Способ получения олигонуклеотидного зонда для молекулярной гибридизации (варианты)

 

Использование: биотехнология, молекулярная биология, генная инженерия. Сущность изобретения: для получения олигонуклеотидных зондов путем химического синтеза на твердом полимерном носителе наращивают заданное число нуклеотидов, затем блокируют гидрофосфорильные межнуклеотидные связи, после чего к синтезированному фрагменту присоединяют очередной нуклеотид и к образовавшейся гидрофосфорильной связи присоединяют вещество-спейсер требуемой длины, в качестве которого используют алифатические диамины, после чего вводят биотиновую метку путем присоединения к свободной функциональной группе вещества-спейсера и продолжают наращивание нуклеотидов до введения очередной метки, а в процессе выделения и очистки зонда осуществляют деблокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей. Присоединение биотиновых меток к гидрофосфорильным межнуклеотидным связям посредством спейсерного вещества-спейсера не нарушает структуры оснований синтезированного олигонуклеотида, что обеспечивает полную идентичность синтезированного зонда комплементарному участку исследуемой нуклеиновой кислоты. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 10 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицине, в частности к способам получения олигонуклеотидных зондов для молекулярной гибридизации путем химического синтеза, и может быть использовано в научно-исследовательских и практических целях для индикации нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот, например для изучения первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот, а также для вирусной диагностики.

Известен способ получения олигонуклеотидных зондов для молекулярной гибридизации, заключающихся в химическом синтезе олигонуклеотида заданной последовательности и введении в него биотиновой метки ферментативным методом (см. например, L. K. Riley et al "DNA", 1986, vol. 5, N 4, р. 333-337).

Эффективное биотинилирование олигонуклеотидов в этом способе наблюдается только при использовании высокоактивных ферментов, например фермента полинуклеотидкиназы, которые дорогостоящи и требуют дорогостоящих компонентов, необходимых для проведения энзиматической реакции, что ограничивает применение этого способа в практических целях, например, для вирусной диагностики.

Кроме того, ферментативный метод введения биотиновой метки позволяет метить только концы олигонуклеотида, что ограничивает число вводимых в олигонуклеотид меток максимум двумя и, тем самым, не позволяет повысить эффективность самого зонда, увеличивающуюся с увеличением числа меток.

Известен также способ получения олигонуклеотидных зондов для молекулярной гибридизации, заключающийся в химическом синтезе олигонуклеотида и последующем введении в него биотиновых меток химическим путем (см. например, М. S. Urdea et ol. "Nuoleis Acids Researh", 1988, vol. 16, N 11, р. 4937-4955).

Химический метод позволяет вводить биотиновые метки не только по концам олигонуклеотида, но и между нуклеотидами. Однако присоединение молекулы биотина в этом способе проводится через модифицированное гетероциклическое основание олигонуклеотида, что снижает устойчивость образующихся при гибридизации комплексов зонда с нуклеиновой кислотой и, кроме того, уменьшает доступность самой молекулы биотина при детекции. Поэтому фактически этим методом вводят биотин в "нерабочие" области гибридизационного зонда, то есть на концы олигонуклеотида, вынужденно удлиняя последний при введении больше двух меток за счет присоединения дополнительных нуклеотидов.

Кроме того, химический метод биотинилирования олигонуклеотидов требует проведения многостадийных синтезов дополнительных синтонов промежуточных соединений, которые затем используют при синтезе гибридизационных зондов, что увеличивает время синтеза и повышает расходы химических реактивов.

За прототип выбран способ получения олигонуклеотидных зондов путем химического синтеза с совмещенными процессами наращивания олигонуклеотида и введения в него в любом заданном месте биотиновых меток (см. например, Misura K. et al. "Nucleic Acids Research", 1990, vol. 18, р.4345-4354).

