Штамм дрожжей candida famata - продуцент кормовой биомассы

 

Использование: биотехнология для получения белковой биомассы. Сущность: новый штамм дрожжей Candida famata ВКПМ У-2207, способный расти на смешанном углеводо-углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса (pH, температура) и обладающий высокой продуктивностью по биосинтезу белка, в результате чего повышена его конкурентоспособность по сравнению с аналогичными штаммами того же назначения. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штаммам дрожжей продуцентам кормовой биомассы.

Известен штамм дрожжей Candida edax (ВКПМ У-697) продуцент белковой биомассы на концентрированных гидролизных средах. Данный штамм был получен путем длительной селекции смешанных культур на концентрированных гидролизных средах. В результате культивирования дрожжей при температуре 37 39^oC, pH среды 4,2 4,5 с удельной скоростью роста 0,25 0,27 ч^-1 получают выход абсолютно сухих дрожжей от РB (редуцирующие вещества) 56% использование редуцирующих веществ 97% при концентрации РB 3% продуктивность 4,3 г/л в час, содержание общего белка в биомассе 57% истинного белка 48% Штамм обладает высокой продуктивностью, однако узкий диапазон технологических параметров процесса культивирования (pH, температура) и способность роста только на углеводном моносубстрате существенно ограничивают область его применения.

Достигаемый в результате осуществления предложенного изобретения технический результат заключается в получении штамма дрожжей, способного расти на смешанном углеводо- и углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса культивирования при одновременном повышении его конкурентоспособности в условиях нестирильного процесса культивирования.

Указанный результат достигается за счет использования штамма дрожжей Candida famata, полученного в процессе промышленной автоселекции из числа изолятов, выделенных из биоценоза ферментора Кстовского опытно-промышленного завода белково-витаминных концентратов в период его работы на ферментолизате ржаной муки и пшеничных отрубей с добавлением н-парафинов.

Для выделения штамма дрожжевую суспензию, отобранную из ферментора, работающего в непрерывном режиме процесса культивирования в течение 3 месяцев, рассеивали на чашки Петри с сусло-агаром и отбирали изолированные колонии (изоляторы), которые далее проверяли на активность роста в колбах на качалке. В качестве углеводного субстрата использовали ферментолизат ржаной муки и пшеничных отрубей в соотношении 1:1, углеводородного н-парафина (1 об.), смешанного смесь ферментолизата с 0,2 об. н-парафинов. Температуру роста обеспечивали в интервале 34 43^oC.

Было испытано 50 изолятов, активность роста которых на ферментолизате составила 13,1 15,5 г/л абсолютно сухого вещества (АСВ), на н-парафине 1,3 13,6 г/л АСВ. 20 наиболее активных изолятов было использовано на смешанном субстрате, активность роста при этом составила 12,5 16,6 АСВ (см. таблицу).

Эти же изоляты были испытаны при различной температуре роста 37 - 43^oC, и была выявлена их толерантность, т.е. способность роста при повышенной температуре практически без снижения активности накопления биомассы.

Изолят дрожжей, имевший максимальные показатели по накоплению биомассы, был взят в качестве искомого изолята (рабочий шифр Кст. ФО 5/2-94).

Определение систематического положения отобранного штамма было проведено по монографии: Т.Н. Семушина, Н.И.Монахова, Л.А. Гусарова (Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства. М. 1975) и в соответствии с определителем дрожжей Крегер-ван-Рай (The Yeast. A taxonomyc stady. Ed. by Rreger-van-Rij. N.Y.W. Amsterdam, 1984). Установлено, что предлагаемый штамм относится к Candida famata и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки односуточной культуры на солодовом сусле (температура роста 32 34^oC) округлой формы, одиночные. Размер клеток 2,5х2,5 мкм. Аскопоры не образует. На картофельном агаре псевдомицеллий отсутствует.

Культуральные признаки. Колонии на солодовом сусло-агаре гладкие, белые с ровным краем. Штрих на солодовом сусло-агаре гладкий, ровный, беловатый. На каждом солодовом сусле кольцо слабое, пленка отсутствует, надосадочная жидкость со слабой мутью.

