Вакцина против болезни марека и способ профилактики болезни марека

 

Использование: в вирусологии. Сущность изобретения: предложена безвредная вакцина против болезни Марека с высокой иммуногенной активностью, что достигается использованием штамма ГКВ N 2223. Указанная вакцина используется для профилактики болезни у цыплят суточного возраста. 2 с. п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности ветеринарной вирусологии, и представляет собой способ получения и применения живой вакцины против болезни Марека.

Болезнь Марека регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. Болезнь характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает таким образом иммунодепрессивной активностью, чем снижает общую резистентность птиц и повышает чувствительность их к другим болезням. Поэтому болезнь Марека довольно часто протекает в ассоциации с другими заразными заболеваниями.

Репродукция вируса болезни Марека завершается в эпителии перьевых фолликулов, где он содержится в виде зрелых вирионов.

Для специфической профилактики болезни Марека применяют живые вакцины из аттенуированного вируса болезни Марека (штамм НРRS-16), апатогенного вируса (штаммы СVI-988, WHG, VC, BC-I, SB-I) и из герпесвируса индеек (штаммы FC-126, РВ-ТНV-I).

Применяемая в нашей стране вакцина против болезни Марека из вируса герпеса индеек (штамм FС-126) имеет низкую активность против изобретения. Кроме того, следует обратить внимание на факт окончательной репродукции вируса в организме птицы. Вирус герпеса индеек не созревает в эпителии перьевых фолликулов, а следовательно, контактная передача этого вируса практически не существует. Вакцинируют цыплят в суточном возрасте. Напряженный иммунитет при использовании данной вакцины наступает через две недели после вакцинации.

Однако наиболее восприимчивы к естественному заражению цыплята 1-14-суточного возраста. Это приводит к тому, что в наиболее восприимчивом возрасте цыплята остаются незащищенными против болезни.

Целью изобретения является получение высокоиммуногенной, эффективной, безвредной вакцины с высокой степенью защиты цыплят уже через 7 суток после вакцинации, а также обеспечение высокого уровня иммунитета в условиях массового заражения птиц.

Для достижения цели в качестве вакцинного штамма используют штамм "ВНИВИП" вируса болезни Марека, представляющий апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 1˙10⁵ 6˙10⁵ ФОЕ/см³) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом FC-126 у привитой птицы.

Штамм "ВНИВИП" вируса болезни Марека депонирован в государственной коллекции вирусов научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского ГКВ N 2223.

Способ изготовления вакцины.

Вакцину готовят следующим образом.

Вакцинный штамм "ВНИВИП" хранят в сосудах Дьюара с жидким азотом (-196^оС). При изготовлении вакцины производят рассев расплодки в культуре куриных эмбриональных фибробластов. Для этого берут 3-7 ампул с вакцинным штаммом вируса (титр которого должен быть не менее 1˙10⁵ ФОЕ/см³). После извлечения из азота ампулы немедленно помещают в воду с температурой 35-37^оС до полного оттаивания. После оттаивания содержимого ампул горлышки ампул тщательно обтирают спиртом, обжигают и отбивают запаянные концы стерильным корнцангом. Пипеткой аккуратно берут содержимое ампул, объединяют и разводят (или используют без разведения) питательной средой из расчета, чтобы в каждом 1 см³ содержалось 10 000 ФОЕ. Затем сливают из роллерных флаконов с 24-48-часовой культурой клеток ростовую среду и заменяют ее поддерживающей с 2% сыворотки крупного рогатого скота. В поддерживающую среду вносят вируссодержащую суспензию в количестве 150-200 ФОЕ/см² площади флакона. Флаконы с зараженной культурой помещают в роллерную установку со скоростью вращения 8-10 об/ч в термальной комнате (термостате) при температуре 39-40^оС на 3 сут.

К моменту съема клеток типичные фокусные поражения на культуре клеток должны быть отчетливо видны под микроскопом. Поддерживающую среду удаляют осторожно, не допуская смывания клеток со стекла, в сосуды вносят подогретый до 30-37^оС 0,125-0,25%-ный раствор трипсина из расчета 0,07-0,1 см³/см² площади флакона. Монослой смачивают раствором трипсина 2-3 мин, затем раствор трипсина сливают, флаконы вращают со скоростью до 20 об/мин при комнатной температуре 5-10 мин, после чего в сосуды в тех же объемах вносят поддерживающую питательную среду без сыворотки. Энергичным покачиванием клетки отслаивают от стекла и суспендируют в среде, после чего проводят 2-й пассаж.

С этой целью инфицированными клетками, собранными с одного роллерного флакона заражают свежий монослой из расчета 1:3 1:6, т.е. 3-6 роллерных флаконов и культивируют монослой до съема вируса и проведения 3-го пассажа 48 ч.

Сосуды с клеточными культурами, зараженными вирусом первого пассажа, помещают в роллерные установки в термальной комнате при 39-40^оС.