В этом способе в качестве биотиновой метки используют соединение - биотин-фосфорамидит, которое имеет структуру, аналогичную нуклеотиду, и при введении в олигонуклеотид размещается между нуклеотидами и соединяется с их концами. В результате происходит искусственное увеличение расстояния между нуклеотидами зонда, что вызывает несоответствие его комплементарным участкам исследуемых нуклеиновых кислот, которое приводит к ухудшению гибридизационных свойств зонда. По существу этот способ пригоден для получения зондов с единичной или множественной меткой только по 5-концу олигонуклеотида. Однако при прикреплении множества меток к 5-концу они, последовательно присоединяясь один к другому, искусственно удлиняют зонд нерабочим участком, что снижает устойчивость образующихся при гибридизации комплексов зонда с нуклеиновой кислотой.

Задачей, на которую направлено заявляемое изобретение, является улучшение качества олигонуклеотидных зондов за счет сохранения межнуклеотидных расстояний при введении меток в среднюю часть олигонуклеотида, а также повышение устойчивости гибридизационных комплексов при введении в зонд множества меток.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения олигонуклеотидных зондов для молекулярной гибридизации путем химического синтеза, заключающемся в наращивании на носителе заданной последовательности нуклеотидов и введении одной или нескольких молекулярных меток, а также последующей очистке выделении полученного зонда от побочных продуктов синтеза, согласно изобретению, после наращивания заданного числа нуклеотидов осуществляют блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей синтезированного фрагмента, затем к фрагменту присоединяют очередной нуклеотид, а к образовавшейся гидрофосфорильной межнуклеотидной связи присоединяют вещество-спейсер требуемой длины, имеющее возможность взаимодействия с функциональной группой молекулярной метки, после чего вводят метку путем присоединения к веществу-спейсеру, при этом при введении метки в среднюю часть олигонуклеотида после полного его синтеза осуществляют окисление незаблокированных гидрофосфорильных связей, а в процессе выделения зонда осуществляют деблокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей. В качестве метки может быть использован, например, N-гидроксисукцимедный эфир биотинил-Е-аминокапроновой кислоты, а в качестве вещества-спейсера могут быть использованы алифатические диамины, при этом блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей зонда осуществляют метанолом, а деблокирование их - тиофенолом.

В предложенном способе при введении множества меток в отдельных случаях целесообразно после присоединения вещества-спейсера к заданным гидрофосфорильным группам осуществлять блокирование вещества-спейсера, а после полного синтеза олигонуклеотида осуществлять деблокирование вещества-спейсера, после чего вводить метки. Блокирование вещества-спейсера можно осуществлять, например, уксусным ангидридом, а деблокирование водным раствором аммиака.

Присоединение биотиновых меток к гидрофосфорильным межнуклеотидным связям зонда посредством вещества-спейсера не нарушает структуры оснований синтезированного олигонуклеотида, что обеспечивает сохранение расстояния между нуклеотидами идентичность синтезированного зонда комплементарному участку исследуемой нуклеиновой кислоты.

Подбор требуемой длины формируемого вещества-спейсера позволит увеличить доступность молекулы биотина при детекции.

Кроме того, возможность присоединения биотиновых меток к определенным фосфорильным межнуклеотидным связям зонда при блокировании остальных аналогичных связей позволяет вводить в олигонуклеотид произвольное число меток, практически в любое положение по его длине. Возможность равномерного рассредоточенного размещения множества меток на рабочем участке зонда не снижает устойчивости образующихся при гибридизации комплексов зонда с нуклеиновой кислотой.

Блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей метанолом обеспечичвает образование в условиях синтеза О-алкиловых эфиров, которые, однако, в процессе выделения олигонуклеотида могут быть легко расщеплены с образованием фосфодиэфирных связей. Использование же для формирования вещества-спейсера алифатических диаминов приводит к образованию фосфамидных связей, которые устойчивы как в процессе синтеза олигонуклеотида, так и при его выделении.

Использование при биотинилировании олигонуклеотида гидрофосфорильных межнуклеотидных связей с образованием фосфоралкокси и фосфамидных производных, обладающих неодинаковой стабильностью по отношению к одним и тем же реагентам синтеза, позволяет осуществить функционализацию олигонуклеотидов и их биотинилирование в процессе синтеза без проведения многостадийных синтезов дополнительных синтонов, что приводит к значительному сокращению времени синтеза, снижению расходов химических реактивов и, в конечном итоге, удешевлению олигонуклеотидного зонда.