Физиологические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, 2-кето-глюконат, ксилозу, адонит, ксилит, галактозу, сорбозу, α -метил-D-глюкозид, N-ацетил-D-глюкозамин, мальтозу, трегалозу, мелецитозу, крахмал, парафин. Не ассимилирует: глицерин, арабинозу, инозит, целлобиозу, лактозу, раффинозу. Не сбраживает: глюкозу, раффинозу, сахарозу, лактозу, галактозу, мальтозу. Ассимилирует источники азота: сульфат аммония, аспарагиновую кислоту, пентон, мочевину (оч. слабо), нитрат калия (оч.слабо). В витаминах не нуждается при росте на углеводном субстрате. При выращивании на н-парафинах активность роста увеличивается при добавлении 0,5 об. дрожжевого авитолизата.

В результате санитарно-гигиенических исследований установлена непатогенность штамма.

Штамм Candida famata (Кст. ФО 5/2-94) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером У-2207.

Штамм Candida famata испытан в камеральных условиях периодического и непрерывного процессов культивирования в широком диапазоне pH среды (3,5 - 7,2), температуры роста 30 43^oC на ферментолизате муки и отрубей (при различном из соотношении), а также смешанном субстрате (ферментолизате с добавлением н-парафинов). Конкурентоспособность штамма в условиях нестерильного процесса выращивания оценивали путем высева суспензии на сусло-агар (чашки Петри), культивирования в течение 3 5 суток при температуре 43^oC и определения морфологии выросших колоний.