Характер специфического вирусного поражения монослоя, зараженного вирусом первого пассажа, несколько отличается от поражений, вызываемых вирусом второго пассажа. При культивировании вируса первого пассажа отмечают очаговые (фокусное) поражение монослоя. Вирус второго пассажа поражает гораздо большую часть клеток: в культуре клеток на 50-70% монослоя образуются симпласты и поликариоциты (крупные многоядерные клетки), которые легко можно увидеть под микроскопом.

Сбор клеток, инфицированных вирусом второго пассажа, осуществляется методом, описанным для первого пассажа вируса.

Клеточносвязанным вирусом второго пассажа заражают монослойные культуры клеток (3-й пассаж вируса) из расчета 1:5 1:25 и инкубируют их затем 48-72 ч. Можно заражать из расчета 1:50 1:100 и тогда следует культивировать 72-96 ч. По окончании периода инкубации в термальной комнате при 39-40^оС проводят сбор инфицированных клеток.

С этой целью инфицированные монослои обрабатывают 0,125-0,25% -ным раствором трипсина, также как и при съеме вируса первого пассажа и второго пассажа. После удаления трипсина во флаконы вносят защитную среду (поддерживающая среда с 10% сыворотки крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида). Объем защитной среды для сбора и суспендирования клеток 0,02-0,04 см³/см² площади флакона. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме. Концентрация клеток в суспензии должна быть 5-8 млн/см³.

Собранную суспензию инфицированных клеток разливают по 1-2 см³ в предварительно маркированные ампулы, которые закрывают стерильной ватой, запаивают в пламени газовой горелки и помещают в холодильник (2+4^оС) на 40-60 мин. Затем ампулы выдерживают 40-60 мин при (-40)^оС, после чего ампулы с вакциной немедленно погружают в жидкий азот.

Приготовленную вакцину контролируют на стерильность по ГОСТ 28085-89 и инфекционную активность путем титрации на 24-часовой культуре куриных эмбриональных фибробластов, выращенных на 50 см³ флаконах.

С этой целью готовят последовательные десятикратные разведения вируса на питательной среде без сыворотки от 10^-1 до 10^-5. Каждое разведение вируса тщательно пипетируют, не допуская образования пены в пробирке, и по 0,5 см³ вносят в 3-5 флаконов, предварительно освобожденных от ростовой среды и залитых поддерживающей средой следующего состава: 70% среды Игла, 28% среды 199 и 2% сыворотки крупного рогатого скота. Зараженную культуру инкубируют при 39-40^оС со сменой поддерживающей среды через 24 ч. Через 4-5 сут после заражения клеточные монослои окрашивают амидовым черным. Для этого сливают питательную среду и монослой отмывают от питательной среды 0,5%-ным раствором уксусной кислоты. Затем вносят во флаконы 0,1%-ный раствор амидового черного в 0,5%-ном растворе уксусной кислоты. Прокрашивание фокусов происходит в течение 2-5 мин. Краситель сливают и культуру отмывают от красителя 0,5%-ным раствором уксусной кислоты. Результаты титрования учитывают по наличию точечных окрашенных фокусов.

Подсчитывают фокусы в 3-5 флаконах, соответствующих одному и тому же разведению вируса, в которых число фокусов не превышает 100 и не менее 10.

Титр вируса вычисляют по формуле T где Т титр вируса в ФОЕ/см³; А среднее количество фокусов во флаконе; Р разведение вируса; 2 коэффициент пересчета на 1 см³.

Титр вируса в вакцине должен быть не ниже 1˙10⁵ ФОЕ/см³. По титру устанавливают количество иммунизирующих доз в 1 см³. За одну прививную дозу принимают 1000 ФОЕ.

Срок годности вакцины при условии хранения ее в жидком азоте 12 мес.

Вирусвакцина жидкая культуральная применяется с профилактической целью. Вакцинируют цыплят в первые часы после выборки из выводных шкафов непосредственно в инкубатории. Использовать вакцину одновременно с лекарственными препаратами не разрешается.

Перед проведением прививок пеналы с вирусвакциной осторожно вынимают из сосуда Дьюара так, чтобы жидкий азот не разбрызгивался и полностью стекал в сосуд. Затем из пенала, свободного от азота, извлекают необходимое количество ампул и быстро переносят в емкости с водой при 35-37^оС. Пеналы с оставшимися ампулами немедленно погружают обратно в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Содержимое каждой ампулы размораживают и растворяют в течение не более 1 мин. Процессу размораживания способствует легкое встряхивание вакцины.

После размораживания ампулы вскрывают и вакцину переносят шприцем во флаконы с разбавителем, соблюдая асептику. Разбавитель при смешивании должен быть охлажден до температуры холодильника 4-8^оС.

Каждую ампулу 2-3 раза ополаскивают разбавителем, который также переносят во флаконы. В каждом флаконе, содержащем 120 см³ разбавителя, разводят 600 доз, содержащем 160 см³ 800 доз. Флаконы раскрывают и осторожно наклоняют вправо-влево 8-10 раз, не допуская при этом образование пены. Приготовленную вакцину помещают в емкость со льдом и во время прививок флаконы с вакциной периодически легко встряхивают.

