Экспресс-способ биотестирования пресных вод "поведенческие реакции моллюсков" ("прм-тест")

 

Использование относится к исследованиям в области охраны окружающей среды и устойчивого развития, касается способов экологического контроля вод разного целевого назначения с помощью биотестирования. Изобретение может быть использовано для оценки качества вод, загрязненных промышленными, сельскохозяйственными, бытовыми токсикантами и их смесями в концентрации от 0,1 до 100 ПДК и выше при экологической экспертизе, картировании и мониторинге природных и грунтовых вод. Сущность изобретения: в способе оценивают возникающие в тестируемой воде изменения поведенческих реакций тест-организмов, включая их локомоторную и дыхательную активность, а также ряд других физиологических реакций, по результатам оценки определяют параметры, характеризующие функциональное состояние тест-организмов и являющиеся показателями степени токсичности тестируемой воды. Оценку изменений поведенческих реакций тест-организмов производят дважды в специальных сосудах-ванночках двух видов в течение первого часа пребывания тест-организмов в тестируемой воде и спустя 48 - 70 ч нахождения в ней, соответственно в фазах адаптации и акклимации тест-организмов. Причем в качестве тест-организмов используют специально выведенных путем близкородственного скрещивания в стандартных, "экологически чистых" лабораторных условиях моллюсков Ampullaria gigas. В результате математической обработки данных получают один из критериев токсичности, который сравнивают по специальным шкалам, разработанным на основе результатов оценки предлагаемым способом токсичности модельных растворов, с заданными концентрациями основных классов токсикантов и эталонной (контрольной) воды и учитывающим действующие на тестируемые воды в зависимости от их целевого назначения нормативы по основным токсикантам, устанавливают степень токсичности тестируемой воды по результатам сравнения критериев токсичности. 11 табл.

Изобретение относится к исследованиям в области охраны окружающей среды, а именно к способам экологического контроля вод разного целевого назначения с помощью биотестирования. Изобретение может быть использовано для оценки в лабораторных условиях качества вод, загрязненных промышленными, сельскохозяйственными и бытовыми токсикантами и их смесями. Способ может быть использован для экологического картирования и выявления неблагоприятных участков водоемов и мест, пригодных для водозаборов.

Современный уровень техники характеризуется следующими аналогами предлагаемого способа. Разработано большое количество способов биотестирования водных сред, использующих в качестве тест-организмов разнообразных гидробионотов, относящихся к таким группам животных, как простейшие (инфузории, жгутиконосы), кищечнополостные (гидра), черви (планарии, пиявки), ракообразные (дафнии, гаммарусы), моллюски (пластинчатожаберные, брюхоногие), рыбы. По литературным данным, наиболее распространены способы биотестирования вод, где в качестве тест-организмов используют дафний. По-видимому, это обусловлено тем, что по сравнению со способами биотестирования, использующими пиявок и рыб, способы, использующие дафний, обладают большей чувствительностью к основным классам токсикантов.

Известен способ определения острой токсичности воды в отношении Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), описанный в международном стандарте "качество воды определение ингибирования подвижности Dahnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)" [1] Согласно указанному способу, в серию сосудов для испытания помещают увеличивающиеся объемы испытуемого раствора и добавляют воду для разбавления таким образом, чтобы получить в каждом сосуде испытуемый раствор заданной концентрации. Помещают в каждый сосуд заданное число Daphnta magna. Подготавливают контрольный сосуд для каждой серии испытаний, в котором объем воды для разбавления равен объему испытуемых растворов с таким же числом Daphnia magna, как в испытуемых растворах. Испытания проводят при заданной температуре окружающей среды, свободной от паров и пыли, токсичных в отношении Daphnia magna. Для испытаний используют животных, по меньшей мере, третьего поколения, полученных при ациклическом партегонезе в специфических условиях размножения, заданного размера и возраста. Испытания проводят в два этапа. В конце заданного периода испытания определяют число подвижных Daphnia magna в каждом сосуде. Считают неподвижными тех животных, которые не могут плавать в течение 15 с после слабого перемешивания жидкости, даже в том случае, если они еще могут двигать своими антеннами. Определяют предел допустимых концентраций, дающий иммобилизацию от 0 до 100% и регистрируют любые аномалии в поведении Daphnia magna.

Достоинство известного способа заключается в том, что он является экспресс-способом, т.е. оценка токсичности воды производится в течение 24 или 48 ч. К достоинствам способа можно отнести и тот факт, что для тестирования берут специально выведенные третье и далее поколения животных в отличие от способов, когда животных берут прямо из природной среды. Надежность и точность тестирования водной пробы на специально выведенных "экологически чистых" животных выше, чем животных, взятых из разных природных водоемов и уже адаптированных к имеющимся в них различным токсикантам. Сами дафнии обладают повышенной чувствительностью к ряду основных классов токсикантов, что также является достоинством способа.