Пример 1. Штамм дрожжей Candida famata культивировали в периодическом режиме в аппарате "Абитекс" (рабочий объем 5,0 л) с автоматическим обеспечением температуры 30^oC, pH среды 3,5 при частоте перемешивания 900 об/мин и подаче воздуха 420 л/ч. Субстратом служил ферментолизат пшеничных отрубей, который готовили следующим образом: 5%-ную суспензию отрубей нагревали до 55 60^oC, добавляли в нее 0,5% фермента амилосубтилина и выдерживали в течение одного часа при перемешивании. Минеральное питание обеспечивали добавлением на 5 л среды (ферментализатора) 20 мл 20%-ного раствора сульфата аммония и 100 мл концентрированных солей следующего состава, г/л: H₃PO₄ (70%-ная) 52 мл; KCl 49; MgSO₄·7H₂O 35; FeSO₄·7H₂O 6,7; ZnSO₄·7H₂O 1,45; MnSO₄·7H₂O 0,85. Состав ферментолизата: азот общий 1,7% (на ABC), общие углеводы (определение фенольным методом) 80,7 г/л, редуцирующие вещества 13,1 г/л (без инверсии) и 30,2 г/л (с инверсией). Продолжительность процесса культивирования составила 8 часов. Содержание общих углеводов в культуральной среде в конце процесса 11,5 г/л, редуцирующих веществ (без инверсии) 0,5 г/л, т.е. потребление общих углеводов составило 85,7% и редуцирующих веществ 96,2% Содержание сырого протеина в готовом продукте 31,9% Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 100% Пример 2. Штамм дрожжей Candida famata культивировали в непрерывном режиме (удельная скорость роста Д 0,125 ч.^-1) в аппарате рабочим объемом 12 л на 14%-ном ферментолизате (ржаная мука 70% пшеничные отруби 30%). Ферментолиз вели с добавлением 0,5% амилосубтилина при температуре 65 - 70^oC в течение 2 часов при перемешивании. Минеральное питание осуществляли подачей раствора солей, г/л: аммофос 125; сульфат аммония 20; сульфат железа 3,6; сульфат цинка 1,6; сульфат марганца 0,8. Дополнительно при необходимости добавляли сульфат железа в концентрации 6,6 г/л. Титрование проводили 6%-ным раствором аммиака. Остаточное содержание в культуральной среде составляло, мг/л: азот 500 1000; фосфор 250 500; железо 20 40; калий 200 400; цинк до 10, магний 100 200; марганцец до 10. Условия выращивания: pH среды 5,5, температура 35^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в подаваемом ферментолизате составляло 94,5 г/л и 46,0 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составляло 7,3 и 5,0 соответственно, т.е. потребление общих углеводов и глюкозы составило 92,3% и 89,1% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте 26% сырого протеина 45% Расходный коэффициент (субстрат/готовый продукт) 1,2. Продуктивность 12,5 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 90% Пример 3. Штамм дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но pH среды был 4,5, температура роста 43^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на культивирование ферментолизате составило 95 г/л и 53 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде 11 г/л и 2 г/л соответственно, т.е. потребление общих углеводов составило 88,4% и глюкозы 96,2% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте 25% сырого протеина 43% Расходный коэффициент 1,4. Продуктивность 10,1 г/л в час. Доминирование штамма в биоценозе) составило 100% Пример 4. Штамма дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но pH среды был 7,2, температура роста 39^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на культивирование ферментолизате составило 91 г/л и 56 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составило 6 г/л, т.е. потребление общих углеводов составило 83,4% и глюкозы 89,3% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 25% сырого протеина 40,9% Расходный коэффициент 1,5. Продуктивность 10,9 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 100% Пример 5. Штамм дрожжей Candida famata культивировали по примеру 2, но в качестве субстрата использовали ферментолизат пшеничных отрубей (12%) и н-парафинов (2,18 г/л). pH среды 5,0, температура роста 39^oC. Содержание общих углеводов и глюкозы в подаваемом на культивирование ферментолизате составило 60,5 г/л и 22,2 г/л соответственно. Остаточное содержание общих углеводов и глюкозы в культуральной среде составило 10,1 г/л и 5,2 г/л, т.е. потребление общих углеводов и глюкозы было 83,3% и 76,5% Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 26,5% сырого протеина 42% Расходный коэффициент 1,5. Продуктивность 9,7 г/л в час. Конкурентоспособность (доминирование штамма в биоценозе) составила 95% Пример 6. Штамм Candida famata культивировали в непрерывном процессе в промышленном ферментере рабочим объемом 400 м³ в течение месяца с удельной скоростью роста 0,12 ч.^-1 на 14% ферментолизате ржаной муки (70%) и пшеничных отрубей (30%), полученном при обработке 0,5% амилосубтилином при 65 70^oC в течение 3-х часов при перемешивании. Условия выращивания: pH среды 4,0 4,2, температура 35 39^oC. Минеральное питание осуществляли по примеру 2. Содержание общих углеводов и глюкозы в поступающем на выращивание ферментолизате составляло 76 101 г/л и 40 48 г/л соответственно. Остаточное содержание азота в культуральной среде находилось в пределах 1500 3000 мг/л, фосфора 80 400 мг/л, общих углеводов 0,4- 1,7 г/л. Содержание истинного белка по Барнштейну в готовом продукте составило 30% сырого протеина 45% Расходный коэффициент 1,4. Продуктивность 13,3 г/л в час. Уровень сопутствующей бактериальной обсеменности на стадии ферментации был 10⁵ 10⁸ кл/мл, в готовом продукте 1·10⁴ кл/г. Доминирование (конкурентоспособность) штамма 100% Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штамм Candida famata способен расти на смешанном углеводо-углеводородсодержащем субстрате в широком диапазоне параметров процесса культивирования (pH среды 3,5 7,2; температура 30 43^oC), обладая при этом повышенной конкурирующей способностью в условиях нестерильного процесса культивирования.

Предложенное изобретение является новым, так как указанный штамм-продуцент кормового белка из уровня техники не известен.

Оно имеет изобретательский уровень, поскольку возможность получения указанного технического результата с использование штамма дрожжей Candida famata явным образом не следует из уровня техники.

Промышленная применимость изобретения подтверждена экспериментально.

Таким образом, данное изобретение удовлетворяет всем условиям патентоспособности.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Condida famata ВКПМ Y-2207 продуцент белковой биомассы.

РИСУНКИ

Рисунок 1