Введение нескольких веществ-спейсеров в процессе синтеза олигонуклеотида и одновременно нескольких меток после его завершению также позволяет сократить время синтеза.

Возможность осуществления предложенного способа приведена на примере синтеза олиногуклеотидного зонда с двумя биотиновыми метками, расположенными, например, после третьего нуклеотида и перед 5-концом. Выбранный зонд комплементарен участку РНК вируса Синдбис, расположенному в гене 6К (с 10311 по 10333 нуклеотид геноленом РНК).

Синтез зонда проводят в синтезаторе АВ1-381А. В качестве твердого носителя используют полимерный материал СРG 500 (Sigma) с нагрузкой 30-50 мкм/г. Сущность способа поясняется фиг. 1 10, где схематично показана последовательность операций проведения синтеза биотинилированного олигонуклеотидного зонда.

Первоначально на носителе синтезируют фрагмент цепи зонда из трех нуклеотид -3'Н-фосфонатов А, С и Т (см. фиг. 1). Для этого проводят три аналогичные стадии наращивания цепи, включающие каждая введение соответствующего нуклеотида, промывку носителя с присоединенным фрагментом в МеСN (1х1 мл) и (3х1 мл), детритилирование 2,5% ТХУ в СНСl в течение 50:60 с и сушку в аргоне. Далее осуществляют блокирование образовавшихся двух гидрофосфорильных межнуклеотидных связей (см. фиг. 2). Для этого носитель обрабатывают 10%-ным раствором метанола МеОН в смеси t-MeIm/Et N/CCl и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре.

В результате образуются устойчивые в условиях олигонуклеотидного синтеза О-алкиловые эфиры олигонуклеотидов. После промывки носителя в 500%-ном растворе Рy/AcN и сушке его в аргоне вводят очередной нуклеотид G (см. фиг. 3). Далее к образовавшейся гидрофосфорильной связи между Т и G нуклеотидами присоединяют спейсерную "ножку" (см. фиг. 4). Для этого носитель обрабатывают алифатическими диаминами, например 10%-ным раствором 1,4-диаминобутана или 1,6-диаминогексана в смеси пиридина ССl в течение 20 мин. В результате к гидрофосфорильной связи присоединяется молекула диамина со свободной алифатической аминогруппой. При этом образуется фосфамидная связь, устойчивая не только в условиях олигонуклеотидного синтеза, но и в условиях выделения и очистки зонда. После промывки и осушки носителя в олигонуклеотид вводят биотиновую метку путем обработки носителя раствором N-гидроксисукцимидного эфира биотинил-Е-аминокапровой кислоты в сухом DMF в течение 60 мин. Активированная карбоксильная группа биотина присоединяется к свободной функциональной алифатической аминогруппе NH вещества-спейсера (см. фиг. 5). При этом молекулу диамина-вещество-спейсер подбирают такой длины, чтобы присоединившаяся к ней молекула биотина была максимально доступна при детекции. После введения биотиновой метки носитель промывают в 50%-ном растворе Рy/AcN и осушают в аргоне. Далее продолжают наращивание цепи зонда до места введения второй метки, последовательно проводя стадии наращивания нуклеотид-3'Н-фосфонатов (см. фиг. 6). После присоединения предпоследнего нуклеотида М проводят методами, описанными выше, блокирование образовавшихся межнуклеотидных гидрофосфорильных связей (см. фиг. 7), введение 5'концевого нуклеотида С, прикрепление вещества-спейсера перед 5'концом и введение метки биотина. ///2 В случае введения меток в среднюю часть олигонуклеотида после ведения последней биотиновой метки и наращивания оставшейся части цепи олигонуклеотида проводят окисление незаблокированных гидрофосфорильных связей этой части цепи.