Недостатком способа является тот факт, что дафнии не обладют достаточной резистентностью к действию токсикантов, что обуславливает то, что по-существу оценивают токсичность вод косвенно, разбавляя исследуемую воду заранее известной водой, не содержащей токсикантов, устанавливая различные концентрации исследуемой воды в различных сосудах, и судят о токсичности воды по поведению дафний в разбавленной воде. Это снижает точность способа, а также усложняет весь способ биотестирования в целом. Кроме того, хотя дафнии и выводятся специально, но каждый раз используют дафний, взятых из разных водоемов, что снижает воспроизводимость результатов тестирования, т.е. также снижает точность способа. Кроме того, с помощью этого способа определяют токсичность водных проб только в отношении дафний и только по степени их подвижности, не привязывая результаты оценки к действующим на тестируемую воду нормативам.

Таким образом, известный способ, хотя и является международным стандартом, не является унифицированным в том смысле, что не дает возможности использования его для оценки токсичности вод в соответствии с действующими нормативами по токсикологическим показателям для вод разного целевого назначения.

Наиболее близким по всей сущности является способ определения токсичности водных сред по авт.св. N 12706699, кл. G 01 N 33/18, C 02 F 3/32 [2] Согласно указанному способу, оценивают локомоторную активность тест-организма в тестируемой воде, определяют параметры, характеризующие функциональное состояние тест-организма, сравнивают эти параметры с аналогичными параметрами их функционального состояния, полученными при тестировании вод с заданными модельными токсикантами, по результатам сравнения судят о величине токсичности тестируемой воды. К недостаткам указанного способа относится то, что, во-первых, моллюсков каждый раз берут из разных природных водоемов, что снижает точность и воспроизводимость результатов тестирования воды, так как животные оказываются адаптированными к разным условиям существования и загрязнителям, в том числе и к используемому модельному токсиканту. Последнее приводит к тому, что их устойчивость и чувствительность к токсикантам сильно варьируют. Это создает существенные трудности при трактовке результатов биотестирования, снижая таким образом точность самого способа, что в свою очередь не позволяет считать его унифицированным. Во-вторых, брюхоногие моллюски проходят период адаптации (2 недели) в определенных условиях, что не позволяет отнести указанный способ к экспресс-способам.

Существенным недостатком известного способа является то, что проводят не прямую оценку токсичности тестируемой воды, а в различных ее разбавлениях. Таким образом, в способе не учитывается тот эффект, что при разбавлении тестируемой воды может произойти не подвергающееся учету взаимодействие тестируемой воды и разбавителя. Это может изменить токсичность анализируемой воды по сравнению с водой, взятой для анализа, что также может привести к снижению точности способа. К снижению точности способа и неравномерности использования его в качестве унифицированного приводит и то, что оценка общей токсичности исследуемой воды производится только по результатам сравнения с действием на животных только одного модельного токсиканта (медный купорос). Нельзя не отметить, что способ является очень трудоемким, так как требует для каждого биотестирования большого количества тест-организмов, многократных повторов измерений и специальной калибровки тест-организмов к модельному токсиканту.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в том, чтобы способ биотестирования обладал унифицированностью и универсальностью при своей экспрессности. Под понятием "унифицированность способа" здесь имеется в виду, что он должен обладать совокупностью таких свойств, чтобы его использование было бы достаточным для того, чтобы определить общую токсичность вод с учетом синтеза и антагонизма всех обуславливающих эту токсичность веществ. Под понятием "универсальность способа" здесь имеется в виду возможность достаточно широкого применения способа для общей токсикологической оценки различных вод культурно-бытового и хозяйственно-питьевого назначения, загрязненных разнообразными (бытовыми, промышленными, сельскохозяйственными и иными, возможно неизвестными) токсикантами. Наряду с этим, способ должен обладать экспрессностью, т.е. определение токсичности должно производиться достаточно быстро (не более 72 ч).

Техническими результатами, достигаемыми при использовании изобретения является то, что, во-первых, определение общей токсичности вод разного назначения по данному способу является достаточно точным, а, во-вторых, способ обладает повышенной воспроизводимостью результатов в сочетании с использованием относительно малого числа животных (6 12 шт.) и отсутствием необходимости поворотного биотестирования водных проб. Кроме того, при использовании способа можно тестировать широкий по качественному и количественному составу токсикантов диапазон вод.

