Противовирусное средство, вакцина на его основе, способ ее получения, терапевтический агент и способ обнаружения компонентов рнк-вирусов

 

Изобретение относится к области медицины. Сущность состоит в том, что предлагается противовирусное вещество, представляющее собой маннозаспецифический лектин, полученный из луковицы растения семейства Amarylidaceal, например, Narcissus Pseudonarcissus, и использование этого вещества для получения медикамента и вакцины. Вещество эффективно против РНК вирусов, которые содержат гликопротеины с манноза (альфа-1_→3) или (альфа-1-L6) манноза-соединениями, например, ВИЧ (HIV) или ВТЛЧ (HTLV), таких как Вирус Иммунодефицита Человека (ВИЧ) и Вирус Т Лимфотропии Человека (ВТЛЧ), а также может использоваться как диагностикум. 5 с. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.

Изобретение относится к противовирусному веществу и способам его использования.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV) и вирус I лимфотропии человека (ВТЛЧ, HTLV) создали серьезные проблемы по всему миру и очень важно, что должны быть найдены эффективные способы борьбы с ними. На анти-ВИЧ активность было исследовано большое число веществ и некоторые из них, как было показано, обладают положительным действием; желательно определять вещества, обладающие анти-ВИЧ активностью, для того, чтобы иметь возможность получать достаточные количества этих веществ для лечения пациентов.

Известно, что противовирусная химиотерапия больных синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) с помощью дидеоксинуклеозидов, таких как азидотимидин (АЗТ), действительно помогает некоторым пациентам. Однако токсичность АЗТ соединения, которое предположительно ингибирует вирусную ДНК полимеразу в зараженной клетке, такова, что необходимы поиски новых стратегий. Одна стратегия заключается в разработке веществ, которые препятствуют адсорбции и проникновению вируса путем блокирования CD 4 рецептора или вирусного гликопротеина. Было показано, что декстрансульфат способен блокировать заражение клеток вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Вследствии было найдено, что другие сульфатированные полисахариды, например, гепаринсульфат, хондроитинсульфат и полисульфатированный поликсилан обладают анти-ВИЧ активностью in vitro. Эти вещества ингибируют адсорбцию вируса и образование синцитиума, хотя прямое воздействие этих лекарств на заразность вируса не было продемонстрировано.

Поскольку заболеваемость СПИДом и ЛТС (лейкемия Т-клеток совершеннолетних) носит характер пандемии, существует настоятельная необходимость разработки диагностикумов, которые будут прямо распознавать ВИЧ ему подобные вирусы либо в неповрежденном виде, либо в виде их компонентов, особенно в жидкостях организма. Эти вирусы, по-видимому, вызывают вышеуказанные заболевания.

Ранее Мюллером с сотрудниками (Muller et al. Journal of Acguired Immune Dificiency Syndromes 1:453-458) было предложено использовать D-манноза-специфический лектин из Gerardia savaglia для предотвращения заражения H9 клеток ВИЧ-1. Этот лектин получают путем экстракции из коралла. Однако он склеивает (агглютинирует) клетки крови человека и, следовательно, является непригодным для использования в качестве терапевтического средства.

Следующие процедуры в основном пригодны для обнаружения ВИЧ-1 и ВТЛЧ: 1. Прямое обнаружение в электронномикроскопических препаратах.

2. Визуализация путем иммунофлуоресценции с использованием специфических антител.

3. Обнаружение компонентов с помощью генетических зондов и гибридизации.

4. Размножение вируса в клеточной культуре.

5. Анализ захвата антигенов (АЗА) или конкурентного захвата, например, ферментный иммуносорбентный анализ (ФИСА, ELISA).

До сих пор АЗА был описан только в принципе: антитело, которое распознает вирус или компонент вируса, прикрепляют к твердой фазе, например, к стеклу или пластику. После этого человеческий материал, предпочтительно сыворотку или плазму, приводят в контакт со связанным антителом. После достаточной инкубации комплекс иммубилизованного антитела с вирусом можно визуализировать с помощью меченого вирусспецифического антитела.

В конкурентном захвате антитело предварительно инкубируют с тест-раствором, который может содержать вирус или компоненты вируса, а затем приводят в контакт с тем же самым вирусом или его компонентами, прикрепленными к твердой фазе.

Обнаружено, что манноза-специфический лектин способен точно распознавать вирус или его компоненты.

Cогласно настоящему изобретению предлагается противовирусное вещество, включающее в себя манноза-специфический лектин, полученый из луковицы растения семейства Amaryllidaceae в сочетании с фармацевтическим переносчиком.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предлагается манноза-специфический лектин, полученный из луковицы растения семейства Amaryllidaceae для использования в качестве противовирусного вещества.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предлагается использовать манноза-специфический лектин, полученный из луковицы растения семейства Amaryllidaceae, для производства медикаментов для лечения РНК вирусов, которые содержат гликопротеины с маннозой (альфа-1_→3) или (альфа-1-L6) манноза соединениями, например, ВИЧ или ВТЛЧ. Эти вирусы являются предпочтительно концевыми (альфа-1-L3) или внутренними (альфа-1-L6) или концевыми (альфа-1-L6) соединениями.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предлагается вакцина для защиты от вируса, причем указанную вакцину получают путем использования манноза-специфического лектина, полученного из луковицы растения семейства Amaryllidaceae.

