Питательная среда для культивирования анаэробов

 

Использование: питательная среда, культивирование анаэробов, биотехнология. Сущность изобретения: среда включает глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы B на основе дрожжей, триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат аммония, сульфат магния, хлорид натрия, пируват натрия, сукцинат натрия, карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу, полиглюкин и дистиллированную воду при определенных соотношениях ингредиентов. Предлагаемая питательная среда обеспечивает большой выход колоний. Другим преимуществом является отсутствие в рецептуре среды вносимых extempore дефицитных компонентов, что повышает удобства использования среды. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении первичной питательной среды для культивирования и выделения анаэробов в клинико-диагностической лаборатории.

Для культивирования анаэробных бактерий используют среду Вилкинса-Чалгрена, включающую панкреализаты казеина и желатина, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлористый натрий, l-агринин, пируват натрия, агар, гемин, витамин K1 и дистиллированную воду [1] среду Клаузена, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, соевый пептон, глюкозу, хлориды натрия, кальция и магния, динатрийфосфат, цитрат, дитионат и бифосфат натрия, l-цистин, l-аспарагин, лецитин, сульфаты магния, кобальта, железа и цинка, твин-80, агар и дистиллированную воду [2] Однако данные среды содержат дефицитные и дорогие ингредиенты.

Известно также использование для культивирования анаэробов среды Шадлера [3] содержащей панкреализат сои, пептон, дрожжевой экстракт (в качестве источника витаминов группы B), глюкозу, цистеин, гемин, агар, трис-буфер и дистиллированную воду при следующих соотношениях ингредиентов, г/л: Панкреализат сои 10,0 Ппептон 5,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Глюкоза 5,0 Цистеин 0,4 Гемин 0,01 Агар 13,5 Трис-буфер 0,75
Дистиллированная вода Остальное
При использовании этой среды в нее дополнительно ex tempore стерильно вносят 10 мкг/мл менадиона (витамина K1) и 5 об. крови (Каталог фирмы Oxoid, Великобритания, 1991; Morello G.A. Graves M.H. Clinical Anaerobik Bacteriology. -Laboratory Management, 1977, 15, 4, 20-21, 24-25, 51), что и является ее недостатком. Кроме того, на данной среде имеет место низкий рост некоторых видов анаэробов (B.fragilis, B.thetaiotamicron и др.).

Целью изобретения является повышение удобства использования среды.

Указанная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования анаэробов, включая глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы B на основе дрожжей и дистиллированную воду, дополнительно содержит триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат и гидрофосфат калия, сульфаты аммония и магния, хлорид, пируват, сукцинат и карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу и полиглюкин при следующих соотношениях ингредиентов,г/л:
Глюкоза 1±0,5
Цистеин 2±1
Гемин 0,2±0,1
Менадион 0,001±0,0005
Агар 11±2
Источник витаминов группы B на основе дрожжей 9±4
Триптический гидролизат казеина (ТГК) 15±3
Пептический гидролизат казеина (ПГК) 8±3
Аминопептид 3±1
Дигидрофосфат калия 0,5±0,2
Гидрофосфат калия 0,5±0,2
Сульфат аммония 0,5±0,2
Сульфат магния 0,2±0,1
Хлорид натрия 0,8±0,3
Пируват натрия 1,5±0,5
Сукцинат натрия 1,2±0,2
Карбонат натрия 2,3±0,4
Крахмал 1±0,5
Мальтоза 1±0,5
Арабиноза 1±0,5
Фруктоза 1±0,5
Полиглюкин 5±1
дистиллированная вода остальное.

В качестве источника витаминов группы B на основе дрожжей может использоваться экстракт кормовых дрожжей (ЭКД), как в прототипе, либо триптический гидролизат кормовых дрожжей (ТГКД).

В предлагаемой прописи принципиально одновременное использование триптического и пептического гидролизатов казеина. В противном случае имеет место низкий рост микробных культур анаэробов, что происходит, по-видимому, из-за различного аминокислотного состава этих гидролизатов и поясняется данными табл.1.

В табл.1 проиллюстрирована также неприемлемость использования кислотного гидролизата казеина.

Содержание аминного азота в сухих гидролизатах казеина, мас.

Кислотном 3,0
Триптическом 3,2
Пептическом 1,5
Посевная доза 1 млн./мл. Содержание остальных ингредиентов среды равно номинальным значениям, указанным на с.2. Микробные культуры выращивают в анаэростате в газовой среде азота (80%), водорода (10%) и углекислого газа (10%) в течение двух суток при 37^oC.