Поставленная задача достигается тем, что как в известном способе оценивают локомоторную активность и физиологические параметры, характеризующие функциональное состояние тест-организмов в тестируемой воде при постоянной заданной температуре в сравнении с раствором модельных токсикантов, и по результатам сравнения определяют степень токсичности воды, но в отличие от известного способа в качестве тест-организмов однократно используют пресноводных переднежаберных молюсков вида Ampullaria gigas из лабораторной культуры, выведенной специально для биотестирования путем близкородственного скрещивания в стандартных, "экологически чистых" условиях (при постоянном составе среды обитания, температуры и корма). Помещают 6 12 тест-организмов в стандартные 1-литровые, круглые, прозрачные сосуды с тестируемой водой, стенки и дно которых снаружи разлинованы на квадраты. По истечении 10 мин адаптации тест-организмов к операции их нанесения в сосуды с тестируемой водой, в течение одного часа количественно оценивают локомоторную активность каждого тест-организма в условных единицах (пройденных квадратах) и число произведенных им дыхательных актов в фазе адаптивных реакций тест-организмов. Выдерживают тест-организмы при температуре 23 26^oC в тестируемой воде в течение 48 70 ч (в среднем для достижения ими фазы акклимации к тестируемой воде). После этого переносят тест-организмы на 1 ч 10 мин в прямоугольные 3 4-х камерные ванночки с эталонной водой (являющейся средой обитания тест-организмов) той же температуры, что и тестируемая вода, для анализа поведенческих реакций тест-организмов в наступившей фазе акклимации к пробе воды. Через 10 мин, данных на адаптацию, тест-организмы размещают в стартовой зоне большой камеры, а в одну из маленьких камер на стандартном расстоянии от тест-организмов помещают пищевую приманку, являющуюся основным кормом тест-организмов. Затем трижды, если позволяет время, определяют первый интервал времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние и второй интервал времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата им пищевой приманки (для этого после каждого захвата приманки каждый тест-организм возвращают в исходную (стартовую) зону большой камеры). Вычисляют параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций К₁ по формуле: K₁ a₁ x (l f), где l расстояние, пройденное тест-организмом за заданное время; f число дыхательных актов тест-организма, которое при отсутствии дыхательных актов считают равным единице; a₁ экспериментально определяемый коэффициент, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе адаптивных реакций постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, неоцениваемых на токсичность веществ.

После этого определяют параметр, характеризующий функциональное состояние в фазе адаптивных реакций всех тест-организмов (K_1ср) путем вычисления среднего геометрического значения параметра K₁.

Далее в зависимости от количества тест-организмов, захвативших пищевую приманку хотя бы один раз в течение заданного времени, вычисляют один из двух параметров, характеризующих функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации K₂ или K₃ по формулам: K₂ t_2ср (t_1ср x a₂), где R₂ параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации в случае, когда пищевую приманку захватили 50% и более используемых тест-организмов; t_1ср среднее геометрическое значение первого интервала времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние;
t_2ср среднее геометрическое значение второго интервала времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата приманки;
a₂ экспериментально определяемый коэффициент для вод, не обладающих катастрофической токсичностью, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, неоцениваемых на токсичность веществ.

K₃ b (a₃ x B),
где K₃ параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации в случае, когда пищевую приманку захватили менее 50% используемых тест-организмов;
b число перемещающихся в ванночках с эталонной водой тест-организмов;
B общее число используемых в ванночках с эталонной водой тест-организмов;
a₃ экспериментально определяемый коэффициент для катастрофически токсичных вод, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, неоцениваемых на токсичность веществ.

В случае вычисления параметра K₂, устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации K_2ср путем определения среднего геометрического значения K₂ для всех тест-организмов, которые хотя бы один раз захватили пищевую приманку.

Затем вычисляют критерий токсичности пробы тестируемой воды по одной из двух формул:
T_1э K_1ср K_2ср,
где T_1э критерий токсичности воды в случае, если определяют параметр K_2ср,
или T_2э K_1ср x K₃,
где T_2э критерий токсичности воды в случае, если определяют параметр K₃.

После этого производят сравнение критериев токсичности воды T_1э или T_2э по специальным шлакам, разработанным на основе результатов оценки предлагаемым способом токсичности модельных растворов с заданными концентрациями основных классов токсикантов (тяжелых металлов, пестицидов, соединений азота, фенола и т.д.) и эталонной воды и учитывающим действующие на тестируемые воды в зависимости от их целевого назначения нормативы по технологическим показателям основных токсикантов. Степень общей токсичности тестируемой воды определяют по результатам этого сравнения.

Изобретательский уровень предлагаемого способа доказывается тем, что совокупность существенных признаков приводит к тому, что с помощью предлагаемого экспресс-способа можно с достаточной точностью оценить степень токсичности тестируемой воды. Действительно, то, что для тестирования по данному способу в качестве тест-организмов однократно используют особей, специально выведенной в максимально экологически чистых, стандартных условиях лабораторной культуры гидробионтов, а оценку их функционального состояния производят в двух наиболее важных стадиях развития процесса адаптации живых организмов к действию повреждающих факторов (в данном случае токсикантов) в фазе адаптивных реакций и в фазе акклимации, приводит к существенному увеличению точности способа. Кроме того, к увеличению точности способа приводит и то, что параметры функционального состояния в фазе адаптивных реакций оценивают по изменению величины отношения локомоторной активности тест-организма к числу произведенных им дыхательных актов. Существенным является и тот факт, что в фазе акклимации функциональное состояние тест-организмов оценивают по разным функциональным показателям в зависимости от степени токсичности тестируемой воды. Таким образом, оценка общей токсичности воды производится на основе взаимосвязи таких параметров, которые наиболее полно отражают изменения функционального состояния тест-организмов, возникающие у них под действием содержащихся в тестируемой воде токсикантов.