Предпочтительно вакцину получают путем выращивания антител против лектина либо in vivo, либо in vitro, а антитела затем используют для вакцинации против вируса.

Предпочтительными вирусами являются вирусы ВИЧ или ВТЛЧ.

Лектин предпочтительно получают из луковиц нарцисса, и он, например, может быть лектином из Narcissus pseudonarcissus (НПЛ). Другими примерами отдельных лектинов являются лектины из Leucojum aestrivum и Leucojum veruum. Лектин из НПЛ является специфичным для остатков Ман (альфа-1-L3) Ман и Ман (альфа-1-L6) Ман. Лектины из луковиц подснежника также могут быть эффективны, но могут вызывать повреждения вследствие их тенденции связываться с альфа-2- макроглобулином, который присутствует в сыворотке человека в больших количествах.

Испытания с НПЛ, как было показано, с 50%-ной эффективностью ингибируют инфекцию ВИЧ при 3 мкг/мл (примерно 0,3 мкМ).

Экстракцию лектинов можно проводить по способу, описанному в Physiologia plantarium, 73: 52-57 ("Родственные манноза-специфические лектины из различных видов семейства Amaryllidaceae") Els J.M.Van Damme, Authony K. Allen and Willy J.peumans, описание которого включено сюда посредством ссылки.

Испытания лектинов предпочтительно проводить по способу, описанному в Journal of Acguired Immune Deficienty Syndromes 1:453-458 ("D-манноза-специфический лектин из Gerardia savageia блокирует связывание вируса иммунодефицита человека типа I с Н9-клетками с лимфоцитами человека in vitro") werner E. G. Muller, Karin Reuneiscu, Mattihius H. Kventer, Heinz C. Schroder и Jrfin Winlcler, описание которого включено сюда посредством ссылки.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предлагается диагностическое вещество для РНК вирусов, которые содержат гликопротеины с Ман (альфа-1-L3) Ман или Ман (альфа-1-L6) Ман связями или их компонентов, содержащих манноза-специфический лектин.

Изобретение также предлагает методику диагностики РНК вирусов, которые содержат гликопротеины с Ман (альфа-1-L3) Ман или Ман (альфа-1-L6) Ман связями, включающую в себя использование вышеупомянутого диагностического материала в анализе захвата антигенов или анализе конкурентного захвата.

Изобретение также предлагает диагностический комплект для обнаружения РНК вирусов с Ман (альфа-1-L3) Ман или Ман (альфа-1-L6) Ман связями, или их компонентов, содержащий манноза-специфический лектин.

Предпочтительнее иммубилизовать лектины на полосках искусственного материала, стеклянных капельках или пластическом материале. После этого иммубилизованный лектин инкубируют в течение достаточного периода времени с определенным объемом человеческого материала, сыворотки или среды. После промывки раствором с нейтральным pH можно определить количество комплекса лектин-вирус (или вирусный компонент), используя антитела, специфичные для вируса (или его компонентов), по установленной методике "ферментного сэндвич иммуносорбентного анализа (ФСИСА, ELISA)" (Уолкер Дж. М. Методы молекулярной биологии; Том 1, Урбана Пресс, Клинтон; 1984).

Кроме того, лектин можно пометить прямо. Например, можно использовать следующие методики мечения: радиоактивный йод 125, флуоресцеинизотиоцианат или фермент, такой как пероксидаза (Новотны А: Основные упражнения в иммунохимии, Шпрингер-Ферлаг, Берлин, 1979). Для количественного определения можно использовать методики: оценки радиоактивности (в случае радиоактивных меток), флуориметрии (для мечения флуоресцеинизотиоцианатом антител) или измерения активности фермента со специфическими субстратами (в вышеуказанном случае, пероксид водорода).

Точность, полученная с новым диагностикумом, высока. К тому же, преимуществом является то, что исходный материал для этого класса лектина недорог.

Далее в следующих примерах с целью иллюстрации будут описаны воплощения изобретения.

Пример 1. Лектин из Narcissus pseudonarcissus (НПЛ) очищали, как описано Ван Даммом с сотр. (Van Damme et al. 1988).

Штаммы вирусов.

Испытывали штамм ВТЛЧ-IIIв (HTL V-IIIв, Popovic et al. 1984) ВИЧ-1 и два штамма ВИЧ-2, ВИЧ-2ST (HIV-2ST, Kong et al. 1988) и ВИЧ-2_MS (HIV-2_MS Kanki et al. 1988).

