Способ консервирования интактных клеток печени

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к приготовлению культуры клеток. Цель способа - замена печени человека на печень собаки и свиньи при приготовлении культуры клеток гепатоцитов, повышение жизнеспособности интактных клеток печени и увеличение их срока хранения при сохранении высокой жизнеспособности. Способ консервирования интактных клеток печени заключается в заборе печени свиней и собак, проведении сосудистой перфузии печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего 200-300 мг гиалуронидазы и 10-20 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса. После этого печень погружают в ферментный раствор указанного состава, выдерживают в нем, освобождают печень от капсулы, выдерживают печень в ферментном растворе при постоянном его перемешивании и оксигенации, извлекают печень из раствора, механически разрушают ее ткань, выдерживают клетки печени при температуре 37^oC с дальнейшим фильтрованием. Добавляют к фильтрату раствор Хенкса с последующим центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость и добавляют повторно раствор Хенкса, центрифугируют и осадок переносят в емкости, смешивая со средой 199 в соотношении 2:1, объемом 1-2 куб. см. Замораживают при минус 50^oC в течение 3-4 часов под вакуумом 50-100 мк. рт. ст. с температурой сублимации минус 30^oCминус 20^oC и температурой досушивания плюс 25^oC. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к приготовлению культуры клеток.

Известен способ консервирования интактных клеток аллогенной печени, включающий отбор материала, сосудистую перфузию печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего раствор Хенкса с введением в него гиалуронидазы и коллагеназы, освобождение печени от капсулы, выдерживание печени при полном погружении в ферментный раствор при постоянном его перемешивании и оксигенации, слитии раствора, механическое разрушение ткани печени, выдерживание полученной массы клеток печени при плюс 37 градусах С с дальнейшим фильтрованием, прибавление к полученному фильтрату раствора Хенкса, центрифугировании полученной взвеси, слитии надосадочной жидкости, промывки осадка раствором Хенкса, повторное центрифугирование и декантирование надосадочной жидкости, расфасовывание осадка гепатоцитов с добавлением среды 199 с последующим их консервированием введением актибиотиков.

Задачей способа является замена печени человека на печень собаки и свиньи, повышение жизнеспособности интактных клеток печени и увеличение их срока хранения при сохранении высокой жизнеспособности.

Сущность способа заключается в том, что у клинически эдоровых свиней и собак после убоя забирают печень, проводят сосудистую перфузию печени раствором Хенкса с последующим введением ферментного раствора, содержащего 200-300 мг гиалуронидазы и 10-20 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, печень погружают в ферментный раствор концентрацией гиалуронидазы 200-300 мг и коллагеназы 10-20 г/л раствора Хенкса, освобождают печень от капсулы, выдерживают печень в ферментном растворе при постоянном его перемешивании и оксигенации, извлекают печень из ферментного раствора и механически разрушают ее ткань; выдерживают клетки печени при температуре 37^oC с дальнейшим фильтрованием. Добавляют к фильтрату раствор Хенкса с последующим центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку раствор Хенкса, центрифугируют взвесь и сливают надосадочную жидкость. Добавляют в осадок клеток печени среду 199 в соотношении 2:1, расфасовывают в емкости объемом 1-2 куб.см, замораживают при минус 50 градусов Цельсия в течение 3-4 часов с последующей сублимационной сушкой в течение 20-48 часов под вакуумом 50-100 мк. рт. ст. с температурой сублимации минус 30^oCминус 20^oC и температурой досушивания плюс 25^oC.

Способ иллюстриpуется следующими примерами.