Способ получения гидролизата казеина влияет также на морфологию микробных колоний. При использовании смеси триптического и пептического гидролизатов колонии находятся в S-форме, тогда как при использовании кислотного гидролизата 60-70% колоний имеют R-форму.

Пример 1. Готовят пять вариантов питательной среды путем смешивания в шаровой мельнице следующих сухих ингредиентов: пептического и триптического гидролизатов казеина (с вышеуказанным содержанием аминного азота), экстракта кормовых дрожжей, аминопептида, дигидрофосфата и гидрофосфата калия, сульфатов аммония и магния, пирувата, сукцината и хлорида натрия, глюкозы, крахмала, мальтозы, арабинозы, фруктозы, цистеина, полиглюкина, гемина, менадиона и агара с последующим растворением в дистиллированной воде. Ингредиенты смешивают из расчета получения вариантов среды, указанных в табл.2. Среды стерилизуют автоклавированием при 121^oC в течение 15 мин.

На данные среды, разлитые в чашки Петри, засевают по 0,1 мл анаэробных культур с концентрацией микробных клеток 0,1 млн./мл. Микробные культуры выращивают анаэростате в газовой среде азота (80%), водорода (10%) и углекислого газа (10%) в течение двух суток при 37^oC. Для каждой культуры используют по три чашки Петри. Выросшие культуры окрашивают по Граму и микроскопируют.

Результаты культивирования приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, интенсивный рост колоний имеет место только при заявленном диапазоне концентраций ингредиентов питательной среды (среды NN 2-4), тогда как при запредельных концентрациях (среды NN 1 и 5) количество выросших колоний существенно меньше.

Пример 2. Предлагаемую среду готовят, как в примере 1, при номинальном значении концентраций ингредиентов (указаны на с.2). В качестве источника витаминов группы B здесь используют триптический гидролизат кормовых дрожжей (ТГКД).

Посевной материал засевают в чашки Петри с приготовленной средой и средой Шадлера (контроль), используя по три чашки на каждую культуру. Концентрации ингредиентов в прототипной среде Шадлера, в том числе добавляемых ex tempore крови и менадиона, указаны на с.1. На чашки засевают анаэробные культуры в низких дозах: 1 тыс. кл. для B. fragilis и Cl. perfringens, 100 тыс. кл. для B. asaccharalyticus и 10 тыс. кл. для остальных микробов. Условия культивирования как в примере 1.

Результаты выращивания приведены в табл.4.

Как видно из данных табл.4, предлагаемая питательная среда обеспечивает большой выход колоний по сравнению с прототипом (за исключением пептострептококка). Повышение выхода колоний статистически значимо по методу парных сравнений при p=0,05.

Другим преимуществом предлагаемой среды является отсутствие в ее рецептуре дефицитного компонента крови. Кроме того, обеспечена возможность заблаговременного приготовления среды, тогда как в прототипе кровь и менадион вносят ex tempore.

К преимуществу предлагаемой среды относится также расширение источников используемого для ее приготовления непищевого сырья.

Указанные виды положительного эффекта обеспечивают удобство использования предлагаемой питательной среды.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования анаэробов, включающая глюкозу, цистеин, гемин, менадион, агар, источник витаминов группы В на основе дрожжей и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит триптический и пептический гидролизаты казеина, аминопептид, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат аммония, сульфат магния, хлорид натрия, пируват натрия, сукцинат натрия, карбонат натрия, крахмал, мальтозу, арабинозу, фруктозу и полиглюкин при следующих соотношениях ингредиентов, г/л:
Глюкоза 0,5-1,5
Триптический гидролизат казеина 12-18
Цистеин 1-3
Гемин 0,1-0,3
Менадион 0,0005-0,0015
Агар 9-13
Источник витаминов группы В на основе дрожжей 5-15
Пептический гидролизат казеина 5-11
Аминопептид 2-4
Дигидрофосфат калия 0,3-0,7
Гидрофосфат калия 0,3-0,7
Сульфат аммония 0,3-0,7
Сульфат магния 0,1-0,3
Хлорид натрия 0,5-0,11
Пируват натрия 1-2
Сукцинат натрия 1-1,4
Карбонат натрия 1,9-2,7
Крахмал 0,5-1,5
Мальтоза 0,5-1,5
Арабиноза 0,5-1,5
Фруктоза 0,5-1,5
Полиглюкин 4-6
Дистиллированная вода До 1 л5

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3