ВИЧ-1 частицы готовили из среды зараженных ВТЛЧ-IIIв клеток Н9, как описано Попович с сотр. (Popovic et al. 1984).

Радиоактивномеченый вирус готовили следующим образом. Двухнедельные клетки Н9, инфицированные ВТЛЧ-IIIв (Попович с сотр. Popovic et al. 1984), инкубировали в течение 2 дн в среде, содержащей 50 нКи/мл [₃₅S]-метионина. Свободную от клеток жидкость получали низкоскоростным центрифугированием (4000хГ; 10 м/ мин; 4^oC). Ее затем диализовали против 0,1 М трис-HCL буфера (pH 7,4; 0,1 N NaCL, 0,001 M ЗДТУ) в течение 5 ч при 4^oC и вирусные частицы собирали центрифугированием при 30000 об./мин в центрифуге Beckman Ti-45 в течение 2 ч при 4^oC. Полученную пилюлю центрифугировали с 3 мл линейным градиентом сахарозы в течение 24 ч, как описано (Попович с сотр. Popovic et al. 1984); отбирали фракции в диапазоне плотностей от 1,18 до 1,15 г/мл. Удельная радиоактивность изменялась между 1,3 и 2,9·10^-16 Ки-вирион. Количество частиц подсчитывали с помощью электронной микроскопии (Попович с сотр. Popovic et al. 1984). Для приготовления вирионов применяли вторую методику очистки Никоденц-метод (Nyco) градиентного центрифугирования (Вилмер с сотр. 1984). После этой процедуры удельная активность препарата вируса, как было показано, идентична удельной активности, полученной центрифугированием в градиенте сахарозы. Это является одним доказательством того, что клеточные мембраны совместно не осаждались с вирусными частицами.

Клетки и вирусное заражение Т-клетки человека линий МТ-2 (Харада и др. Harada et al. 1985), СЕМ (Нара и Фишингер, Nara и Fischinger, 1988), АТН8 (Мицуя и Бродер, Nitsuya и Broder, 1986) и Н9 (Попович с сотр. Popovic et al. 1984), и соматическую клеточную гибридную культуру между СЕМ и B клетками линии 174 (Конг и др. Kong et al. 1988) выращивали в среде PPMI 1640, дополненной 15%-ной фетальной сывороткой теленка (Мюллер и др. Muller et al. 1988). Культуры выдерживали при 37^oC в увлажненной атмосфере при 5%-ном содержании CO₂ в воздухе.

Заражение ВИЧ-1 Клетки рутинным порядком высеивали при концентрации 1 х 10⁵ клеток/мл и добавляли вирус ВИЧ-1, получая многочисленность заражения (МЗ) 0,03 средней инфекционной дозы клеточной культуры (TCID₅₀) на МТ-2 клетке и 0,12 TCID₅₀ на СЕМ или U 937. Клетки инкубировали в присутствии или в отсутствие испытуемых веществ в течение 7 дн. В течение этого времени незараженные МТ2 клетки претерпели 2,91 шага удвоения, СЕМ клетки 2,14 удвоения, а U 937 клетки 1,93 удвоения. Зараженные клетки подвергались следующим шагам удвоения: МТ-2/ВТЛЧ-IIIb: 0,09, СЕМ/ВТЛЧ-IIIb: 0,04 и U 937/ВТЛЧ-IIIb: 0,08.

Если не упоминается иначе, очищенную кондиционированную жидкость культуры ВИЧ-1 предварительно обрабатывали (30 мин при 36^oC) различными веществами и добавляли к клеткам, получая концентрации указанного вещества и вируса. Препарат вируса предварительно инкубировали вместе с веществом в объеме 100 мкл и следовательно, при большей в 10 раз концентрации, чем вещество в конце концов присутствовало в эксперименте с клеточной культурой.

Заражение ВИЧ-2 Клетки СЕМ х 174, продуцирующие ВИЧ-2^ST, и клетки U 937, продуцирующие ВИЧ-2_MS, облучали дозой 10000 рад затем совместно культивировали с 2 х 10⁵ клетками АТН8 при плотности конечного испытательного объема 4 х 10⁴ клеток/мл. После 7 дн инкубации живыми оставались только клетки АТН8, и оценивали их плотность. Испытуемое вещество добавляли к облученным клеткам за 30 мин до введения клеток АТН8. В незараженном контроле клетки АТН8 подвергались 2,01 шагам удвоения в течение семидневной инкубации.

Оценивание.

Концентрации клеток оценивали рутинным способом с использованием XTT калориметрической испытательной системы (Скудиеро и др. Scudiero et al. 1988) с последующим оцениванием ELISA-считывателем (Bio-Rad), модель ≠ 3550, оборудован программой NCIMR IIIв). Для стандартизации кривых роста клетки подсчитывали с помощью электроники (Счетчик Cytocomp; модель Михаэлис). Число шагов удвоения определяли как описано (Мюллер и др. Muller et al. 1975).

