Гликогеновый полисахарид и способ его получения

 

Использование: к биотехнологии, а именно, при получении гликогеновых полисахаридов, практически свободных от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров. Сущность изобретения: проводят кипячение животной ткани с высоким содержанием гликогена в водном растворе сильного основания, охлаждение отвара, добавление некислотного летучего растворителя, смешивающегося с водой, отделение осадка фильтрованием и растворение осадка в воде, причем pH водного раствора осадка доводят до нейтрального значения, и раствор обрабатывают катионной смолой, фильтруют для отделения катионной смолы, обрабатывают летучим некислотным растворителем, смешивающимся с водой, с осаждением полисахарида, в основном свободного от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров, извлекаемого из раствора фильтрованием. 2 с. и 9 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к гликогеновым полисахаридам и к способам их получения. Более конкретно, изобретение относится к гликогеновым полисахаридам, практически свободным от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров.

Обычно используемый термин "гликоген" означает группу подобных, но не идентичных, гликопротеидов, широко распространенных у животных.

Наиболее исследованным гликогеном является гликоген, экстрагированный из печени кролика, и считается, что он является протеином (гликогенином), имеющим молекулярную массу примерно 37000 Дальтон, связанным гликозидной связью тирозина с высокоразветвленным полисахаридом глюкозы, имеющим молекулярную массу 10000000 Дальтон (бета-частица). Несколько бета-частиц, до 50, могут агрегировать вместе с получением соединения (альфа-частиц), имеющего молекулярную массу 500 000 000 Дальтон, которое является единицей природного гликогена (Д.Дж. Мэннерс, Carbohydrate Polymers 16, стр. 37-82, 1991).

Различные гликогены различных животных видов имеют, как давно известно, различную степень полисахаридного разветвления. Так, например, Стюарт А.С. Крэйг и др. (Carbohydrate Polymers 179, стр. 327-340,1988) описывают значительные различия в полисахаридном разветвлении гликогеновых образцов, извлеченных из млекопитающих и беспозвоночных животных.

Действительно, хотя в литературе описываются некоторые различные способы извлечения гликогена из животных тканей, они, главным образом, имеют две различных цели: i) количественное извлечение гликогена в аналитическом объеме для биохимии, т.е. извлечение, имеющее своей целью последующее количественное определение содержания гликогена в некоторой ткани; ii) извлечение образцов гликогена, минимизируя денатурирование исходного полимера, для последующих биохимических и конформационных исследований.

В результате, независимо от их происхождения, во всех типах коммерчески доступного гликогена всегда имеется некоторое количество азота (500-600 частей на млн), которое соответствует, по крайней мере, количеству, рассчитанному для гликопротеида (Д.Дж. Мэннерс и др, см. выше) В результате анализа литературы установлено заметное различие в точках зрения разных авторов, некоторые из которых считают указанное количество азота следами загрязнения, а другие считают его незначительной составляющей гликогена. С другой стороны, различные коммерческие источники не указывают никакого различия между гликопротеидным гликогеном и его полисахаридом.

В то время, как извлечение гликогена было тщательно исследовано, до сих пор мало внимания уделялось извлечению гликогенового полисахарида. Только старая статья описывает способ получения гликогеновых образцов, "свободных от азота", из печени крыс (М.Сомоджий, J.Biol. Chem. 104, 245, 1934) Однако, необходимо отметить, что в этом получении гликоген подвергается кислотной обработке в течение ночи, т.е. в условиях гидролиза гликогенового полисахарида. Кроме того, неизвестна чувствительность аналитического метода, используемого авторами для определения содержания азота.

Когда мы пытались использовать указанный метод, было установлено, что он плохо воспроизводится, и полученный продукт имеет небольшое, но разное количество азота и/или заметное количество восстанавливающихся сахаров (более 0,15%), как результат гидролитической деструкции.

Для гликогена было предложено различное фармацевтическое применение, особенно, в качестве мягчителя (JP-A-87-178505) и в качестве наполнителя для их свойств гидратирования (JP-A-88-290809) и в дерматологических препаратах против старения кожи (US-5093109).

Кроме того, было предложено использовать его в качестве питательной среды для микробов, которые дает молочная кислота, в фармацевтической форме для регулирования вагинального pH (EP-A-0257007). Однако, он не является достаточно стабильным, и он подобен следам протеинов, нуклеиновых кислот, и его фрагменты приводят к явлению чувствительности. Могут даже присутствовать следующие примеси.

Поэтому нашей целью было получение соединения, которое в значительной степени сохраняет структуру гликогенового полисахарида, а также обеспечивает максимальную нетоксичность и безопасность. Иначе говоря, соединение, которое свободно от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров.

После многих бесплодных попыток неожиданно было установлено, что водный раствор неочищенного гликогена, обработанный в течение достаточно длительного времени катионной смолой, переходит в раствор требуемого полисахарида. Полисахарид может быть затем легко осажден добавлением растворителя, смешивающегося с водой.

