Способ получения препарата "аффинолейкин" для противоинфекционной иммунотерапии

 

Изобретение относится к производству медицинских иммунобиологических препаратов, в частности к изготовлению препаратов трансфер-фактора, применяемых для лечения заболеваний, сопровождающихся недостаточностью противоинфекционного клеточного иммунитета, например герпесвирусных, стафилококковых и кандидамикозных заболеваний глаз. Трансфер-факторный препарат "Аффинолейкин" получают из лейкоцитарной массы - неутилизируемого отхода производства альфа-интерферона человека путем разрушения клеток замораживанием-оттаиванием, выделения низкомолекулярных компонентов мембранным разделением и лиофилизации. В отличие от известной технологии, использующей то же исходное сырье, в изобретении лейкоциты дополнительно дезинтегрируют механически, солюбилизируют в кислой среде с этилендиаминотетраацетатом натрия и вместо диализа и этанолового фракционирования применяют двухступенчатую мембранную диафильтрацию, выделяя из лейкоцитарного лизата компоненты с мол. массой более 5 кДа и менее 13 кДа, которые затем прогревают при 60^o C в течение 10 ч в присутствии глицина. Полученный препарат обладает высокой иммуноспецифической активностью в переносе иммунореактивности к антигенам убиквитарных инфекционных возбудителей, например к туберкулину и герпесвирусным антигенам, но при этом не проявляет ни противовоспалительного, ни миелостимулирующего, ни пирогенного действия. Кроме того, препарат гарантированно безопасен в отношении вирусной контаминации. 1 ил.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, преимущественно к производству биофармацевтических иммунокорригирующих препаратов, применяемых для лечения бактериальных, грибковых, протозойных и вирусных инфекций при заболеваниях, сопровождающихся дисбалансом иммунореактивности и недостаточностью клеточного иммунитета, например при герпесвирусных, стафилококковых и грибковых заболеваниях глаз. Оно может быть использовано в вакцинно-сывороточном производстве и в производстве препаратов крови, в частности при изготовлении таких иммунотерапевтических препаратов, как диализаты и ультрафильтраты лейкоцитарных экстрактов (препараты трансфер-фактора).

Препаратам трансфер-фактора свойственна иммуноспецифическая (антиген-специфическая) и фармакологическая (неспецифическая, иммунорегуляторная) активность. Их терапевтический потенциал обусловлен в основном иммуноспецифической активностью, носителями которой служат индуцибельные белки Т-клеточного происхождения с мол. массой порядка 5-6 кДа (т.н. трансфер-факторные пептиды), связывающиеся аффинно с гомологичным антигеном и способные при введении несенсибилизированному реципиенту индуцировать гиперчувствительность замедленного типа.

В отличие от иммуноспецифической фармакологическая активность препаратов трансфер-фактора обусловлена многочисленными низкомолекулярными примесями, которые оказывают неспефицическое противоспалительное, прокоагулянтное, миелостисмулирующее, антифагоцитарное и иммунодепрессивное действие. В ряде случаев клинической патологии фармакологическая активность препаратов трансфер-фактора может стать причиной осложнений его терапевтического применения. Поэтому оптимальный способ получения препаратов трансфер-фактора должен обеспечить максимальную иммуноспецифическую и минимальную фармакологическую активность.

Препараты трансфер-фактора получают из лейкоцитов крови и клеток лимфоидной ткани человека и животных. Клетки разрушают, готовят экстракт и подвергают его мембранному разделению диализу или ультрафильтрации для выделения компонентов с мол. массой менее 20 кДа, которые затем фракционируют с помощью хроматографии или осаждения этанолом.

Известен способ получения трансфер-факторного препарата из донорской лейкоцитарной массы неутилизируемого отхода производства альфа-интерферона. Лейкоцитарную массу выделяют из донорской крови, взятой в гемостабилизатор, путем осаждения эритроцитов декстраном или центрифугирования. Примесь эритроцитов удаляют с помощью гемолиза хлористым аммонием. Лейкоциты праймируют альфа-интерфероном, а затем стимулируют вирусом Сендай. Биосинтез интерферона продолжается 19 ч. После этого взвесь лейкоцитов центрифугируют, отделяют интерферон-содержащую надосадочную жидкость, собирают осадок лейкоцитов, замораживают и используют для получения трансфер-фактоpного препарата. Лейкоцитарную массу разрушают многократным замораживанием-оттаиванием, экстракт подвергают диализу против воды, диализат фракционируют этанолом при 4^o C. Вначале осаждают и отбрасывают компоненты, выпадающие в осадок при добавлении равного объема 94% эталона. Затем к надосадочной жидкости добавляют 18 объемов 94% этанола и собирают осадок, образующийся в течение 5 ч, и лиофилизируют.