50% -ная цитозащитная концентрация (IC₅₀) представляет собой концентрацию, при которой скорость роста ВИЧ-инфицированных клеток достигает 50% от скорости роста незараженных клеток за семидневный период инкубации; 50%-ная цитотоксическая концентрация (IC₅₀) представляет собой концентрацию, при которой скорость роста ВИЧ-инфицированных клеток уменьшилась на 50% эта величина обычно подобна величине TC₅₀ незараженных клеток. 50%-ные значения оценивали с помощью логит (logit)-регрессии (Сашс, Suchs, 1984). Противовирусный индекс (AI) вычисляется из отношения TC₅₀: IC₅₀.

Испытание индукции синцитиума.

Это испытание проводили как описано (Мэттьюз и др. Matthews et al. 1987). Клетки Н9, зараженные ВТЛЧ-IIIв, в количестве 1 х 10⁵ смешивали с 1 х 10⁵ незараженных клеток Jurlcat в конечном объеме 100 мкл в присутствие или отсутствие вещества. Через 5 и 24 ч полуколичественно подсчитывали (Лифсон и др. Lifson et al. 1986) образующиеся синцитиумы (определенные как >4 ядер внутри обычной мембраны клетки): -, нет синцитиумов; 1 +; редкие маленькие синцитиумы; 2 +; многочисленные синцитиумы средних размеров; 3 +; большие синцитиумы в большинстве, но не во всех полях под микроскопом (увеличение 400 х); и 4 +; многочисленные большие синцитиумы во всех исследованных полях.

Исследования связывания вирус клетка.

1 х 15⁵ клеток МТ-2 суспендировали в 1 мл буфера анализа связывания (20 мМ фосфата Na, 1 мМ CaCl₂, 130 мМ NaCl, 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (Мюллер и др. Muller et al. 1982). Затем добавляли 20 мкл меченого вируса (приблизительно 25 х 10⁴ g пм/испытание (окончательно) и инкубировали в течение от 0 до 60 мин при 37^oC в 5% СО₂. Клетки впоследствии промывали центрифугированием (2000 х г; 10 мин; 4^oC) и подсчитывали радиоактивность.

Где указано, препарат вируса (20 мкл) предварительно инкубировали в течение 1 ч при 4^oC с 10 мкл раствора лектина из Narcissus и затем добавляли к клеткам.

Исследования связывания.

Связывание с незараженными МТ-2 клетками или МТ-2 клетками, зараженными ВТЛЧ-IIIв (заражение проводили в течение 3 дн как описано ранее), определяли сходно. МТ-2 клетки (1 х 10⁵) в конечном объеме 1 мл связывающего буфера предварительно инкубровали в течение 30 мин при 4^oC. Затем суспензию клеток промывали дважды центрифугированием (2000·g; 10 мин; 4^oC) клетки инкубировали (1 ч при 4^oC) в 1-мл объеме в присутствии или в отсутствие 1 мМ Ca²⁺ с НПЛ. Окончательно промывали дважды связывающим буфером с помощью центрифугирования и определяли ассоциированную с клетками радиоактивность. Нулевое значение (проба без клеток, но в присутствии Ca²⁺) давала 50 g пм мл.

Анти-ВИЧ активность лектина из Narcissus.

Первоначально лектин из Narcissus испытывали на анти-ВИЧ активность, применяя пробу на цитозащиту; плотность клеток определяли с помощью ХТТ тетразолин/формазанового анализа. Как показано в табл. 1, манноза-специфический лектин из Narcissus демонстрирует значительный анти-ВИЧ-1 цитизащитный эффект с А1 между >14 и >46. Величины А1 в системах СЕМ х 174/ВИЧ-2_ST и U937/ВИЧ-2_MS, как было определено, равны >15 и >12 соответственно. Кроме того, НПЛ не проявляет цитотоксических свойств вплоть до 100 мкг/мл, тогда как АЗТ вызывает 50% -ный цитотоксический эффект при концентрациях примерно 9 мкг/мл (табл. 1). С целью сравнения в табл. 1 приведена ингбирующая активность АЗТ по отношению к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Ингибрование образования синцитиумов лектином из Narcissus.

Добавление лектина из Narcissus в ходе периода совместной инкубации клеток Jurkat с клетками H9, продуцирующими ВЛТЧ-IIIв, к пробе индукции синцитиумов сильно тормозило образование синцитиумов (табл. 2). При концентрации лектина 3 мкг/мл образование синцитиумов не было зафиксировано.

Ингбирование связывания ВИЧ-1 с клетками МТ-2 лектином из Narcissus.