Таким образом, первым объектом данного изобретения является гликогеновый полисахарид, практически свободный от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров.

Используемое в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения выражение "практически свободный от азотных соединений, и восстанавливающихся сахаров" означает, что содержание азота, определенное по методу Кьельдаля, составляет менее 60 частей на млн, а содержание восстанавливающихся Сахаров, определенное по методу Ф.Д.Снелла и Снелл (Colorimetric Melhods of Analysis New Jork, 1954, т.III, стр. 204) составляет менее 0,25%.

Особенно интересными источниками гликогена являются Mytilus Edulis (съедобный моллюск) and Mytilus Gallus Provincialis (моллюск галльский провинциальный). Действительно, эти моллюски найдены в больших количествах при средней низкой стоимости и имеют достаточно высокое содержание гликогена. Таким образом, предпочтительным гликогеновым полисахаридом согласно данному изобретению является гликогеновый полисахарид, полученный из Mytilus Edulis and Mytilus Gallus Provincialis.

Однако данное изобретение не ограничивается гликогеновым полисахаридом из Mytilus Edulis and Mytilus Gallus Provincialis. Другие подходящие источники гликогена для получения соответствующего полисахарида согласно данному изобретению включают в себя другие моллюски, такие, как устрицы и Credipula Eornicata или органы позвоночных животных, богатые гликогеном, такие как печень и мышца.

Гликогеновый полисахарид данного изобретения дополнительно отличается содержанием углерода от примерно 44 до примерно 45%, молекулярной массой примерно (2,5 ± 0,1) · 10⁶ Дальтонов и (оптическая) вращательная способность (α)²_D⁰ = 197 ± 2,0 (c = 1 в воде).

Первая стадия способа получения гликогенового полисахарида данного изобретения осуществляется в соответствии с традиционной технологией, которая содержит кипячение выбранных тканей в водном растворе сильного основания, охлаждение полученного таким образом отвара (среды) и затем осаждение гликогена добавлением некислотного летучего растворителя, смешивающегося с водой.

Как уже известно, количество гликогена, содержащегося в различных тканях, изменяется в широких пределах не только с точки зрения ткани и животных частиц, но также, для той же животной ткани тех же частиц, с точки зрения различных других факторов, таких как состояние пищи и время года.

Таким образом, количество гликогена, извлеченного в соответствии с вышеуказанной обработкой, во многом зависит от количества, содержащегося в обработанных животных тканях.

Новая стадия способа данного изобретения состоит в регулировании pH раствора, полученного растворением указанного осадка в воде и затем обработкой раствора катионной смолой.

Таким образом, другим объектом данного изобретения является способ получения гликогенового полисахарида, практически свободного от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров, содержащий кипячение животной ткани с большим содержанием гликогена в водном растворе сильного основания, охлаждение полученного таким образом отвара, добавление некислотного летучего растворителя, смешивающегося с водой, отделение образовавшегося остатка фильтрацией и растворение указанного осадка в воде, отличающийся тем, что pH водного раствора осадка регулируется до нейтрального, и раствор обрабатывается катионной смолой, фильтруется для отделения катионной смолы, обрабатывается некислотным летучим растворителем, смешивающимся с водой, для осаждения полисахарида, свободного от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров, и фильтруется с извлечением образовавшегося осадка.

Стадия нейтрализации осуществляется, предпочтительно, слабой органической кислотой, растворимой в воде, такой как уксусная кислота.

Обработка катионной смолой, предпочтительно, проводится в течение от 8 до 48 ч при перемешивании и при комнатной температуре. Примером пригодной катионной смолы является Амберлит JR-120 в кисло(тно)й форме, также могут быть использованы другие катионные смолы, имеющие аналогичные свойства.

Катионная смола затем отделяется фильтрацией, и добавляется растворитель, смешивающийся с водой.

Примерами предпочтительных растворителей являются низшие кетоны и спирты, такие как ацетон и этиловый спирт.

Так образуется осадок, который является гликогеновым полисахаридом, свободным от азотных соединений и восстанавливающихся сахаров, и который отделяется фильтрацией. Помимо удаления растворителя, никакой дополнительной очистки не требуется.

Выход, по отношению к гликогену, высаждаемому из отвара, является приблизительно количественным.

Поэтому одним из дополнительных преимуществ способа данного изобретения является то, что стоимость производства полисахарида изобретения является практически такой же, как стоимость извлечения гликогена. Другими словами, при практически равной стоимости данное изобретение дает продукт, который может заменить гликоген во всех его известных применениях, без недостатков содержания протеинов, нуклеиновых кислот или их фрагментов и/или восстанавливающихся сахаров.

Нижеследующие примеры предназначены для иллюстрации данного изобретения, однако, без какого-либо его ограничения.

Пример 1. A) Извлечение гликогена.