При таких условиях вакцина активна в течение 15-20 мин. Разведенную вакцину в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³ вводят цыплятам внутримышечно в верхнюю треть бедра при помощи инъектора полуавтоматического ИП-1 или ИП-2, или шприцем объемом 1 см³. Шприцы и иглы перед использованием стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10-15 мин.

П р и м е р 1. Эффективность вакцины из штамма "ВНИВИП" при введении цыплятам различных доз.

Опыты проведения на суточных цыплятах с использованием вакцины из штамма "ВНИВИП" с активностью не ниже 1˙10⁵ ФОЕ/см³. Предварительно были приготовлены разведения вируса от 100 ФОЕ/0,2 см³ до 2000 ФОЕ/0,2 см³ и каждым его разведением были иммунизированы по 70 голов суточных цыплят. Вакцину вводили внутримышечно в объеме 0,2 см³.

В контроле использовали 70 невакцинированных суточных цыплят. Через 14 сут после вакцинации опытные и контрольную группу цыплят заражали внутрибрюшинно вирулентным штаммом "ЗК" вируса болезни Марека. За опытной птицей вели наблюдения в течение 150 сут. Иммуногенность вакцины оценивали по количеству случаев болезни Марека, установленных патологоанатомически или гистологически у павших и убитых по окончании опыта птиц.

Эффективность вакцинации учитывали по формуле Э × 100 где Э эффективность вакцинации; А количество случаев болезни Марека в контрольной группе, В количество случаев болезни Марека в опытной группе, Результаты опытов приведены в табл.1.

Из данных таблицы следует, что 100%-ный иммунитет создается при использовании вакцины цыплятам в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³.

П p и м е p 2. Сравнительная оценка эффективности разных вакцин.

В опытах использованы вакцины производства Франции, Индии, ФРГ, ГДР, СССР и опытные образцы вакцины из штамма "ВНИВИП".

Изучение эффективности указанных вакцин проводили на суточных цыплятах. Для этого было сформировано 9 групп цыплят по 70 голов в каждой. Цыплят с 1 до 8 групп иммунизировали внутримышечно разными вакцинами в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³.

Цыплята 9 группы не вакцинировались и использовались в качестве контроля. Оценка эффективности вакцин проводилась по результатам контрольного заражения цыплят всех групп через 14 суток после их вакцинации. Результаты опыта приведены в табл.2.

Результаты контрольного заражения показывают, что наиболее высокую иммуногенную активность обеспечивает вакцина из апатогенного штамма "ВНИВИП" и французские вакцины из штаммов СУI-988 и SB1.

П р и м е р 3. Сроки наступления иммунитета при вакцинации цыплят разными вакцинами.

Для сравнения испытывали две вакцины: опытную вакцину из штамма "ВНИВИП" и вакцину промышленного производства из штамма "ФС-126".

Изучение сроков наступления иммунитета проводили на суточных цыплятах. Для этого было сформировано 11 групп цыплят. Цыплят с 1 по 5 групп вакцинировали опытной вакциной из штамма "ВНИВИП" в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³. Цыплят с 6 по 10 групп вакцинировали вакциной промышленного производства из штамма "ФС-126" в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³. Цыплят в 11 группе не вакцинировали и использовали в качестве контроля. Цыплят опытных групп NN 1 и 6, 2 и 7, 3 и 8, 4 и 9, 5 и 10 заражали вирулентным штаммом "ЗК" вируса болезни Марека через 2, 4, 7, 14 и 21 сут. соответственно. Результаты опыта приведены в табл.3.

Результаты опытов показывают, что полноценный иммунитет (сохранность более 80% ) наступает через 7 сут при вакцинации цыплят вакциной из штамма "ВНИВИП", в то время как при использовании вакцины из штамма "ФС-126" иммунитет наступает через 14 сут.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности изготовления вакцины против болезни Марека из апатогенного штамма "ВНИВИП" для специфической профилактики болезни Марека у кур.

Производственные испытания вакцины проводили по решению Главного управления ветеринарии в птицехозяйстве, неблагополучном по болезни Марека и Тверской области РСФСР. Птицу вакцинировали согласно разработанному наставлению по применению вакцины. Было привито 145500 цыплят. Данные опытов приведены в акте производственных испытаний вакцины.

Результаты испытаний показали, что вакцина из штамма "ВНИВИП" снижает отход птицы от болезни Марека, повышает общую сохранность и продуктивность птиц.

Основываясь на результатах лабораторных и производственных опытов по изучению иммуногенных свойств живой вакцины против болезни Марека из апатогенного штамма "ВНИВИП" и ее безвредности, можно заключить, что предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенностью и безвредна и может использоваться в качестве средства специфической профилактики болезни Марека в птицехозяйствах, неблагополучных по данной болезни.

Формула изобретения

1. Вакцина против болезни Марека, состоящая из инфицированных фибробластов куриных эмбрионов, замороженных в жидком азоте, отличающаяся тем, что она содержит фибробласты, инфицированные штаммом вируса болезни Марека ГКВ N 2223.

2. Способ профилактики болезни Марека, включающий введение цыплятам вакцины, отличающийся тем, что из вакцин используют вакцину из штамма ГКВ N 2223, а введение осуществляют цыплятам суточного возраста в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3