Кроме того, добавление лектина из Narcissus (20 мкг/мл) практически полностью устраняло связывание частиц ВИЧ-1 (ВЛТЧ-IIIв) с клетками МТ-2. Фиг. 1 показывает влияние лектина из Narcissus на связывание ВИЧ-1 с клеткам МТ-2. [³⁵S] метионин-меченый ВИЧ-1 (ВЛТЧ-IIIв) инкубировал с клетками МТ-2 либо в отсутствие другого дополнительного соединения, либо в присутствии 20 мкг/мл лектина из Narcissus. Образцы отбирали через 0 60 мин и определяли, как описано, радиоактивность, связанную с МТ-2 клетками.

Этот пример демонстрирует функционирование НПЛ в связывании с ВИЧ и в предотвращении заражения клеток ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Влияние лектина из Narcissus на связывание ВИЧ-1 с клетками МТ-2 показано на фиг. 1 [³⁵S] метионин-меченый ВИЧ-1 (ВЛТЧ-IIIв) инкубировали с клетками МТ-2 либо в отсутствие другого дополнительного соединения (линия), либо в присутствии 20 мкг/мл лектина из Narcissus (линия Х). Образцы отбирали после 0 60 мин и определяли связанную с МТ-2 клетками радиоактивность как описано в примере.

Фиг. 2 графически иллюстрирует генерацию внутреннего образа антиидиотопичных антител для использования в лечении против заражения ВИЧ. НПЛ лектин показан как 10 и способен связываться с оболочкой гликопротеина вируса ВИЧ 12 через рецепторные участки 14, 16. Следовательно, лектин можно ввести в мышь-реципиента, которая создает антитела против лектина 18. Некоторые из этих антител 18 имитируют место специфической адсорбции (рецепторный участок) гликопротеина оболочки вируса; их отделяют с помощью аффинной хроматотографи и их способности приводить к антиидиотопичным антителам, которые имитируют лектин, как описано Вейлером и др. Wieler et al. в 1990; Journal of General Virology.

Отделенные антитела затем можно использовать в качестве вакцины или иммунзировать генетически идентичных мышей 20 для того, чтобы получить анти-антилектиновые антитела для лечения зараженных пациентов. Иначе отделенные антитела можно использовать для получения анти-антилектиновых антител путем культивирования in vitro с клетками из селезенки мыши.

Также можно использовать НПЛ-соединения для выращивания вакцины против ВИЧ или подобных вирусов, очищая соединения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или аффинной хроматографии и используя их для выращивания муриновых антител подходящим иммунизационным способом.

Если продукты имеют низкую активность, их также можно присоединить к белкам-носителям перед иммунизацией, или, при неудаче этого, использовать для иммунизации муриновых клеточных линий in vitro (Вау и др. Vaux et al. Nature, 336, 36 42).

Антитела, которые имитируют внутренний образ вирусного рецепторного участка, затем можно отделить с помощью аффинной хроматографии и/или по способности продуцировать активные антиидиотипичные антитела (Вейлер и др. Veiler et al. 1990; Journal of General Virology, в печати).

Наконец, вакцину можно назначать подходящим путем вместе с иммуностимулирующими комплексами или другими помощниками (адъювантами) (Такахаси и др. Takahashi et al. 1990; Nature, 873 875).

Переходя к фиг. 3, вирус 24, который связывается с участком на мембране-хозяине 28, можно использовать как иммуноген для получения библиотеки антивирусных моноклональных антител 22 в мыши. Моноклональное антитело 22 против рецепторного связывающего участка на вирусе 24 выбирают вследствие его нейтрализующей способности. При впрыскивании антивирусного моноклонального антитела 22 в генетически однородную мышь-реципиента продуцируются анти-антитела (антиидиотипичные антитела) 26 со специфичностью к антигенному связывающему участку 28 антивирусного моноклонального антитела 22. Субнабор антиидиотипичных антител 26 будет обладать конформационными сходствами с рецепторным связывающим участком первичного вируса. Такие "внутреннеобразные" антиидиотипичные антитела 26, следовательно, взаимодействуют с рецептором мембраны клетки.

Кроме того, иммунизация такими "внутреннеобразными" антиидиотипичными антителами 26 приведет к анти-антиидиотипичным антителам, некоторые из которых специфически взаимодействуют со связывающим участком на вирусе 24.

Например, как только лектин был очищен, его можно впрыснуть в мышь, которая продуцирует антилектиновые антитела. Эти антитела можно использовать целым рядом способов, например, для иммунизации второй мыши in vivo или in vitro путем отбора клеток из селезенки мыши и культивирования in vitro.

Далее будут даны другие примеры для иллюстрации использования изобретения в диагностике.

Пример 2. Лектин из растения Narcissu pseudonarcissus можно выделить как описано Вам Даммом с сотр. Van Damme et al. 1988. Этот лектин специфично распознает D-маннозу.

