифугируют при 10-12 тыс. об/мин. Полученный осадок белков растворяют в забуференном физиологическом растворе и подвергают диализу с помощью диализных мембран, сначала против дистиллированной воды (не менее 18 ч), а затем физиологического раствора (в течение 6 ч). Все процедуры проводятся при температуре 4^оС. БЭП стерилизуют фильтрацией через миллипоровые фильтры с величиной пор 0,22 μ, проверяют на стерильность, определяют содержание белка по Лоури и разливают в ампулы. Препарат лиофилизируется в сублиматоре и хранится в холодильнике. Лиофилизированный БЭП сохраняет исходный уровень белка и биологические активности в течение 1 года. Описанный метод позволяет получить из одного килограмма ткани пуповины один грамм биологически активного пула белков.

Выделенный по предлагаемому способу пул белков отличается более широким спектром биологического действия, которым не обладают полипептиды, полученные по методу, описанному в прототипе.

Физико-химические свойства БЭП. Оптический спектр препарата, снятый на приборе фирмы "Hitachi" в ультрафиолетовой и видимой области света, указывает на наличие в препарате (помимо белков) и нуклеотидов. Растворимость БЭП при температуре 22^оС 6% БЭП обладает каталазной активностью. Согласно результатам аналитического электрофореза в 10% полиакриламидном геле по Дэвису БЭП содержит восемь белковых фракций, из них четыре минорные.

Токсичность препарата. Изучение острой токсичности БЭП на различных животных (мыши, крысы, кролики) доказало отсутствие таковой при введении внутривенно и внутрибрюшинно 5 и 10 биологически активных доз препарата для каждого вида животных. Биологически активная доза, вызывающая развитие противоопухолевой защиты, модуляцию иммунного ответа и индукцию интерферона, составляла 25 мг белка/кг. Наблюдения в течение 14 дней не выявили гибели животных, потери их веса, изменений волосяного покрова, поведения и функций желудочно-кишечного тракта и выделительной системы.

Хроническая токсичность определялась на мышах и крысах при введении подкожно и внутрибрюшинно пятикратной биологически активной дозы препарата на протяжении 6 дней. Наблюдения за животными в течение одного месяца не выявили отклонений от нормы и признаков токсичности.

Пирогенность препарата. БЭП, судя по опытам на кроликах, получивших 5 и 10 биологически активных доз препарата внутривенно, не обладает пирогенной активностью.

Аллергизирующая способность препарата. Возможная аллергизирующая способность БЭП выявлялась на морских свинках, получивших внутрибрюшинно 5 биологически активных доз препарата как при I, так и II (разрешающей) инъекциях. Симптомы слабо выраженной аллергической реакции (кратковременное почесывание мордочки, взъерошенность шерсти, единичные чихания и падение температуры на 0,5-1,0^оС) отмечены в 20% случаев.

Кластогенная способность препарата. Кластогенная способность БЭП проверена на крысах-самцах линии Вистар, получивших 1 и 2 биологически активные дозы препарата. Животных забивали спустя 24 ч после введения БЭП. За 1,5 ч до забивки животным внутрибрюшинно для остановки митозов вводили колхицин в дозе 1 мг/кг. Из костного мозга и бедренных костей готовили хромосомные препараты, которые окрашивали азур-эозином. Согласно полученным данным, БЭП не повышал нормального уровня цитогенетических нарушений у крыс.

Для экспериментальной проверки полученного заявляемым способом вещества были изучены его противоопухолевая, иммуномодулирующая и интерфероногенная активности.

Противоопухолевая активность препарата. Противоопухолевая активность БЭП определялась при введении биологически активных доз (0,5 мг белка для мыши и 2,5 мг белка для крысы) за 10-14 дней до перевивки опухолевых клеток крысам и мышам (табл. 1).

Судя по данным табл. 1, однократная иммунизация БЭП вызывает у мышей с опухолью Эрлиха удлинение средней продолжительности жизни (СПЖ).

Результаты опытов на крысах с лимфосаркомой Плисса представлены в табл. 2.

Итак, по результатам опытов на двух моделях перевиваемых опухолей выявлена противоопухолевая активность БЭП, выражающаяся в торможении роста опухоли и удлинении средней продолжительности жизни.

Иммуномодулирующая активность БЭП. Изучалось действие БЭП на интенсивность первичного иммунного ответа в реакции иммунного розеткообразования (И-РОК), и в тесте продукции антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана (ЭБ) на 8-10 день после однократного введения БЭП в дозе 0,5 мг белка/мышь. Результаты экспериментов в двух повторностях представлены в табл. 3.

Данные табл. 3 свидетельствуют об иммуностимулирующем действии предварительно введенного препарата на первичный иммунный ответ у мышей.