1000 г Mytilus Gallus Provincialis помещается в стальной сосуд с 1,0 л 30% КОН и нагревается до 100^oC в течение 1 ч. Полученный таким образом раствор охлаждается до комнатной температуры и добавляется 1,5 л 95% этилового спирта. Образовавшийся твердый осадок (62 л) отделяется фильтрацией.

После сушки характеристики продукта являются следующими: C: 44,44% N: 0,18-0,34% B) Получение гликогенового полисахарида.

Твердый продукт, выделенный на стадии A, растворяется в 1 л воды, pH полученного раствора регулируется до нейтрального ледяной уксусной кислотой, и затем раствор фильтруется до полной прозрачности. К полученному таким образом раствору добавляется 60 г. Амберлита JR-120 в кисло(тно)й форме, и смесь перемешивается 24 ч при комнатной температуре. Смола отделяется от раствора фильтрацией, и гликогеновый полисахарид осаждается добавлением равного объема 95% этилового спирта и затем отделяется фильтрацией.

После сушки получается 61 г гликогенового полисахарида, имеющего следующие физико-химические характеристики: C: 44,44% N: отсутствует ⁺⁾
Восстанавливающиеся сахара: отсутствуют ⁺⁺⁾
Молекулярная масса: (2,5 ± 0,1) · 10^{6 +++)}
(α)²_D⁰ = 198 ± 1,0 (c = 1 в воде)
Гидролиз с помощью 1н H₂SO₄ (3 ч при 100^oC) дает только глюкозу ( определяется газовой хроматографией согласно методике М. Очиайи J.Crom. 194, 224 (1980)
+) чувствительность метода 60 частей на млн
++) определяется согласно методике в работе Ф.Д.Снелла и Снелл, Colorimetric Melhods of Analysis New Jork, 1954, т.III. стр. 204, чувствительность метода, 20, 25%)
+++) рассчитывается по значению (eta) с использованием уравнения Флори с следующими значениями K = 1,80 · 10^-4, a = 0,70, полученными в соответствии с методикой Л. П. Йю и Дж.Е.Роллинга для гликогена (J.Applied Pol Sci : 33 1909 (1987)
Пример 2. Гликогеновый полисахарид получается из Mytilus Gallus Provincialis, как описано в части В примера 1, за исключением того, что стадия осаждения осуществляется ацетоном вместо этилового спирта. Выход: 60,5 г.

(α)²_D⁰ = 196 ± 1,0 (c = 1 в воде)
восстанавливающиеся сахара: отсутствуют.

Пример 3. 5 г гликогена из печени свиньи, извлеченного в соответствии с методикой Белла и др("Biochem J 28, 882 (1934"), растворяется в воде (85 мл), обрабатывается Амберлитом JR-120 (5 г) и затем осаждается 95% этиловым спиртом (85 мл), как описано в части B Примера 1.

Азот и восстанавливающиеся сахара отсутствуют, (оптическая) вращательная способность является аналогичной(оптической) вращательной способности гликогеновых полисахаридов из Примеров 1 и 2.

Формула изобретения

1. Гликогеновый полисахарид, содержащий азот, определяемый по методу Кьельдаля, в количестве менее 60 млн^-1, и восстанавливающие сахара, определяемые по методу F.D.Snell Snell в количестве менее 0,25%
2. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что он содержит углерод в количестве 44 45%
3. Полисахарид по п.1 или 2, отличающийся тем, что его молекулярная масса составляет примерно (2,5 ± 0,1) · 10⁶ Дальтон.

4. Полисахарид по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что его оптическая вращательная способность (α)²_D⁰ = 197 ± 2,0 (c = 1 в воде).
5. Способ получения гликогенового полисахарида, предусматривающий кипячение животной ткани с высоким содержанием гликогена в водном растворе сильного основания, охлаждение полученного отвара, добавление некислотного летучего растворителя, смешивающегося с водой, отделение образовавшегося осадка фильтрацией и растворение его в воде, отличающийся тем, что pН водного раствора осадка доводят до нейтральной, раствор обрабатывают катионной смолой, фильтруют для отделения катионной смолы, обрабатывают некислотным летучим растворителем, смешивающимся с водой, с осаждением полисахарида, после чего раствор фильтруют с извлечением полученного осадка, при этом гликогеновый полисахарид содержит азот, определяемый по методу Кьельдаля, в количестве менее 60 млн^-1, и восстанавливающиеся сахара, определяемые по методу F.D. Snell Snell, в количестве менее 0,25%
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что нейтрализацию осуществляют слабой органической кислотой.

7. Способ по пп.5 и 6, отличающийся тем, что обработку катионной смолой проводят при комнатной температуре.

8. Способ по пп.5 7, отличающийся тем, что обработку катионной смолой проводят в течение 8 48 ч.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что обработку катионной смолой проводят в течение 24 ч.

10. Способ по пп.5 9, отличающийся тем, что катионной смолой является Амберлит jR-120 в кислой форме.

11. Способ по пп. 5 10, отличающийся тем, что растворителем является этиловый спирт или ацетон.