Обнаружение его как диагностика достигалось с помощью двойной гель-диффузионной пробы по Оухтерлони (Ouchterlony O. Acta Padnol. Microbiol. Scand. 26: 507, 1949). 1%-ный агар в физиологическом растворе распределяли на стеклянных блюдах и давали затвердеть. После этого отштамповали две лунки диаметром 3 мм на расстоянии 7 мм друг от друга. В одну лунку поместили 20 мкл лектина (2 мкг/мл), а в соседнюю 20 мкл вирусного белка (2 мкг/мл). Выбранный вирусный белок был белком др120 из ВИЧ-1; др120 выделяли как описано Мэтюзом с сотр. Matthews et al. 1987. Блюдо оставляли на 2 дн при комнатной температуре во влажной комнате, после чего была ясно видна линия осаждения. Образование такого осадка является четким указанием типичной реакции специфического распознавания.

Пример 3. Вирус ВИЧ и его компоненты специфически взаимодействуют с лектином в двойном гель-диффузионном тесте. В этом примере демонстрируется, что лектин из Narcissus можно включить в диагностическую процедуру.

Лунки полистирольной пластины для микротитрования (96 лунок с ровным дном) заполняли 100 мкл раствора лектина из Narcissus (20 мкг/мл в физиологическом растворе). Пластины инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре. Лунки затем промывали 0,5% -ным водным раствором. Твин 80 (моноолеатом полиоксиэтиленсорбитана), содержащим 0,1 М NaCl и 0,02 М трис [гидроксиметил] аминометана, pH 7,4. Твин 80 получали из Sigma, St. Lonis, MO, USA, для удаления несвязанного лектина. Лунки затем заполняли 100 мкл исследуемого раствора (смотри ниже; сывороткой пациента, больного СПИДом, или раствором ВИЧ-1 белка др120). После инкубации в течение 8 ч при комнатной температуре лунки снова промывали тщательно (3 х 5 мин) указанным выше раствором Твин 80 для удаления несвязанного материала. После этого в лунки добавляли 100 мкл поликлонального антитела против ВИЧ-1 специфического др120 (поликлональное антитело выращивали в кроликах, получали из Fa Biochrome, Берлин). Антитело, используемое в данной процедуре, биотинировали; его использовали в концентрации 10 нг/мл. После инкубации при комнатной температуре в течение 60 мин лунки снова промывали раствором Твин (3 х 5 мин) и инкубировали с 100 мкл раствора авидинпероксидазы 1:500 (Sigma Ltd.) в течение еще 60 мин. Лунки затем промывали раствором Твин (3 х 5 мин) и заполняли 100 мкл субстрата пероксидазы. Этот субстрат состоял из 0,03%-ного водного раствора пероксида водорода и этанольного 8 мМ раствора 4-хлор-1-нафтола (смесь 1:1). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью фотометра измеряли поглощение на длине волны 414 нм. В табл. 3 приведены результаты типичного эксперимента.

Пример 4. Включение лектина из Narcissus pseudonarcissus в основанный на ВИЧ-белке анализ захвата.

Поливинилхлоридные 96-тилунковые пластины для микротитрования (costar) покрывали 0,1 мл ВИЧ-белка [10 мкг/мл в буфере 0,1 М карбоната натрия (pH 9,6)] После инкубации в течение 12 ч при 4^oC во влажной атмосфере раствор белка удаляли и лунки заполняли разбавительным буфером (3%-ный бычий сывороточный альбумин в фосфатном солевом буфере (ФСБ) с добавками 1 мМ CaCl₂ и 0,02% азида Na). После дальнейшей инкубации в течение 2 ч при 20^oC пластины дважды промывали ФСБ.

После этого пластины инкубировали со 100 мкл тест-раствора антигена в течение 2 ч при 37^oC. Тест-раствор антигена составляли из 50 мкл постоянного количества соединенного щелочной фосфатазой лектина из Narcissus pseudonarcissus НПЛ (5 нг) и 50 мкл увеличивающихся концентраций свободного др120 (от 0 до 10 нг) в разбавительном буфере (смотри выше). Тест-раствор, составленный из НПЛ и свободного др120, предварительно инкубировали (2 ч; 20^oC) во влажной атмосфере перед добавлением к покрытым ВИЧ-белком лункам.

В одной из серий экспериментов 50 мкл соединенного ферментом НПЛ вначале добавляли к покрытой лунке. После стадии промывки ФСБ 50 мкл свободного др120 добавляли через 10 мин в данной последовательности.

После инкубации покрытых ВИЧ-белком пластин (I) с образцом предварительно инкубированного материала [НПЛ и свободный др120] или (II) после последовательного добавления компонентов (вначале инкубация пластин с НПЛ и после стадия промывки др120) в течение 60 мин при 37^oC лунки дважды промывали 0,05% -ным раствором Твин 20 в ФСБ и затем дважды 10 мМ раствором диэтаноламина (pH 9,5), содержащим 0,5 мМ MgCl₂. После высушивания пластин добавляли 50 мкл щелочного раствора субстрата (п-нитрофенилфосфата). Реакцию прекращали путем введения 50 мкл 0,1 М Э ТУ и измеряли поглощение при 405 ни в ELISA-считывателе.