Способ позволяет применять его для биотестирования вод в широком диапазоне их токсичности, во-первых, потому что специально выведенные экологически чистые тест-организмы обладают высокой чувствительностью в сочетании с достаточной резистентностью к воздействию на них спектра токсикантов, а, во-вторых, при установлении токсичности для сравнения используют не раствор одного модельного токсиканта, а специальные шкалы, разработанные на основе результатов оценки предлагаемым способом токсичности модельных растворов с заданными концентрациями целого ряда основных классов токсикантов (тяжелых металлов, пестицидов, соединений азота, фенола и т.д.) и эталонной воды и учитывающие действующие на тестируемые воды в зависимости от их целевого назначения нормативы по токсикологическим показателям основных токсикантов. В свою очередь, увеличение точности, чувствительности и широты диапазона использования предлагаемого способа приводит к его универсальности.

Изобретение может быть использовано для биотестирования пресной воды, т. е. для экологического контроля водной среды. Согласно предлагаемому способу в качестве тест-организмов однократно используют пресноводных переднежаберных моллюсков вида Ampullaria gigas из лабораторной культуры, выведенной специально для биотестирования путем близкородственного скрещивания в стандартных, "экологически чистых" условиях (при постоянном составе среды обитания, температуры и корма). Помещают 6 12 тест-организмов в стандартные 1-литровые, круглые, прозрачные сосуды с тестируемой водой, дно и стенки которых снаружи разлинованы на квадраты. По истечении 10 мин тест-организмов к адаптации тест-организмов к операции их внесения в сосуды с тестируемой водой в течении 1 ч количественно оценивают локомоторную активность каждого тест-организма в условных единицах (пройденных квадратах) и число произведенных им дыхательных актов в фазе адаптивных реакций тест-организмов к тестируемой воде. Выдерживают тест-организмы при 23 25^oC в тестируемой воде в течение 48 70 ч (в среднем до достижения ими фазы акклимации к тестируемой воде). Затем переносят тест-организмы на 1 ч 10 мин в прямоугольные 3 4-х камерные ванночки с эталонной водой (являющейся средой обитания тест-организмов) той же температуры, что и тестируемая вода. Через 10 мин тест-организмы размещают в исходной зоне большой камеры, а в одну из маленьких камер на стандартном расстоянии от тест-организмов помещают пищевую приманку, являющуюся основным кормом тест-организмов. Трижды, если позволяет время, определяют первый интервал времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние и второй интервал времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата им пищевой приманки. Для этого после каждого захвата приманки каждый трест-организм возвращают в исходную зону большой камеры.

Далее вычисляют параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций (K₁) по формуле:
K₁ a₁ x (l f),
где l расстояние, пройденное тест-организмом за данное время;
f число дыхательных актов тест-организма, которое при отсутствии дыхательных актов считают равным единице;
a₂ экспериментально отделяемый коэффициент, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе адаптивных реакций постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, неоцениваемых на токсичность веществ.

После этого устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние в фазе адаптивных реакций всех тест-организмов, захвативших пищевую приманку хотя бы один раз в положение заданного времени, вычисляют один из двух параметров, характеризующих функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации K₂ или K₃ по формулам:
K₂ t_2ср (t_1ср x a₂),
где K₂ параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации в случае, когда пищевую приманку захватили 50% и более используемых тест-организмов;
t_1ср среднее геометрическое значение первого интервала времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние;
t_2ср среднее геометрическое значение второго интервала времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата приманки;
a₂ экспериментально определяемый коэффициент для вод, необладающих катастрофической токсичностью, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, неоцениваемых на токсичность веществ;
K₃ d (a₃ x B),
где K₃ параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации, когда пищевую приманку захватили менее 50% используемых тест-организмов;
b число перемещающихся тест-организмов в ванночках с эталонной водой;
B общее число используемых в ванночках с эталонной водой тест-организмов;
a₃ экспериментально определяемый коэффициент для катастрофически токсичных вод, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации постоянно присутствующих в тестируемой воде, фоновых, неопределяемых на токсичность веществ.