Пример 1. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят 6 л раствора Хенкса под давлением до соломенно-желтого цвета самой печени. После этого через воротную вену печени вводят 1 л ферментного раствора, приготовленного растворением 200 мг гиалуронидазы и 10 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, с температурой 37^oC и рН 7,45-7,5 до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в 5 л ферментного раствора указанного состава при температуре 37^oC так, чтобы она погрузилась целиком, при этом раствор перемешивают и прокачивают через него кислород. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в 5 л ферментного раствора указанного состава при 37^oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора на 15 минут. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани, полученную массу клеток выдерживают в термостате при 37^oC в течение 10 минут, фильтруют, после чего к фильтрату добавляют раствор Хенкса и вновь фильтруют через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь проводят центрифугирование. 2 куб.см осадка гепатоцитов смешивают с 1 куб.см среды 199 и расфасовывают по 2 куб.см в ампулы. Направляют на замораживание на кельвинаторе при температуре минус 50^oC в течение 4-х часов с последующей сублимационной сушкой в течение 40 часов под вакуумом 50 мк.рт.ст. с температурой сублимации минус 30^oC и температурой досушивания плюс 25^oC на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2.

Пример 2. Забирают печень от клинически здоровых собак. Через воротную вену печени вводят 6 л раствора Хенкса под давлением до соломенно-желтого цвета самой печени. После этого через воротную вену печени вводят 1 л ферментного раствора, приготовленного растворением 200 мг гиалуронидазы и 10 г коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, с температурой 37^oC и рН 7,45-7,5 до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в 5 л ферментного раствора указанного состава при температуре 37^oC так, чтобы она погрузилась целиком. При этом раствор перемешивают и прокачивают через него кислород. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в 5 л ферментного раствора указанного состава при 37^oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора на 15 минут. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани. Полученную массу клеток выдерживают в термостате при 37^oC в течение 10 минут. К фильтрату добавляют раствор Хенкса и вновь фильтруют через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь проводят центрифугирование. 2 куб.см осадка гепатоцитов смешивают с 1 куб.см среды 199 и расфасовывают по 2 куб.см в ампулы. Направляют на замораживание на кельвинаторе при температуре минус 50^oC в течение 4-х часов с последующей сублимационной сушкой в течение 48 часов под вакуумом 50 мк.рт.ст. с температурой сублимации минус 30^oC и температурой досушивания плюс 25^oC, на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2.

Пример 3. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят под давлением раствор Хенкса до соломенно-желтого цвета органа. После этого через воротную вену печени вводят ферментный раствор, содержащий гиалуронидазу в концентрации 300 мг и коллагеназу в концентрации 20 г в 1 л раствора Хенкса, до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в ферментный раствор указанного состава при полном погружении в него органа. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в ферментный раствор указанного состава и оставляют в нем на 15 минут. Все операции ферментной деструкции печени осуществляют при 37^oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани печени. Полученную массу клеток печени выдерживают при температуре +37^oC в течение 10 минут, фильтруют. К фильтрату добавляют равное количество р-ра Хенкса, фильтруют взвесь через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь центрифугируют взвесь. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку гепатоцитов среду 199 в соотношении 2: 1. Расфасовывают смесь в ампулу по 1 куб.см. Затем проводят замораживание на кельвинаторе в течение 3-х часов, после чего сублимационную сушку ведут в течение 20 часов под вакуумом 50 мкм рт.ст. и при температуре минус 20^oC и последующим досушиванием при плюс 25^oC на установке фирмы Лейбольт (ФРГ) аппарата G-T-2.

Пример 4. Забирают печень от клинически здоровых свиней. Через воротную вену печени вводят под давлением раствор Хенкса до соломенно-желтого цвета органа. После этого через воротную вену печени вводят ферментный раствор, содержащий гиалуронидазу в концентрации 300 мг и коллагеназу в концентрации 20 г в 1 л р-ре Хенкса, до вздутия органа. Печень помещают на 10 минут в ферментный раствор указанного состава при полном погружении в него органа. Вынимают печень и механически отделяют от нее капсулу. Печень вновь помещают в ферментный раствор указанного состава и оставляют в нем на 15 минут. Все операции ферментной деструкции печени осуществляют при 37^oC с постоянным перемешиванием и оксигенацией раствора. Вынимают печень из раствора и проводят тонкое измельчение ткани печени. Полученную массу клеток печени выдерживают при температуре +37^oC в течение 10 минут, фильтруют. К фильтрату добавляют равное количество раствора Хенкса, фильтруют взвесь через 4 слоя нейлонового фильтра с диаметром пор 40 микрон. Добавляют к фильтрату равное количество раствора Хенкса и полученную взвесь центрифугируют при скорости 1000 оборотов в минуту в течение 4 минут, сливают надосадочную жидкость. Осадок промывают раствором Хенкса и вновь центрифугируют взвесь. Сливают надосадочную жидкость и добавляют к осадку гепатоцитов среду 199 в соотношении 2:1. Расфасовывают смесь в ампулы по 1 куб.см. Затем проводят замораживание на кельвинаторе в течение 3-х часов после чего сублимационную сушку ведут в течение 24 часов под вакуумом 100 мк.рт.ст. и при температуре минус 20^oC с последующим досушиванием при плюс 25^oC на установке фирмы Лейбольта (ФРГ) аппарата G-T-2.