Фиг. 4. Калибровка основанного на ВИЧ-белке анализа захвата. Покрытие ВИЧ-белком лунки пластин для микротитрования инкубировали с постоянным количеством соединенного щелочной фосфатазой НПЛ (лектина из Narcissus pseudonarcissus) (5 нг) и увеличивающимися количествами свободного др120 (от 0 до 10 нг). Компоненты добавляли двумя различными способами: (I) НПЛ и др120 вначале преинкубировали и затем добавляли к покрытым лункам [НПЛ/др120 (преинк.)] или (II) компоненты добавляли последовательно, т.е. вначале к покрытым лункам добавляли НПЛ, а затем добавляли др120 [НПЛ + др120 (посл.)] После инкубации и последующего добавления раствора субстрата щелочной фосфатазы количественно путем измерения поглощения в ELISA-считывателе определяли иммунокомплексы, связанные с твердой подложкой. Приведены средние значения из пяти параллельных экспериментов; среднеквадратичное отклонение было менее 12% Литература.

Ezerkovitz R. A. Kuhman M. Groopman J.E. and Byrn R.A. (1989). Человеческий сывороточный манноза-специфический белок ингибирует in vitro заражение вирусом иммунодефицита человека. Journal of Experimental Medicine, 169, 185 196.

Harada S. Koyanagi Y. and Yamamoto N. (1985). Заражение HTL V-III в несущих HTL V-I клетках МТ-2 и МТ-4, и использование в анализе бляшек. Science, 229, 563 566.

Kanki P. Barin F. und Essen M. (1988). Реакционная способность антител к множественным ВИЧ-2 изолятам. Четвертая Международная конференция по СПИДу; Стокгольм, Резюме 1659.

Kong L.I. Lee S.W. Kappes J.C. Parkin J.S. Decker D. Hoxie J.A. Hahn B. H. and Shaw G.M. (1988). Западноафриканский родственный ВИЧ-2 человеческий ретровирус с ослабленной цитопатичностью. Science, 240, 1525 - 1529.

Lifson J. Contres, Huang E. and Engleman E. (1986). Роль карбогидрата гликопротеина оболочки в инфекционности вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вызываемого вирусов слияния клеток. Journal Experimental Medicine, 164, 2101 2106.

Matthews T. J. Weinhold K.L. Lyerly H.K. Langlois A.J. Wigzell H. and Bolognesi D. P. (1987). Взаимодействие гликопротеина др120 оболочки вируса T-клеточной лимфотропии человека типа IIIв и поверхности антигена CD4; роль карбогидратов в связывании и слиянии клеток. Труды национальной Академии наук, США 84, 5424 5428.

Mitsuya H. and Broder S. (1986). Ингибирование инфекционности in vitro и цитопатического эффекта вируса T-лимфотропии человека типа III/лимфоденопатия-связанного вируса (HTL Y-III/AY) с помощью 2', 3'-дидеоксинуклеозидов. Труды национальной Академии наук, США 83, 1911 1915.

Muller W.E.G. Rohde H.J. Steflen R. Maidhof S. Zahu R.K. and Umezawa H. (1975). Влияние формицина-B на синтез полиаденозинфосфорибозы in vito и in vivo Cancer Research, 35, 3673 3681.

Muller W. E. G. Schuster D.K. Zahn R.K. Maihof S. Leyhausen G. Falke D. Koren R. and Umezawa H. (1982). Свойства и специфичность связывающих участков для иммуномодулирующего бестатина на поверхности клеток млекопитающего. International Journal of Immunopharmacology, 4, 393 400.

Muller W. E. G. Renneisen K. Kreuter M.H. Schoder H.C. and Winkler. (1988). Манноза-специфиический лектин из Gerardia savadia блокирует связывание вируса иммунодефицита человека типа I с клетками H9 и человеческими лимфоцитами in vitro. Journal of Agured Immune Deficiency Syndromes, 1, 453 - 458.

Nara P.L. and Fischinger P.J. (1988). Количественный анализ зараженности для ВИЧ-1 и -2 Nature, 332, 469 470.

Poiesz D.J. Ruscetti F.W. Gazdar A.F. Bunu P.A. Minna J.D. and Gallo R. C. (1980). Обнаружение и выделение частиц ретровируса типа С из свежих и культивированных лимфоцитов пациента с лимфомой Т-клеток кожи. Труды национальной Академии наук, США, 77, 7415 7419.

Popovic M. Sarngadharar M.GG. Read E. and Gallo R.C. (1984). Обнаружение, выделение и непрерывное продуцирование цитопатических ретровирусов (HTI Y-III) из больных СПИДом и преСПИДом. Science, 224, 497 - 500.