В случае вычисления параметра K₂, устанавливают параметр функционального состояния всех трест-организмов в фазе акклимации - K_2ср путем определения среднего геометрического значения K₂ для тех тест-организмов, которые хотя бы один раз захватили пищевую приманку. Вычисляют критерий токсичности пробы воды по одной из двух формул:
T _1э K_1ср K_2ср,
где T_1э критерий токсичности воды в случае, если определяют параметр K_2ср;
T_2ср критерий токсичности воды в случае, если вычисляют параметр K₃.

После этого производят сравнение критериев токсичности воды T_1ср или T_2ср по специальным шлакам, разработанным на основе результатов оценки предлагаемым способом токсичности модельных растворов с заданными концентрациями основных классов токсикантов (тяжелых металлов, пестицидов, соединений азота, фенолов и т.д.) и эталонной воды и учитывающим действующие на тестируемые воды в зависимости от их целевого назначения нормативы по токсикологическим показателям основных токсикантов. Степень токсичности тестируемой воды устанавливают по результатам сравнения критериев токсичности.

Конкретно, токсичность вод по данному способу определяют в лабораторных условиях следующим образом. Приведем примеры определения общей токсичности вод разной степени токсичности, а также, в качестве сравнения, результаты оценки эталонной воды (контрольная оценка).

Пример 1. 22 июня 1992 года было взято для контрольной оценки токсичности 2 л эталонной воды, используемой в качестве среды содержания тест-организмов. Целью такого анализа было установление ее подготовленности по токсикологическим показателям для использования в качестве воды: а) питьевого назначения согласно нормативам ГОСТ 2873-83 [3] и б)культурно-бытового назначения согласно действующим на эти воды в Российской федерации ПДКт [4] При этом было известно, что взятая вода имеет нейтральную активную реакцию и небольшую жесткость (мягкая вода). Биотестирование проводят с использованием 6-ти тест-организмов.

Тест-организмы размещают в двух стандартных 1-литровых круглых, прозрачных сосудах с разлинованными снаружи на квадраты стенками и дном с тестируемой водой, подогретой до 25^oC, по 3 штуки в каждом. По истечении 10-ти минутного срока адаптации тест-организмов к операции их внесения в сосуды с тестируемой водой, в течение последующего часа (в фазе адаптивных реакций) количественно оценивают локомоторную активность каждого из них, для чего измеряют в условных единицах (пройденных квадратах) длину пути (1), пройденную каждым тест-организмом за 1 ч. Одновременно регистрируют количество дыхательных актов (f), совершенных каждым тест-организмом в течение часа. Полученные при этом численные значения показателей l и f приведены в табл.1.

После этого тест-организмы выдерживают в тестируемой воде 60 ч (средний срок выдерживания тест-организмов в тестируемой воде) при 25^oC. По истечении этого срока переносят тест-организмы на 1 ч 10 мин в исходные зоны больших камер двух стандартных прямоугольных 4-х камерных ванночек, наполненных эталонной водой той же температуры, что и тестируемая вода, для анализа поведенческих реакций тест-организмов в наступившей фазе акклимации. По истечении 10-ти минутного срока адаптации тест-организмов к операции их внесения в тест-ванночки второго образца, размещают на стандартном расстоянии от тест-организмов специальную дозированную пищевую приманку. После этого для каждого тест-организма регистрируют в секундах первый интервал времени перемещения на первое заданное расстояние t₁ и второй интервал времени перемещения на второе заданное расстояние, включая время захвата пищевой приманки t₂. После осуществления тест-организмом захвата приманки, его возвращают в исходную зону большой камеры и вновь регистрируют величины t₁ и t₂, повторяя эту операцию три раза (если позволяет заданное время 1 ч). В рассматриваемом примере после выполнения указанных операций были получены данные, представленные в табл.2.

Далее вычисляют параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций K₁ по формуле:
K₁ a x (l f)
Необходимые для расчетов численные значения величин l и f берут из табл. 1, принимая f за единицу в том случае, если тест-организм не совершил дыхательных актов, а коэффициент a₁ считают равным 1, так как для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₁ 1. Полученные значения параметра K₁ приведены в табл. 3.

Затем устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе адаптивных реакций K_1ср, путем определения среднего геометрического значения приведенных в табл.3 величин параметра K₁ для 6-ти тест-организмов:
K_1ср (163 x 148 x 157 x 136 x 175 x 183)^1/6 160
В данном примере все 6 тест-организмов осуществили захват пищевой приманки, поэтому для каждого из них рассчитывают параметр K₂, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации по формуле:
K₂ t_2ср (t_1ср x a₂).

Необходимые для расчетов численные значения величин t_1ср и t_2ср берут из табл.2. Коэффициент a₂ считают равным 0,01, так как для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₂ 0,01. Результаты расчета параметра K₂ представлены в табл.4.