Помимо опытов in vivo, изучено влияние БЭП на активность мононуклеаров крови человека in vitro. C целью определения возможной токсичности БЭП для этих клеток препарат в дозе 0,5 мг белка/10⁶ клеток вводился в суспензионную культуру мононуклеаров человека, выделенных из периферической крови здоровых доноров в градиенте фиколл-верографина. Мононуклеары в среде 199 с 10% бычьей сыворотки культивировали в условиях термостата в течение 3-4 дней в присутствии препарата (опыт) и без него (контроль). Судя по числу витально окрашенных клеток, процент жизнеспособных клеток в опыте и контроле существенно не отличался (соответственно 75 ± 6,4 и 79,0 ± 10,5), что указывает на отсутствие токсического действия БЭП на мононуклеары крови человека.

О влиянии препарата на активность Т-клеток человека судили по реакции спонтанного розеткообразования. Процент Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) в опыте (10⁶ клеток/мл мононуклеаров до постановки реакции обрабатывали 0,5 мг белка БЭП в течение 1 ч) был достоверно выше (64,0 ± 3,9), чем в контроле (без обработки БЭП 52,0 ± 2,2). Следовательно, БЭП способствует дифференциации Т-клеток.

О влиянии препарата на функциональную активность моноцитов крови человека судили по изменению адгезивной способности этих клеток после предварительной обработки моноцитов (в течение часа) БЭП в концентрации 0,5 мг белка/10⁶ клеток. Способность обработанных БЭП мононуклеаров прилипать к пластику (при инкубации в течение 30 мин) была выше (процент прилипших клеток 26 ± 3,1), чем в контроле (18,3 ± 2,5). Увеличение адгезивной способности моноцитов крови свидетельствует об усилении их функциональной активности.

Итак, результаты опытов с клетками человека in vitro свидетельствуют о способности БЭП усиливать функциональную активность Т-лимфоцитов и моноцитов крови, способствуя обогащению мембран этих клеток рецепторами к ЭБ и рецепторами, отвечающими за адгезию.

Интерфероногенная активность препарата. Для выявления продукции интерферона (ИФН) под действием препарата белым беспородным мышам весом 18-20 г вводили препарат внутрибрюшинно в количестве 0,5 и 1,0 мг белка/мышь. Для выявления сывороточного ИФН мышей забивали спустя 24, 48, 72 час и пробы полученных сывороток титровали микрометодом на гомологичной клеточной линии мышей L-929 в отношении вируса энцефаломиокардита мышей. О титрах ИФН судили по степени подавления цитопатического действия вируса на клетки, обработанные пробами сыворотки.

Следует отметить, что титры ИФН, продуцируемые при введении мышам 0,5 и 1,0 мг препарата, были приблизительно одинаковы. В табл. 4 представлен уровень ИФН, индуцируемого 0,5 мг белка БЭП у мышей спустя 24 часа по суммированным результатам трехкратно проведенных опытов. В опытах в качестве известного индуктора интерферона была использована природная дсРНК фагового происхождения ларифан (препарат, полученный в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Латвии). Уровень ИФН определялся спустя 6 часов с момента введения 20 мкг/мышь ларифана.

Судя по табл. 4, БЭП индуцирует синтез сывороточного ИФН у мышей, титр которого спустя 24 часа (169 ед/мл) несколько превышает уровень ИФН, индуцированного ларифаном (138 ед/мл).

Титры ИФН, индуцированного БЭП, спустя 48 часов после введения были значительно ниже (40 ед/мл), а к 72 часам не превышали 10 ед/мл.

Полученный нами препарат обладает и антимутагенным свойством: при двукратной иммунизации мышей препаратом статистически достоверно снижается процент мутаций, индуцированных сильным кластогеном циклофосфаном.

Как известно, характерным свойством всех опухолевых клеток является их эмбрионизация, а БЭП, как экстракт органа плода, содержит пул разнообразных эмбриональных белков-антигенов и может вызвать невосприимчивость организма к постоянно возникающим опухолевым клеткам любого генеза. Следовательно, БЭП вкупе с его иммуномодулирующим и интерфероногенным действием, можно рассматривать как универсальное средство усиления противоопухолевой резистентности организма.

В целом предлагаемый нами способ (по сравнению с прототипом ЕР N 0200090 А2) имеет следующие преимущества.

Полученный описанным методом БЭП подавляет развитие некоторых перевиваемых опухолей животных, т.е. ингибирует опухолевый рост in vivo, тогда как выделенные авторами патента полипептиды ингибируют репродукцию опухолевых клеток в клеточных культурах.

БЭП обладает иммуномодулирующим и интерфероногенным действием, т.е. активностями, не отмеченными у полипептидов, описанных в патенте.

Изучение острой и хронической активности БЭП, его аллергизирующих и кластогенных свойств свидетельствует о практической нетоксичности препарата, тогда как в патенте сведения о токсичности выделенных полипептидов отсутствуют.

БЭП как нетоксичный и гомологичный для человека препарат с широким спектром биологического действия может быть использован для профилактики злокачественных новообразований и иммунокоррекций.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И ИНТЕРФЕРОНОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ, путем спиртовой экстракции гомогената ткани пуповины плода человека с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что перед экстракцией ткань трижды замораживают и оттаивают, экстракцию проводят вначале буферным раствором, центрифугируют, затем к надосадочной жидкости добавляют равный объем этилового спирта, инкубируют, повторно центрифугируют, осадок, содержащий целевой продукт, диализируют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2