Способ определения гормональной чувствительности опухолей

 

Использование: медицина, клиническая биохимия, для определения гормональной зависимости клеток злокачественных опухолей. Цель изобретения - повышение точности определения гормональной чувствительности опухолей путем анализа действия гормонов на цикл обращения фосфолипидов - один из ключевых процессов инициации клеточного деления. Сущность изобретения: проводят анализ скорости включения ³²P-ортофосфата в фосфолипиды опухолевых клеток в присутствии гормонов и при изменении скорости включения на 50% и более относительно контрольного уровня делают вывод о чувствительности опухоли к гормону. В отличие от известного способа определения гормональной чувствительности опухолей, основанного на анализе содержания внутриклеточных гормонсвязывающих рецепторов, заявляемый способ позволяет оценить биологический эффект гормонов на пути переноса митогенного сигнала в клетках, что особенно важно при определении чувствительности опухолей к рострегулирующему действию гормонов. 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к области клинической биохимии, в частности к способу определения гормональной зависимости клеток злокачественных опухолей.

В клинической биохимии известно несколько способов определения гормональной зависимости опухолей. В разное время в качестве критериев чувствительности опухолей к стероидным гормонам рассматривались: изменение скорости роста опухоли после пробного курса гормонотерапии (1), содержание гормонов и 17-кетостероидов в крови и моче больных (2) и некоторые другие показатели. Однако применение таких способов в клинической практике быстро продемонстрировало их низкую эффективность в определении реального уровня гормональной чувствительности опухолей.

Наиболее близким решением является способ анализа гормональной зависимости опухолей, основанный на определении содержания специфических гормонсвязывающих клеток (3). Было показано, что связывание стероидов с рецепторами является необходимым условием реализации действия гормона на клетки и свидетельствует о потенциальной способности клеток реагировать на гормон. В настоящее время этот способ определения гормональной зависимости получил широкое распространение и принят во многих онкологических клиниках.

Однако известный способ имеет серьезные недостатки. В первую очередь, они связаны с тем, что присутствие рецепторов в клетках свидетельствует только об эффективном прохождении первой, начальной стадии действия гормона и не позволяет судить о реализации пост-рецепторных этапов действия гормона. В то же время во многих случаях конечный ответ клеток на гормон определяется именно эффективностью пострецепторных этапов, тогда как присутствие рецепторов стероидных гормонов в клетках-мишенях является необходимым, но отнюдь не достаточным условием реализации действия гормона. Эти представления подкреплены результатами многочисленных клинических исследований, показавших, в частности для опухолей молочной железы и матки женщин, что 30-50% рецепторположительных опухолей в действительности нечувствительны к действию стероидных гормонов. В результате в настоящее время остро встал вопрос о разработке дополнительных критериев гормональной чувствительности клеток, которые позволили бы оценить эффективность пострецепторных этапов действия стероидов.

Целью предлагаемого способа является повышение точности определения гормональной чувствительности опухолей путем анализа действия гормонов на цикл обращения фосфолипидов один из ключевых процессов инициации клеточного деления.

Поставленная цель достигается тем, что с целью повышения точности способа определения гормональной чувствительности опухолей проводят анализ скорости включения ³²P-ортофосфора в фосфолипиды опухолевых клеток в присутствии гормонов и при изменении скорости включения на 50% и более относительно контрольного уровня делают вывод о чувствительности опухоли к гормону. Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в нем предусматривается анализ биологического эффекта гормонов, определяемого по изменению скорости включения ³²P в клеточные фосфолипиды и, таким образом, становится возможной оценка эффективности пострецепторных стадий действия гормона. Известны косвенные способы определения гормональной зависимости опухоли, основанные на определении содержания гормонов в крови (2), скорости роста опухоли после пробного курса гормонотерапии (1), содержании внутриклеточных рецепторов гормонов (3). Однако ни одним из известных способов не оценивается биологический эффект гормонов на пути переноса митогенного сигнала в опухолевых клетках, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию "существенные отличия". Поскольку цикл обращения внутриклеточных фосфолипидов относится к одним из ключевых процессов, определяющих инициацию клеточного деления, анализ влияния гормонов на этот процесс позволяет судить о чувствительности клеток именно к рострегулирующему действию стероидов, что особенно важно при определении степени гормональной зависимости опухолей.

Примеры конкретного выполнения.

Предлагаемый способ определения гормональной зависимости опухолей был проверен и апробирован в следующих экспериментах.