Затем устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации K_2ср, путем вычисления среднего геометрического значения приведенных в табл.4 величин параметра K₂:
K_2ср (30 x 35 x 34 x 37 x 43 x 38)^1/6 34
С помощью установленных параметров K_1ср и K_2ср вычисляют критерий токсичности тестируемой воды T_1э по формуле:
T_1э K_1ср K_2ср 160 34 4,7
Выбирают из имеющихся шкал шкалу для бальной оценки общей токсичности вод культурно-бытового назначения, разработанную в соответствии с действующими в Российской федерации нормативами (ПДКт) и по ней определяют тот интервал значений модельного критерия токсичности T_1м, в который попал вычисленный T_1э и соответствующий этому интервалу балл токсичности. В данном примере T_1э попадает в интервал T_1м≥4, что соответствует первому баллу токсичности. Таким образом устанавливают, что полученная для биотестирования вода обладает допустимой для культурно-бытовых целей общей токсичностью, которая может быть приравнена к общей токсичности модельных вод с содержанием токсикантов (C), выраженным в ПДКт, варьирующим в диапазоне: C≅0,1 ПДКт.

Пример 2. 10 сентября 1992 года было взято 2 л воды из пруда у ст. метро "Озерки" г. Санкт-Петербурга для определения методом биотестирования степени ее общей токсичности с целью установления ее пригодности по токсикологическим показателям для использования в качестве воды культурно-бытового значения согласно действующим на эти воды в Российской федерации ПДКт [4] При этом было известно, что взятая вода имеет слабокислую реакцию и умеренную жесткость. Биотестирование проводят с использованием 6-ти тест-организмов.

Тест-организмы размещают в двух стандартных 1-литровых круглых, сосудах с тестируемой водой, как и в примере 1, по 3 штуки в каждом. По истечении 10-ти минутного срока адаптации тест-организмов к операции их внесения в сосуды с тестируемой водой, в течение последующего часа (в фазе адаптивных реакций) количественно оценивают локомоторную и дыхательную активность каждого из них, также как в примере 1. Полученные при этом численные значения показателей l и f приведены в табл.5.

После этого тест-организмы выдерживают в тестируемой воде 60 ч, так как этот срок оптимален для достижения ими фазы акклимации в слабокислой воде, незначительной или умеренной жесткости, к которой относится тестируемая вода.

По истечении этого срока переносят тест-организмы на 1 ч 10 мин в исходные зоны больших камер двух прямоугольных ванночек с эталонной водой и приводят те же операции, что и в примере 1, регистрируя t₁ и t₂ и вычисляя t_1ср и t_2ср. Их значения представлены в табл.6.

Далее вычисляют параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций K₁ по формуле:
K₁ a₁ x (l:f)
Необходимо для расчетов численные значения величин l и f берут из табл. 1, принимая f за единицу в том случае, если тест-организм не совершил дыхательных актов, а коэффициент a₁ считают равным 1, т.к. для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₁ 1. Полученные значения параметра K₁ приведены в табл. 7.

Затем устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе адаптивных реакций K_1ср, путем определения среднего геометрического значения приведенных в табл.7 величин параметра K₁ для 6-ти тест-организмов:
K_1ср (71 x 137 x 92 x 60 x 82 x 96)^1/6 87
В данном параметре 5 из 6 тест-организмов (т.е. более 50% использованных при тестировании) хотя бы один раз осуществили захват пищевой приманки, поэтому для каждого захватившего приманку тест-организма рассчитывают параметр K₂, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации по формуле:
K₂ T_2ср (t_1ср x a₂)
Необходимые для расчетов численные значения величин t_1ср и t_2ср берут из табл.6. Коэффициент a₂ считают равным 0,01, так как для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₂ 0,01. Результаты расчета параметра K₂ представлены в табл.8.

Затем устанавливают параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации K_2ср, путем вычисления среднего геометрического значения приведенных в табл.8 величин параметра K₂:
K_2ср (47 x 55 x 64 x 70 x 66)^1/5 60
С помощью установленных параметров K_1ср и K_2ср вычисляют критерий токсичности тестируемой воды T_1э по формуле:
T_1э K_1ср K_2ср 87 60 1,5
Выбирают из имеющихся шкал шкалу для бальной оценки общей токсичности вод культурно-бытового назначения, разработанную в соответствии с действующими в Российской федерации нормативам (ПДКт), и по ней определяют тот интервал значений модельного критерия токсичности T_1м, в который попал вычисленный T_1э и соответствующий этому интервалу балл токсичности. В данном примере T_1э попадает в интервал 1≅T_1m<2, что соответствует третьему баллу токсичности. Таким образом устанавливают, что протестированная вода обладает умеренной общей токсичностью, которая может быть приравнена к общей токсичности модельных вод с содержанием токсикантов (C), выраженным в ПДКт, варьирующим в диапазоне: 1<C≅3.

