Производные нонапептидов или их солей с фармацевтически приемлемыми кислотами, способ их получения и фармацевтическая композиция

 

Использование: в медицине, как обладающие антагонистической активностью против бомбезина. Сущность изобретения: производные нонапептидов общей формулы I: X - A₁ - A₂ - Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu - psi TpiQ, где Q = OMe, NH₂; X = водород, ацетил, CONH₂; A₁ = (D-или L)Phe, (D- или L-)Tpi, D-p-Glu; A₂ = Gln, Glu(OMe), Glu(MeNH), Glu, His(Bz) или формулы II: D - Tpi - A₂ - Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu-psi A₉NH₂, где A₂ = Gln, Glu(OMe), His(Bz); A₉ = Leu, Ple, Trp, Trp(For) или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, получены путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, который проводят защищая аминогруппу, находящуюся в α-положении, и концевую карбоксигруппу ковалентно связывают с синтетическим полимерным носителем, используемым для этой цели, после чего α-защищающую группу отцепляют, карбоксигруппу последующей аминокислоты восстанавливают до образования группы которую затем связывают с упомянутой выше α-аминогруппой, подвергнутой предварительно деблокированию, после чего α-аминозащищающую группу этой второй аминокислоты деблокируют и карбоксигруппу последующей аминокислоты затем связывают с упомянутой выше деблокированной α-аминогруппой второй аминокислоты, а затем ступенчатого, в последовательности, соответствующей структурной формуле I или II, присоединяют другие аминокислоты, от полученного пептидил-полимера отщепляют носитель и при необходимости защитные группы, полученные пептиды в случае необходимости ацилируют и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде соли с фармацевтически приемлемой кислотой, фармацевтическая композиция содержит активный ингредиент (соединение формулы I) в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Предлагаемый способ позволяет получить ценные новые соединения, которые представляют интерес для терапии злокачественного заболевания у теплокровных животных и человека. 5 с. и 14 з.п., фор-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение выполнено при поддержке Правительства в виде субсидии N CA 40077, предоставленной Национальным онкологическим институтом (Национальный институт здравоохранения). Американское правительство имеет определенные права на эту заявку.

Настоящее изобретение направлено на получение ранее неизвестных пептидов, которые оказывают влияние на рост злокачественных опухолей у человека. Точнее, настоящее изобретение касается антибомбезинов, которые представляют собой [ Ψ^8-9 - псевдо] -нонапептиды, содержащие D- или L - триптофан или триптофановый аналог 2,3,4,9-тетрагидро-1H-пиридо[3,4-b]-индол-3-карбоновой кислоты (Tpi) на атоме азота N или (одновременно или по отдельности) на концевом атоме углерода C, которые обладают антагонистическими свойствами в отношении бомбензина или бомбезиноподобных пептидов, солей таковых и фармацевтических составов и способов использования применительно к этим пептидам.

Настоящее изобретение касается полипептидных соединений, которые обладают антагонистическими свойствами в отношении бомбензина или бомбезиноподобных пептидов, таких как гастриновысвобождающий пептид, нейромедин C и им подобные вещества, далее нызываемыми антибомбезиновыми свойствами, и которые представляют интерес, например, для терапии злокачественного заболевания у теплокровных животных, таких как человек. Изобретение касается ранее неизвестных полипептидных соединений и способов их получения, ранее неизвестных фармацевтических составов, содержащих упомянутые пептидные соединения, и способов приготовления лекарственных препаратов, содержащих таковые, для получения антибомбезинового эффекта у теплокровных животных и человека.