Если учесть, что объем диализата должен примерно в 20 раз превышать объем лейкоцитарного экстракта, получение препарата по известному способу сопряжено с большими расходами концентрированного этанола. К тому же примесь этанола в высокой концентрации в осаждаемых фракциях создает серьезные проблемы при лиофильном высушивании конечного продукта. Основной недостаток известного способа состоит, однако, в том, что получаемый препарат обладает высокой фармакологической и низкой иммуноспецифической активностью. Отмечена его выраженная неспецифическая противовоспалительная активность он стимулирует антиген-независимый хемотаксис нейтрофильных гранулоцитов. Вместе с тем в ходе технологического процесса происходит нивелировка иммуноспецифического потенциала исходного сырья. Так, препараты, приготовленные из лейкоцитов случайных лиц и доноров, специально отобранных по высокой иммунореактивности на кандидин, обладали сходной невысокой способностью индуцировать специфический ответ на этот грибковый антиген (по данным реакции бласттрансформации лимфоцитов и торможения миграции гранулоцитов).

Сущность изобретения состоит в том, что в способе трансфер-факторного препарата из донорской лейкоцитарной массы отхода производства интерферона путем разрушения клеток замораживанием оттаиванием, выделения низкомолекулярных компонентов лейкоцитарного экстракта мембранным разделением и лиофилизации в отличие от известного лейкоциты дополнительно дезинтегрируют механически и солюбилизируют в кислой среде, содержащей этилендиаминотетраацетат натрия, и после нейтрализации и отделения клеточных фрагментов центрифугированием лизат вместо диализа и этанолового фракционирования подвергают двухступенчатой мембранной диафильтрации, позволяющей накопить пептиды с мол. массой 5-13 кДа, с последующей пастеризацией в присутствии стабилизатора.

Для осуществления изобретения в качестве исходного сырья используют осадок лейкоцитарной массы неутилизируемый отход производства человеческого лейкоцитарного интерферона. Лейкоцитарную массу выделяют из донорской крови, взятой в гемостабилизатор, путем центрифугирования. Примесь эритроцитов удаляют с помощью гемолиза хлористым аммонием либо осаждением метилцеллюлозой или декстраном. Для прайминга лейкоциты в течение 2 ч инкубируют с альфа-интерфероном человека в присутствии инсулина при 37^o С. Затем биосинтез интерферона в лейкоцитах индуцируют вакцинным штаммом Н вируса болезни Ньюкасла, репродуцированного в куриных эмбрионах, добавляя во взвесь клеток 10-10,0 ТЦД₅₀ вируса на лейкоцит. Биосинтез интерферона продолжается 18-20 ч при 37^o C в перемешиваемой взвеси лейкоцитов, содержащей 4-5·10⁶ клеток в мл культуральной среды. После этого лейкоциты осаждают центрифугированием при 600 g и 4^o C в течение 15 мин, интерферон-содержащую надосадочную жидкость отделяют и используют в качестве полуфабриката интерферона, а осадок лейкоцитарной массы служит исходным сырьем для получения трансфер-факторного препарата "Аффинолейкин". Лейкоциты суспендируют в 0,85% растворе хлористого натрия, содержащего 0,1% этилендиаминотетраацетата натрия, и отмывают этим же раствором путем центрифугирования при 600 g и 4^o C в течение 15 мин. Объединяют в одну загрузку сырья лейкоцитарную массу из культур, содержащих исходно в сумме 13·10¹¹ лейкоцитов (т.е. 13·10¹¹ клеточных эквивалентов). Отмытые клетки смешивают с дистиллированной водой и проводят 5 циклов замораживания при -20^o C и оттаивания при +37^oC. Клеточный детрит гомогенизируют в размельчителе тканей при 4000 об/мин и 4^o C в течение 2 мин. Доводят рН лейкоцитарного лизата до 2,2 добавлением 20% раствора соляной кислоты и оставляют на 5-10 сут при 4^o C, затем нейтрализуют, добавляя 20% раствор гидроокиси натрия до рН 7,2. Субклеточные частицы удаляют из лейкоцитарного экстракта центрифугированием при 20 000 g и 4^o C в течение 40 мин с последующей микрофильтрацией через мембрану с размером пор 0,2 мкм. Осветленный экстракт подвергают диафильтрации пятью объемами растворителя в половолоконном ультрафильтрационном модуле на мембране с ретенцией 15 кДа под давлением 0,05-0,1 МПа с рециркуляцией. Пермеат собирают и подвергают диафильтрации пятью объемами растворителя в половолоконном ультрафильтрационном модуле на мембране с ретенцией 5 кДа под давлением 0,05-0,1 МПа. Надмембранную фракцию собирают, добавляют 0,44% глицина, стерилизуют мембранной микрофильтрацией, прогревают при 60^o C в течение 10 ч, вновь стерилизуют мембранной микрофильтрацией, разливают по ампулам и лиофилизируют.

Описанный технологический процесс позволяет получить препарат, содержащий низкомолекулярные белки, имеющие мол. массу 4-6 кДа, и незначительную примесь других низкомолекулярных компонентов.

На чертеже представлена хромотограмма трансфер-факторного препарата "Аффинолейкин", сер. 28. Оптическая плотность при 280 нм. На колонку 14 · 750 мм Тойоперма HW 40 (сверхмелкого) (ТОСО Корп. Токио, Япония) нанесли 10⁹ клеточных эквивалентов препарата. Элюировали 0,2 М боратным буфером, рН 7,2, скорость 10 мл/ч.