1. Исследование чувствительности культивируемых in vitro клеток гепатомы 22 к цитостатическому действию глюкокортикоидных гормонов (дексаметазона). Культивируемые in vitro клетки гепатомы 22 обладают различной чувствительностью к цитостатическому действию дексаметазона в зависимости от фазы роста: клетки в экспоненциальной фазе роста резистентны к ростингибирующему действию гормона, тогда как клетки в относительно стационарной фазе роста являются гормонзависимыми. Было исследовано действие дексаметазона на цикл обращения фосфолипидов в клетках гепатомы 22, находящихся на разных фазах роста. Клетки на 2-й и 6-й дни после пересева преинкубировали 15 мин в присутствии или отсутствии 5·10^-7 дексаметазона и 20 мин после добавления ³²P-ортофосфата (20 мкКи/мл). Из клеток экстрагировали фосфолипиды и разделяли методом тонкослойной хроматографии на покрытых силикагелем пластинах, которые затем экспонировали на рентгеновской пленке РМ-В 24 часа. Было обнаружено, что добавление дексаметазона к клеткам гепатомы в экспоненциальной фазе роста не приводит к существенным изменениям в скорости включения ³²P в фосфолипиды. В то же время добавление глюкокортикоида к гормонзависимым клеткам гепатомы (в относительно стационарной фазе роста) вызывает значительное (на 50-70%) снижение включения ³²P в основные клеточные фосфолипиды: фосфатидилхолин и фосфатидилинозитол (рис. 1). Таким образом, изменение скорости обращения фосфолипидов является одним из ранних проявлений действия стероидов на клетки-мишени, анализ которого может служить дополнительным критерием гормональной чувствительности клеток.

2. Исследование действия 17 β-эстрадиола и прогестерона на цикл обращения фосфолипидов в клетках аденокарциномы матки женщин.

Заявляемый способ был использован для определения чувствительности к 17 b-эстрадиолу и прогестерону опухолей матки женщин. Из фрагментов удаленных аденокарционом матки выделяли клетки коллагеназным методом, преинкубировали 15 мин в отсутствие или в присутствии гормонов (10^-8 17 b-эстрадиола или 10^-7М прогестерона) и 20 мин после добавления ³²P-ортофосфата. Из клеток экстрагировали фосфолипиды и анализировали методом тонкослойной хроматографии. Оказалось, что добавление к клеткам гормоночувствительных опухолей матки стимулятора клеточной пролиферации 17 b-эстрадиола вызывает значительное (на 50-100%) увеличение включения ³²P в фосфолипиды (рис. 2). Наоборот, добавление ингибитора пролиферации прогестрона приводит к выраженному снижению включения ³²P в фосфолипиды (рис. 3). Известно, что прогестерон относится к одним из наиболее эффективных гормональных соединений, используемых в терапии аденокарциномы матки. Нами было исследовано 19 опухолей матки, из которых в 13 содержание рецепторов прогестерона превышало 100 фмоль/мг, а в 6 было ниже 100 фмоль/мг. Как видно из приведенной таблицы, прогестерон вызывает снижение скорости обмена фосфолипидов в 11 из 13 аденокарцином матки с высоким содержанием рецепторов и только в 2 из 6 опухолей с низким содержанием рецепторов прогестерона. Таким образом, несмотря на то, что высокое содержание рецепторов прогестерона является благоприятным фактором для реализации биологического эффекта гормона, присутствия рецепторов не во всех случаях оказывается достаточным для развития гормонального ответа в клетках. Учитывая ключевую роль, которую играет цикл обращения фосфолипидов в переносе митогенного сигнала в клетках, подавление обращения фосфолипидов под действием прогестерона можно рассматривать как один из дополнительных показателей гормональной зависимости опухолей матки.

Использование предлагаемого способа определения гормональной чувствительности опухолей обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества: 1) позволяет оценить эффективность пострецепторных этапов действия стероидов, в частности их влияние на скорость обращения фосфолипидов; 2) позволяет уточнить степень гормональной зависимости как рецепторположительных опухолей, так и опухолей с низким содержанием гормонсвязывающих рецепторов; 3) делает возможным определение in vitro сравнительной эффективности различных гормональных препаратов и выбор оптимальной схемы гормонотерапии в каждом конкретном случае заболевания.

Благодаря этим преимуществам, предлагаемый способ может быть использован в клинической практике с целью уточнения степени гормональной зависимости опухолей и выбора оптимальной схемы эндокринной терапии. Представленные выше результаты апробации предлагаемого способа показали, что он может быть с успехом применен для определения чувствительности к гормонам опухолей различной локализации: гепатом матки и некоторых других гормонзависимых опухолей.

Источники информации 1. Дильман В.М. Эндокринологическая онкология. Л. Медицина, 1983.

2. Bulbrook R. D. Hayward J.L. Spicer C.C. Thomas B.S. Lancet, 1962, 2, 1238.

3. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека / Под ред. Л.С.Бассалык. М. Медицина, 1987.

Формула изобретения

Способ определения гормональной чувствительности опухолей, включающий исследование клеток опухоли, отличающийся тем, что проводят исследование скорости включения ³²Р-ортофосфата в фосфолипиды опухолевых клеток при инкубации их в присутствии гормона и при изменения скорости включения на 50% и более после добавления к клеткам гормона делают вывод о чувствительности опухоли к исследуемому гормону.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4