Sachs (1984). Angewandte Stati Stik Berlini springer verlang, pp. 209 - 216.

Schvoder H. C. Wenger R. Kuchino Y. and Muller W.E.G. (1988). Модуляции метаболизма ядерного матрица-ассоциированного (2' 5') олигоаденилата и активности рибонуклеазы L в клетках H9 вирусом иммунодефицита человека. Journal of Biological chemistry, 264, 5669 5673.

Scudiero D.A. Shoemaker R.H. Panll K.D. Monks A. Tiernoy S. Nofziger T. H. Currens M.Y. Seniff D. and Boyoi M.R. (1988). Оценка фактора роста клеток и чувствительности к лекарствам в культуре, использующей человеческий и другие опухолевые линии, с помощью растворного тетразолин/формазанового анализа. Cancer Research, 48, 4827 4833.

Van Damme E.J.M. Allen A.K. and Peumans W.J. (1988). Родственные манноза-специфические лектины из различных видов семейства Amaryllidaceae physiologia planterum, 73, 52 57.

Vilmer E. Barre-Sinoussi F. Rouzioux C. Gazendel C. Brun F.V. Danguet C. Fischer A. Manigue P. Chermann J.C. Griscelli C. and Montaguier L. (1984). Выделение нового лимфотропного ретровируса из двух потомков одних родителей с гемофилией В, одного со СПИДом. Lencet I. 753 757.

Формула изобретения

1. Применение маннозоспецифического лектина, полученного из луковицы растения семейства Amaryllidaceae для производства медикаментов для лечения РНК вирусов, содержащих гликопротеины с Ман (альфа 1_→3) Ман или Ман (альфа 1_→6) Ман связями.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лектин получают из растения рода Narcissus.

3. Вакцина против вирусов ДНК, содержащих гликопротеины с Ман (альфа 1_→3) Ман или Ман (альфа 1_→6) связями, отличающаяся тем, что вакцина содержит антитело против лектина, которое связано с маннозоспецифическим лектином, полученным из луковицы растения семейства Amaryllidaceae.

4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что антитело против лектина связано с лектином, полученным из растения рода Narcissus.

5. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что указанным вирусом является вирус HIV или HTLV.

6. Способ получения вакцины, содержащей антитела против лектина, против вирусов РНК, содержащих гликопротеины с Ман (альфа 1_→3) Ман или Ман (альфа 1_→6) Ман связями, отличающийся тем, что включает получение маннозоспецифического лектина из луковицы растения семейства Amaryllidaceae и контактирование лектина со средствами, производящими антитела так, чтобы производились лектиновые антитела.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что антитело против лектина связано с лектином, полученным из растения рода Narcissus.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанным вирусом является вирус HIV или HTLV.

9. Терапевтический агент для лечения пациентов с РНК вирусами, содержащими гликопротеины с Ман (альфа 1_→3) Ман или Ман (альфа 1_→6) связями, отличающийся тем, что указанный агент включает антитело к лектиновому антителу, которое связывается с лектиновым антителом, которое связывается с маннозоспецифическим лектином, полученным из луковицы растений семейства Amaryllidaceae, причем указанное антитело к лектиновому антителу мимикрирует лектин.

10. Терапевтический агент по п. 9, отличающийся тем, что манозоспецифический лектин получен рода Narcissus.

11. Способ обнаружения компонентов РНК вирусов, содержащих гликопротеины с Ман (альфа 1_→3) Ман или Ман (альфа 1_→6) Ман связями, отличающийся тем, что из растения семейства Amaryllidaceae выделяют лектин, специфически связанный с маннозой, указанный лектин контактирует с образцом, содержащим компоненты, подлежащие обнаружению, затем определяют, происходит ли связывание указанного лектина с указанными компонентами.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию определения количества компонентов, связанных с указанным лектином, сравнением с известным стандартом.

13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что указанный лектин конъюгирован с ферментом и далее субстрат для фермента подвергают воздействию указанным лектином и компонентами и относительное количество компонентов, связанных с указанным лектином, определяют измерением воздействия указанного фермента на указанный субстрат и сравнивают указанное воздействие с известным стандартом.

14. Способ по любому из пп. 11 13, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию воздействия на указанный лектин и компоненты антитела, конъюгированного с энзимом, и последующее воздействие на указанное антитело и лектин и компоненты субстратом для указанного фермента, причем относительное количество компонентов, связанных с указанным лектином, определяют измерением воздействия указанного фермента на указанный субстрат и сравнением указанного воздействия с известным стандартом.

15. Способ по любому из пп. 11 14, отличающийся тем, что указанный лектин выделяют из луковицы растения семейства Amaryllidaceae.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 26.10.2000

Извещение опубликовано: 20.10.2004        БИ: 29/2004

---