Бомбезин представляет собой тетрадекапептидный амид, который был впервые выделен из кожи лягушки вида Bombinabombina (Anastasi, Erspamer and Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Известно, что бомбезин является сильнодействующим митогеном в отношении фибробластовых клеток мышиной линии Swiss 3Т3 (Rozengurt and Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80, 2936) и что он стимулирует секрецию амилазы из панкреатических ацинусов у морских свинок (Jensen, Jones, Folkers and Gardner, Nature, 1984, 309, 61). Известно, что бомбезиноподобные пептиды продуцируются и секретируются человеческими мелколенточными легочными злокачественными клетками (Moody, Pert, Gazdar, Carney and Minna, Science, 1981, 214, 1246), что экзогенно введенные бомбезиноподобные пептиды могут стимулировать рост человеческих мелкоклеточных легочных злокачественных клеток in vitro (Carney, Cuttia, Moody and Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) и что моноклональное антитело, специфичное в отношении С-концевой области бомбезина и гастриновысвобождающего пептида, может блокировать связывание гастриновысвобождающего пептида, с его рецепторами и препятствовать росту человеческих мелкоклеточных легочных злокачественных клеток in vitro и in vivo (Cuttita, Carnce, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler and Minna, Nature, 1985, 316, 823).

Гастриновысвобождающий пептид, который обладает бомбезиноподобными свойствами, представляет собой широко распространенный пептидный амид, содержащий 27 аминокислот, выделенных из свиной кишки (Mc Donald, Jornvall, Nilsson, Vagn Ghatei, Bloom and Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227), у которого С-концевая аминокислотная последовательность является почти похожей на таковую у бомбезина. Нейромедин C представляет собой декапептидный амид, структура которого является идентичной структуре последних десяти аминокислот, расположенных в С-концевой области гастриновысвобождающего пептида, который был выделен из собачьей тонкой кишки (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke and Shively, J. Biol. Chem., 1983, 258, 5582). Гастриновысвобождающий пептид стимулирует появление разнообразных биологических реакций, включая высвобождение гастрина в большой круг кровообращения. Он также функционирует в качестве фактора роста в фибробластах мышиной линии 3Т3 и в мелкоклеточной легочной злокачественной клетке. Таким образом, получается так, что гастриновысвобождающий пептид играет прямую патофизилогическую роль в развитии мелкоклеточных легочных злокачественных клеток, происходящем по механизму аутокринного роста.

Структуры бомбезина, нейромедина C и карбоксил-концевого нонапептида для гастровысвобождающего пептида показаны ниже: бомбензин pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-Met-NH₂ нейромедин C H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ C-концевой нонапептид -Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ гастровысвобождающего пептида Поиск других амфибионтых бомбезиноподобных пептидов привел к выделению литорина, нонапептида (pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂), находящегося в коже лягушки из Папуа, Новая Гвинея, который, как оказалось, является наиболее сильнодействующим бомбензином (Yasukara et.al., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Из результатов исследования бомбезиновых аналогов следовало, что минимальный сегмент из девяти аминокислотных остатков, взятых из положения 6-14 у бомбезина, обладает всем спектром бомбезиновой активности.

Известно теперь несколько видов антибомбезинов. Вещество P(Arg- Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂), которое по своей аминокислотной последовательности характеризуется наличием небольшой гомологии с бомбезином, не ингибирует связывание бомбезина и бомбезиноподобных пептидов; однако аналоги вещества P, модифицированные заменой нескольких L - аминокислот на D-аминокислоты, такие как D-Arg¹, D-Pro², D-Trp^7,9, Leu¹¹) - вещество P и (D-Arg¹, D-Phe⁵, D-Trp^7,9, Leu¹¹) - вещество P (Moody et al., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201), блокируют, как это установлено, секрецию бомбезина в панкреатических ацинарных клетках и подавляют эффекты, связанные с промотированием роста бомбезина, в клетках линии Swiss 3Т3. Оказалось, что два типа антибомбезина, выделенных из бомбезина, например, (D-Phe⁶, D-Phe¹²) - бомбезин и (Leu¹³-psi-Leu¹⁴) - бомбезин (Coy et al, J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 и пептиды 1989, 10, 587), являются in vitro и in vivo сильнодействующими ингибиторами реакции на бомбезин.