Препараты, получаемые при осуществлении изобретения, обладают минимальной фармакологической активностью: не вызывают задержки привеса мышей F1 (CBA x C57BL/6) и морских свинок, которым вводили максимальную разовую дозу для человека, т.е. по 2,5·10⁹ клеточных эквивалентов; не вызывают местной воспалительной реакции при подкожном введении мышам NFS/N до 6·10⁹ клеточных эквивалентов препарата; не вызывают стимуляции миелопоэза по данным лейкергического теста при введении мышам NFS/N до 3·10⁹ клеточных эквивалентов препарата; не вызывают пирогенной реакции у кроликов после введения в вену 5·10⁸ клеточных эквивалентов препарата.

Иммуноспецифическую активность препаратов, полученных по предлагаемому способу, определяли на моделях переноса иммунологической памяти к антигенам повсеместно распространенных инфекционных возбудителей микробактерий туберкулеза и вируса простого герпеса.

Препарат вводили подкожно мышам NFS/N или F1 (CBA x C57BL/6) в дозах от 10⁷ до 5·10⁸ клеточных эквивалентов. Через сутки ставили реакцию конгломерации циркулирующих лейкоцитов в ряду разведений туберкулина (РР) от 12 до 0,01 мкг/мл. В контрольной группе животным вводили неспецифический стимулятор миелопоэза нуклеиновокислый натрий. Лейкоциты мышей, получивших 2·10⁷ и более клеточных эквивалентов препарата, давали реакцию конгломерации при пороговой концентрации туберкулина 0,01-0,1 мкг/мл, тогда как в контрольной группе конгломерация наблюдалась при концентрации туберкулина 3-12 мкг/мл. Таким образом, введение трансфер-факторного препарата в 30-120 раз снижало пороговую концентрацию антигена, на которую реагировали ин витро лейкоциты животных-реципиентов, т.е. имел место перенос иммунореактивности в отношении туберкулина.

В другой серии опытов клетки селезенки мышей AB/RU после краткосрочного культивирования в среде, содержащей от 5 до 5·10⁴ клеточных эквивалентов трансфер-факторного препарата на мл, приобретали (по данным торможения электрофоретической подвижности таннизированных эритроцитов барана в камере цитоферометра) способность высвобождать заряд-изменяющие лимфокины при контакте с туберкулином в концентрации 50 мкг/мл. Клетки селезенки, не обработанные трансфер-факторным препаратом, на туберкулин не реагировали. Следовательно, в этом случае также имел место перенос иммунореактивности в отношении туберкулина.

Лейкоциты больных глубокими формами хронического герпетического кератита не отвечали реакцией конгломерации на добавление в среду очищенного антигена вируса простого герпеса в концентрации до 0,4 ед/мл, но приобретали специфическую иммунореактивность после инкубации в среде, содержащей 2,5·10⁷ 2,5·10⁸ клеточных эквивалентов трансфер-факторного препарата на мл. т.е. происходила как бы коррекция антиген-специфической энергии клеток.

Полученный по предлагаемому способу препарат был использован для экспериментальной терапии герпесвирусного кератита у кроликов, нормальная иммунореактивность которых была подавлена ацетонидом триамцинолона. Заражение проводили, нанося содержащую вирус простого герпеса (1 тип) культуральную среду на скарифицированную роговицу. Каждое животное получило курс из трех инъекций по 2,5·10⁸ клеточных эквивалентов трансфер-факторного препарата. В сравнении с нелеченными животными у кроликов, получивших препарат, наблюдалась более интенсивная инфильтрация мест размножения вируса мононуклеарами и гранулоцитами с последующим более быстрым (на трое суток) обратным развитием специфической воспалительной реакции, т.е. происходило восстановление подавленной триамцинолоном иммунореактивности на герпесвирусные антигены.

В связи с тем что большинство взрослого населения латентно инфицировано туберкулезными микобактериями и вирусами простого герпеса и вследствие этого обладает иммунологической памятью в отношении антигенов указанных возбудителей, препараты, приготовленные из донорских лейкоцитов, в том числе из лейкоцитарной массы отхода производства интерферона, должны заведомо содержать специфичные к туберкулину и герпесвирусным антигенам трансфер-факторы. Следовательно, представленные результаты можно интерпретировать как доказательства высокой иммуноспецифической и низкой фармакологической активности препаратов трансфер-фактора, приготовленных в соответствии с изобретением.

Формула изобретения

Способ получения препарата для противоинфекционной иммунотерапии из лейкоцитарной массы отхода производства интерферона путем разрушения клеток замораживанием-оттаиванием, выделения низкомолекулярных компонентов мембранным разделением и лиофилизации, отличающийся тем, что лейкоциты дополнительно дезинтегрируют механически, солюбилизируют в кислой среде с этилендиаминотетраацетатом натрия и двухступенчатой мембранной диафильтрацией выделяют из лейкоцитарного лизата компоненты с молекулярной массой более 5 и менее 13 кДа, которые затем пастеризуют в присутствии глицина.

РИСУНКИ

Рисунок 1

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 1-2004

Извещение опубликовано: 10.01.2004