Пример 3. 22 июня 1992 года было получено 2 л воды, отработанной из обводного канала г. Санкт-Петербурга для определения методом биотестирования степени ее общей токсичности с целью установления ее пригодности по токсикологическим показателям для использования в качестве воды культурно-бытового назначения согласно действующим на эти воды в Российской федерации ПДКт [4] При этом было известно, что полученная для тестирования вода имеет слабокислую реакцию и умеренную жесткость. Биотестирование проводят с использованием 6-ти тест-организмов.

Тест-организмы размещают, как и в двух предыдущих примерах, в двух стандартных сосудах с тестируемой водой, подогретой до 25^oC, по 3 штуки в каждом. По истечении 10-ти минутного срока адаптации тест-организмов к операции их внесения в сосуды с тестируемой водой, в течение последующего часа (в фазе адаптивных реакций) количественно оценивают локомоторную и дыхательную активность каждого из них также как и в примерах 1 и 2. Полученные при этом численные значения показателей l и f приведены в табл.9.

После этого тест-организмы выдерживают в тестируемой воде 60 ч, так как этот срок оптимален для достижения ими фазы акклимации в слабокислых или нейтральных, мягких или умеренной жесткости водах. По истечении этого срока переносят тест-организмы на 1 ч 10 мин в исходные зоны больших камер двух стандартных прямоугольных ванночек с эталонной водой и далее выполняют те же операции, что и примерах 1 и 2, регистрируя t₁ и t₂ и вычисляя t _1ср и t_2ср. Их значения представлены в табл.10.

Далее вычисляют параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций K₁, по формуле:6 K₁ a₁ x (l f)
Необходимые для расчетов численные значения величин l и f берут из табл. 9, принимая f за единицу в том случае, если тест-организм не совершил дыхательных актов, а коэффициент a₁ считывают равным 1, так как для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₁ 1. Полученные значения K₁ приведены в табл.11.

Затем устанавливают параметр, характеризующийся функциональное состояние всех тест-организмов в фазе адаптивных реакций K_1ср, путем вычисления среднего геометрического значения приведенных в табл.11 величин среднего параметра K₁ для 6-ти тест-организмов:
K_1ср (2 x 6 x 5 x 2 x 4 x 6)^1/6 3,8
В данном примере лишь 2 из 6 тест-организмов (т.е. менее 50% использованных при тестировании) хотя бы один раз осуществили захват пищевой приманки, поэтому параметр K₂ не рассчитывают, а рассчитывают параметр K₃, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации по формуле:
K₃ a₃ x (b B),
где b 4, так как только четыре тест-организма перемещались в тест-ванночке второго образца; B 6, так как тестирование проводилось с использованием 6 тест-организмов; коэффициент a₃ считают равным 1, так как для мягких или умеренной жесткости, слабокислых или нейтральных вод, к которым относится тестируемая вода, a₃ 1.

Таким образом, K₃ 4 6 0,67.

С помощью установленных параметров K_1ср и K₃ вычисляют критерий токсичности тестируемой воды T_2э по формуле:
T_2э K_1ср x K₃ 3,8 x 0,67 2,5
Выбирают из имеющихся шкал шкалу для балльной оценки общей токсичности вод культурно-бытового значения, разработанную в соответствии с действующими в Российской федерации нормативами (ПДКт) и по ней определяют тот интервал значений модельного критерия токсичности T_2м, в который попал вычисленный T_2э, и соответствующий этому интервалу балл токсичности. В данном примере T_2э попадает в интервал T_2м > 1, что соответствует шестому баллу токсичности. Таким образом устанавливают, что протестированная вода обладает катастрофичной общей токсичностью первой категории, которая может быть приравнена к общей токсичности модельных вод с содержанием токсикантов (C), выраженным в ПДКт, варьирующим в диапазоне: 100 < C≅ 500.

В материалах данной заявки автор не приводит шкалы, разработанные им для данного способа, по которым устанавливают степень общей токсичности тестируемой воды, а также детальное описание тест-ванночек, характеристики пищевой приманки и эталонной воды, так как они представляют собой сведения типа "ноу-хау" и не включены автором в объем защиты.

Литература
1. International Standard Organization (ISO). 6341:1989 (E). "Water quality Determination of tht mobility of Dapnia magna Staus (Cladocera, Crustacea). International Standard Organization Publications, London. Great Britain.

Описание к авт.св. N 1270699 (1986 г.) G 01 N 33/18, C 02 F 3/32 "Способ определения токсичности водных сред".

ГОСТ 2874-82 Вода питьевая (Гигиенические требования и контроль за качеством), в сб. "Государственные стандарты Союза СССР. Вода питьевая. Методики анализа", М. 1984.

Беспамятов Г.П. Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Справочник. Л. "Химия", 1985, 528 с.