Еще один тип антибомбезина, выявленный Хеймбруком и др. (Heimbrook et al, J. Biol. Chem., 1989, 264, 11258), представляет собой N-ацетильное образование гастриновысвобождающего пептида (с числом членов в цепи 20 - 26) и его аналоги, в случае которых из аналогов гастриновысвобождающего пептида, (с числом членов в цепи 20 - 27) является удаленным C-концевой метиониновый остаток. Недавно Кой (Coy, J. Biol. Chem 1989, 264, 14691) сообщил, что некоторые антибомбезины с короткой цепью, основанной на литориновой последовательности, такие как (D-Phe⁶, Leu¹³-psi-Phe¹⁴)-бомбезин-(6 - 14) и (D-Phe⁶, Leu¹³-[psi-Leu¹⁴)-бомбезина-(6 - 14), обнаруживают значительно более высокое сильнодействие, чем их соответствующий исходный пептидный (Leu¹³-psi-Leu¹⁴)-бомбезин.

Настоящее изобретение касается ранее неизвестных полипептидов, которые являются сильнодействующими антибомбезинами, способов их получения, фармацевтических композиций, включающих в себя упомянутые полипептиды, и их использования в качестве фармацевтически активных препаратов.

Точнее, настоящее изобретение касается псевдопептидов, включающих в себя полипептидную составляющую с формулой I X-A¹-A²A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-psi-A⁹-Q где Q - группа NH₂ или OQ¹, где Q¹ - водород, C_1-10-алкильная, фенильная или C_7-10-фенилалкильная группа; X - водород или одинарная связь, соединяющая альфа-аминогруппу у остатка A¹ с боковой цепной карбоксильной группой аминокислотного остатка A², если таковая присутствует,
или с группой с формулой:
R¹CO-,
в случае которой R¹ выбирают из групп, состоящих из:
а) водорода, C_1-10-алкильной, фенильной или C_7-10-фенилалкильной группы;
б)

где
R²-водород, C_1-10-алкильная, фенильная или C_1-10-алкильная, фенильная или C_7-10-фенилалкильная группа; R³ - водород или C_1-10-алкильная группа и
в) R⁴-O-
где
R⁴ - C_1-10-алкильная, фенильная или C_7-10-фенилалкильная группа;
A¹ -D-, L - или DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp, Trp или группа Trp, замещенная в бензольном кольце одним или несколькими членами, выбранными из группы, включающей в себя галоген, NO₂, NH₂, OH, C_1-3-алкильную группу и C_1-3-алкоксигруппу, где галогеном является фтор, хлор и бром;
A²-Ash, Dpa, Gln, His, MeHis, His (Bz), His (Z) или группа с формулой Asp (V), Glu [-] и Glu (V), в которой: V - группа -OR⁵ или , где R⁵ - водород, C_1-3-алкильная или фенильная группа, R⁶ - водород, C_1-3-алкильная группа или группа -NHCONH₂, и [-] - одинарная связь, соединяющая боковую карбоксильную группу с альфа-аминогруппой образования A¹, где X - одинарная связь;
A³ - Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp (For) или группа Trp, замещенная в бензольном кольце одним или несколькими членами, выбранными из группы, включающей в себя галоген, NO₂, NH₂, OH, C_1-3-алкильную группу и C_1-3-алкоксигруппу, где галогеном является фтор, хлор и бром;
A⁴ - Ala, MeAla или Gln;
A⁵ - Val или MeVal;
A⁶ - Gly, Phe или D-Ala;
A⁷-His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys (Z) или Pal;
A⁸-восстановленная изостера от Leu или Phe;
A⁹-Leu, Phe, Tpi, Trp или группа Trp, замещенная в бензольном кольце одним или несколькими членами, выбранными из группы, включающей в себя галоген, NO₂, NH₂, OH, C_1-3-алкильную группу и C_1-3-алкоксигруппу, где галогеном является фтор, хлор и бром, с обязательным условием, что группа A¹ или A⁹ представляет собой D-, L - или DL-Tpi- группу, и солей таковых с фармацевтически приемлемыми кислотами.

Предпочтительными полипептидами с формулой I являются полипептиды, у которых A¹ выбирается из группы, включающей в себя Mpp, D-Phe, L-или D -Tpi, D -Trp или группу Trp, замещенную в бензольном кольце одним или несколькими членами, выбранными из группы, включающей в себя галоген, NO₂, NH₂, OH, C_1-3-алкоксигруппу, где галогеном является фтор, хлор и бром, A⁹ - D -, L- или DL -аминокислотный остаток, выбираемый из группы, включающей в себя (Leu) Phe, Tpi, Trp или Trp(For).