В результате проведенных экспериментов установлено, что только при использовании ферментного состава, содержащего 200-300 мг/л гиалуронидазы и 10-20 г/л коллагеназы в 1 л раствора Хенкса дает наилучший результат по жизнеспособности гепатоцитов и максимальное увеличение срока хранения препарата без изменения свойств гепатоцита. При обработке ферментным препаратом, содержащим количество ферментов менее 200 мг/л гиалуронидазы и 10 г/л коллагеназы в 1 л раствора Хенкса, приводит к резкому уменьшению количества выделенных изолированных клеток и к увеличению интервала времени на процесс выделения.

Концентрация гиалуронидазы свыше 300 мг/л и коллагеназы более 20 г/л в 1 л раствора Хенкса губительно действует на клетки печени свиней и собак, снижая их жизнеспособность в результате сильного ферментативного действия препаратов на клетки гепатоцитов свиней и собак.

Препарат интактных клеток печени, полученный по осуществленному способу характеризуется следующим (см. таблицу) Жизнеспособность клеток печени определялась методом окраски гепатоцитов 0,2 раствором трипанового синего с последующим микроскопированием живыми считались "светлые клетки", погибшими "темные".

Для определения жизнеспособности гепатоцитов консервированного препарата интактных клеток гепатоцитов, его восстанавливали в среде 199.

Соотношение смешивания клеток печени и среды 199 2:1 является экспериментально подобранным. Нарушение этого соотношения приводит к гибели клеток печени свиней и собак при последующей обработке. Только совокупность признаков: ферментной обработки печени, а именно, концентрация гиалуронидазы 200-300 мг и коллагеназы 10-20 г в 1 л раствора, смешивание гепатоцитов со средой 199 в соотношении 2:1, замораживание объема 1-2 мл смеси при минус 50^oC в течение 3-4 часов с последующей сублимационной сушкой в течение 20-48 часов под вакуумом 50-100 мк.рт.ст. и при температуре минус 30^oCминус 20^oC и досушиванием при плюс 25^oC позволяет получить 70-75% жизнеспособных клеток, увеличить срок хранения гепатоцитов до 12 месяцев при сохранении их жизнеспособности до 70% Использование параметров замораживания с последующей сублимационной сушкой позволяет сохранить жизнеспособность клеток на длительное время.

Формула изобретения

Способ консервирования интактных клеток печени, заключащийся в заборе печени, ее перфузии вначале раствором Хенкса, а затем раствором гиалуронидазы и коллагеназы на растворе Хенкса, освобождением печени от капсулы, диспергированием печени с последующим консервированием полученных клеток в емкостях в среде 199, отличающийся тем, что гиалуронидазу используют в концентрации 200 300 мг/л, коллагеназу в концентрации 10 20 г/л раствора Хенкса, перед освобождением от капсулы печень дополнительно погружают в раствор Хенкса, содержащий 200 300 мг/л гиалуронидазы и 10 20 г/л коллагеназы, для консервирования среду 199 берут в соотношении клетки печени среда 199 2 1, а затем проводят замораживание 1 2 мл смеси на одну емкость при (-50)^oC в течение 3 4 ч, после чего сублимационную сушку в течение 20 48 ч под вакуумом 50 100 мм рт.ст. и при температуре (-30)±20^oC с последующим досушиванием при 25^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1