Формула изобретения

Экспресс-способ определения токсичности пресных вод, включающий оценку локомоторной активности гидробионтов и физиологических параметров, характеризующих их функциональное состояние в тестируемой пробе воды в сравнении с раствором модельного токсиканта, и по результатам сравнения определяют степень токсичности воды, отличающийся тем, что в качестве тест-организмов однократно используют пресноводных переднежаберных моллюсков вида Ampullaria Gigas из лабораторной культуры, выведенной специально для биотестирования путем близкородственного скрещивания в стандартных экологически чистых условиях при постоянных составе среды обитания, температуре и корме, помещают 6 12 тест-организмов в стандартные однолитровые круглые прозрачные сосуды с тестируемой водой, стенки и дно которых снаружи разлинованы на квадраты, по истечении 10 мин адаптации тест-организмов к операции их внесения в сосуды с тестируемой водой в течение 1 ч количественно оценивают локомоторную активность каждого тест-организма в условных единицах (пройденных квадратах) и число произведенных им дыхательных актов в фазе адаптивных реакций тест-организмов, выдерживают при 23 26^oС тест-организмы в тестируемой воде в течение 48 70 ч в среднем до достижения ими фазы акклимации к тестируемой воде, переносят на 1 ч 10 мин тест-организмы в прямоугольные 3 4-камерные ванночки с эталонной водой (являющейся средой обитания тест-организмов) той же температуры, что и тестируемая вода, через 10 мин тест-организмы размещают в исходной зоне большой камеры, а в одну из маленьких камер на стандартном расстоянии от тест-организмов помещают пищевую приманку, являющуюся основным кормом тест-организмов, трижды, если позволяет время, определяют первый интервал времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние и второй интервал времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата пищевой приманки, для этого после каждого захвата приманки каждый тест-организм возвращают в исходную зону большой камеры, определяют общее число возвратов каждого тест-организма при его неудачных попытках захвата приманки, вычисляют параметр K₁, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе адаптивных реакций, по формуле K₁ a₁ x (l:f), где l расстояние, пройденное тест-организмом за заданное время, f - число дыхательных актов тест-организма, которое при отсутствии дыхательных актов, считают равным единице, a₁ экспериментально определяемый коэффициент, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организма в фазе адаптивных реакций постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых, не оцениваемых на токсичность веществ, устанавливают параметр K_1ср, характеризующий функциональное состояние в фазе адаптивных реакций всех тест-организмов, путем определения среднего значения параметра К_1ср в зависимости от количества тест-организмов, захвативших пищевую приманку хотя бы один раз в продолжении заданного времени, вычисляют один из двух параметров (K₂ или K₃), характеризующих функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации по формулам
K₂ t_2ср:(t_1ср x a₂),
где K₂ параметр, характеризующий функциональное состояние каждого тест-организма в фазе акклимации в случае, когда пищевую приманку захватили 50% и более используемых тест-организмов;
t_1ср среднее геометрическое значение первого интервала времени перемещения каждого тест-организма на первое заданное расстояние;
t_2ср среднее геометрическое значение второго интервала времени перемещения каждого тест-организма на второе заданное расстояние, включая время захвата приманки,
a₂ экспериментально определяемый коэффициент для вод, не обладающих катастрофической токсичностью, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организма в фазе акклимации постоянно присутствующих фоновых не оцениваемых на токсичность веществ,
K₃ b:(a₃ x B),
где K₃ параметр, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации в случае, когда пищевую приманку захватило менее 50% используемых тест-организмов;
b число перемещающихся тест-организмов в ванночках с эталонной водой;
В общее число используемых в ванночках с эталонной водой тест-организмов;
a₃ экспериментально определяемый коэффициент для катастрофически токсичных вод, учитывающий действие на функциональное состояние тест-организмов в фазе акклимации постоянно присутствующих в тестируемой воде фоновых не определяемых на токсичность веществ,
в случае вычисления параметра K₂ устанавливают параметр K_2ср, характеризующий функциональное состояние всех тест-организмов в фазе акклимации, путем определения среднего значения K₂ для всех тест-организмов, которые хотя бы раз захватили пищевую приманку, затем вычисляют критерий токсичности пробы тестируемой воды по одной из двух формул
T_1э K_1ср: K_2ср,
где T_1э критерий токсичности воды в случае, если определяют параметр K_2ср;
T_2э критерий токсичности воды в случае, если вычисляют параметр K₃,
а сравнение критериев токсичности воды T_1э или T_2э производят по специальным шкалам, разработанным на основе результатов оценки предлагаемым способом токсичности модельных растворов с заданными концентрациями основных классов токсикантов (тяжелых металлов, пестицидов, соединений азота, фенола и т. д. ) и эталонной воды и учитывающим действующие на тестируемые воды в зависимости от их целевого назначения нормативы по токсикологическим показателям основных токсикантов, устанавливают степень токсичности тестируемой воды по результатам сравнения критериев токсичности.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3