После завершения синтеза биотинилированный олигонуклеотид отщепляют от носителя концентрированным водным раствором аммиака и производят деблокирование ранее заблокированных гидрофосфорильных связей путем добавления тиофенола, в результате которого временные простые эфирные связи разрушаются и происходит отщепление защитных групп с образованием фосфодиэфирных связей (см. фиг. 9). Отсутствие свободных незаблокированных во время синтеза межнуклеотидных гидрофосфорильных связей при введении последней метки перед последним нуклеотидом исключает необходимость проведения специальной стадии их окисления до фосфородиэфирных. Далее проводят очистку биотинилированного олигонуклеотида в 10%-ном РАGE до получения готового зонда (см. фиг. 10).

При введении множества меток целесообразно для сокращения времени синтеза после образования каждого вещества-спейсера блокировать его свободную алифатическую аминогруппу путем обработки носителя с синтезированными фрагментами цепи уксусным ангидридом Py/AC O/MeIm в течение 30 мин.

В промежутках между присоединением веществ-спейсеров проводят наращивание нуклеотидов и блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей описанными выше методами. После завершения синтеза олигонуклеотида осуществляют деблокирование алифатических аминогрупп диаминов водным раствором аммиака при 55^oС в течение 18 часов. После деблокирования вводят биотин, который присоединяется одновременно ко всем свободным алифатическим аминогруппам веществ-спейсеров.

Формула изобретения

1 1. Способ получения олигонуклеотидного зонда для молекулярной гибридизации, включающий наращивание нуклеотидной последовательности зонда на твердом полимерном носителе, присоединение одной или нескольких молекулярных меток с последующим выделением и очисткой зонда, отличающийся тем, что наращивание осуществляют отдельными нуклеотидами, с которыми соединяют вещество-спейсер, имеющее функциональные группы, взаимодействующие с нуклеотидами и меткой, при этом после наращивания определенного нуклеотида осуществляют блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей, затем к данному нуклеотиду присоединяют очередной, а с образовавшейся гидрофосфорильной связью соединяют вещество-спейсер, к свободной функциональной группе которого присоединяют метку, и продолжают наращивание нуклеотидов, затем проводят окисление незаблокированных гидрофосфорильных связей, а в процессе выделения и очистки зонда осуществляют деблокирование гидрофосфорильных междуклеотидных связей.2 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве метки используют N-гидроксисукцимидный эфир биотинил-Е-аминокапроновой кислоты, а в качестве вещества спейсера алифатические диамины.2 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей осуществляют метанолом, а деблокирование - теофенолом.2 4. Способ получения олигонуклеотидного зонда для молекулярной гибридизации, включающий наращивание нуклеотидной последовательности зонда на твердом полимерном носителе, присоединение одной или нескольких молекулярных меток с последующим выделением и очисткой зонда, отличающийся тем, что наращивание осуществляют отдельными нуклеотидами, с которыми соединяют вещество-спейсер, имеющее функциональные группы, взаимодействующие с нуклеотидами и меткой, при этом после наращивания определенного нуклеотида осуществляют блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей, затем к данному нуклеотиду присоединяют очередной, а с образовавшейся гидрофосфорильной связью соединяют вещество-спейсер, после чего осуществляют блокирование функциональной группы вещества-спейсера, взаимодействующего с меткой, и продолжают наращивание нуклеотидов, после полного синтеза олигонуклеотида осуществляют деблокирование функциональной группы вещества-спейсера и присоединяют метку к деблокированной группе, при этом в процессе выделения и очистки зонда осуществляют деблокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей.2 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве метки используют N-гидроксисукцимид биотинил-Е-аминокапроновой кислоты, а в качестве вещества-спейсера алифатические диамины.2 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что блокирование гидрофосфорильных межнуклеотидных связей осуществляют метанолом, а деблокирование - теофенолом.2 7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что блокирование функциональной группы вещества-спейсера, взаимодействующего с меткой, осуществляют уксусным ангидридом, а деблокирование водным раствором аммиака.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10