Способ выделения с4 компонента комплемента человека

 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа выделения C4 компонента комплемента, утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы. Спиртовой осадок IV - 1 по Кону осаждают 16%-ным поли-(этиленгликолем) м.м. 4000 - 6000, из образовавшегося осадка выделяют C4 компонент комплемента, используя ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl и гель-фильтрацию на сефакриле S-200. Предлагаемый способ очистки C4 компонента комплемента из осадка IY-1 по Кону имеет преимущества перед прототипом, так как не требует ценного исходного сырья, каким является донорская плазма, дорогостоящих реакторов, прост в осуществлении. 1 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента: болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков системы комплемента.

Известно несколько способов выделения очищенного C4 компонента комплемента человека. Козловым Л.В. с соавт. (1987) предложен способ выделения C4 компонента комплемента из сыворотки крови человека, включающий обработку сыворотки раствором ЭДТА для связывания ионов кальция и магния с целью недопущения активации комплемента и последующее разделение сыворотки на псевдоглобулиновую и эуглобулиновую фракции при диализе в низкой ионной силе и слабокислом pH. C4 компонент комплемента выделяют из надосадочной жидкости - псевдоглобулиновой фракции путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефацеле с фосфатным буфером, содержащем, ε -аминокапроновую кислоту. Затем фракции, содержащие C4 компонент комплемента, концентрируют ультрафильтрацией на мембране РМ-10.

Прототипом получения высокоочищенного C4 компонента комплемента является способ, описанный Carl H. Nammer et al. (1981). Он включает: предварительную обработку плазмы раствором ингибиторов (ЭДТА, бензамидин-HCl, фенилметилсульфонилфторид) с целью предотвращения активации протеолитических ферментов плазмы крови, фракционирование плазмы поли(этиленгликолем) 5% м.м. 4000, адсорбцию плазминогена на L-лизин-сефарозе 4B, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефацеле, концентрирование C4-содержащих фракций с помощью обработки 16% ПЭГ 4000 м.м. с контролем гемолитической активности на каждой стадии. Способ многостадиен, трудоемок, в нем используются дорогостоящие реактивы, сорбенты для хроматографий.

Целью настоящего изобретения является упрощение и удешевления способа выделения C4 компонента комплемента, что немаловажно для диагностического препарата, а также утилизация бросовой фракции промышленного фракционирования плазмы.

Поставленная цель достигается тем, что C4 компонент комплемента выделяют в 3 стадии, используя бросовый осадок IV-1 по Кону как источник C4 компонента комплемента. По данным Cohn et al. (1946) осадок IV-1, образующийся при фракционировании плазмы крови на холоде в ходе промышленного получения иммуноглобулинов и альбумина, содержит компоненты комплемента.

На первой стадии 20%-ный осадок IV-1 растворенный в 0,1 М К-Р, pH 7,4, 10 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl осаждают ПЭГ м.м. 4000 6000 до конечной концентрации 16% ПЭГ при перемешивании. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин, 4^oC. На второй стадии 16%-ный осадок, растворенный в 0,01 М К-Р, pH 7,4, 10 мм e -аминокапроновой кислоты, хроматографируют на колонке ДЕАЕ-Toyopearl, уравновешенной тем же буфером, для элюции связавшегося белка, используя линейный градиент концентрации NaCl 0 - 0,5 M. Идентификацию C4 компонента комплемента во фракциях проводят иммунохимически. На третьей стадии сконцентрированные с помощью ультрафильтрации фракции подвергают гель-фильтрации на сефакриле S-200 в 0,01 М К-Р, pH 7,4, 10 мМ e -аминокапроновой кислоты, 0,15 М NaCl, 0,02% NaN₃.

Предлагаемый способ получения высокоочищенного C4 компонента комплемента человека из бросового осадка IV-1 по Кону имеет преимущества перед прототипом: не требует дорогостоящих реактивов, прост в осуществлении, имеет 3 основные стадии, представленные ниже на схеме.

Очищенный C4 компонент комплемента может быть использован: 1) как иммуноген для гипериммунизации животных с целью получения моноспецифической анти-C4 преципитирующей сыворотки, 2) для удаления нежелательных анти-C4 антител из поливалентных сывороток, 3) для определения титров анти-C4 преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини.

Формула изобретения

Способ выделения С4 компонента комплемента человека, включающий обработку сырья на основе крови человека с помощью ПИГ 4000 6000, центрифугирование с последующей очисткой осадка на ДЭАЭ-анионообменнике, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют осадок IV-1 фракционирования плазмы крови по Кону, перед обработкой ПЭГ его растворяют в буферном растворе высокой ионной силы при нейтральном рН, гельфильтрацию проводят с помощью сефакрила S 200.

РИСУНКИ

Рисунок 1