Для удобства описания настоящего изобретения обычные сокращения для обозначения аминокислот, пептидов и их производных используются в виде общепринятых в химии пептидов и в виде рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре Международного биохимического союза Международного союза по теоретической и прикладной химии (European J. Biochem., 1984, 138, 9-37).

Сокращения отдельных аминокислотных остатков основываются на обычном названии аминокислоты, например, (Trp- триптофап, Gln-глутамин, His-гистидин, Ala- аланин, Val-валин, Gly-глицин, Leu-лейцин, Phe-фенилаланин. При наличии у аминокислотного остатка изомерных форм подразумевается аминокислота в L-форме, если иная форма не оговорена особо, в этом случае перед обозначением аминокислоты для иной формы появляются обозначения D- или DL.

В настоящем изобретении для обозначения необычных аминокислот приняты следующие сокращения:
Dpa - 2,3-диаминопропионовая кислота,
Nal-3-(2-нафтил)-аланин,
Thi- β -2'-тиенилаланин,
Tpi-2,3,4,9-тетрагидро-IH-пиридо-(3,4-b) -индол-3-карбоновая кислота.

Пептидные последовательности записываются с условием, что N-концевая аминокислота находится на левой стороне, а C-концевая кислота - на правой стороне.

Hca- гидроциннаминовая кислота,
Hna -3-гидрокси-2-нафтойная кислота,
Hpp-3-(4-гидроксифенил)пропионовая кислота,
Mpp - 3-(4-метоксифенил)пропионовая кислота,
Paa - фенилуксусная кислота,
Другие использованные сокращения таковы:
AC - ацильная группа,
Ac - ацетильная группа,
AcOH - уксусная кислота,
BOC - трет-бутоксикарбонил,
(BOC)₂O - ди-трет.-бутилкарбонат,
BHA-бензгидриламин,
BZI- бензильная группа,
BSA-бычий сывороточный альбумин,
DIC- 1,3-диизопропилкарбодиимид,
DMEM- среда Игла (EagIe), модифицированная Далбекко (Dulbecco);
Et - этильная группа,
EDTA-этилендиаминтетрауксусная кислота,
FCBS- сыворотка коровьего плода,
FMOC-9-фторенилметилоксикарбонил,
For - формильная группа,
HITE- среда RPMII6 4D с добавкой 10^-8 M гидрокортизона, 5 мкл/мл бычьего инсулина, 10 мкг/мл человеческого трансферрина, 10^-8 M β -эстрадиола в 3·10^-8 M Na₂SeO₃,
HOB_t - 1-гидроксибензотриазол,
HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография,
Me - метильная группа,
MeCN - ацетонитрил,
MeOH - метиловый спирт,
TEA - триэтиламин,
PBS - фосфатно-солевой буферный раствор,
PGlu- пироглутаминовая кислота,
psi - псевдопептидная связь у структуры CH₂-NH, исключая случай, когда последующий остаток содержит вторичную N- концевую группу, тогда подразумевается образование вида CH₂N,
TFA - трифторуксусная кислота,
Z - бензилоксикарбонил.

В настоящем изобретении наиболее распространенными полипептидами являются следующие полипептиды, номер и структура которых приведены ниже
1. NH₂-CO-Trp-Glh-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
3. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
4. 5F-D-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
6. D-Tpi-Glu(OMa)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
9. NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
11. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
12. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
15. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
21. D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
24. NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hls-Leu-psi-Tpi-NH₂
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
37. NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
38. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe
39. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH
40. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- N₂H₂CONH₂
В настоящем изобретении особенно предпочтительными полипептидами являются пептиды с номерами 5, 7, 12, 17, 18, 22, 26 и 38.

Синтез полипептидов
Полипептиды, отвечающие настоящему изобретению, могут быть получены любыми способами, известными специалистам, работающим в области химии пептидов. Обзор известных способов может быть найден в книге М. Боданцки (M. Bodanszky Principle of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidellerg, 1984).

Способы, относящиеся исключительно к твердофазному синтезу, описаны в справочнике Стьюарта и Янга (Y. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2 nd ed)) и в образе Барани и др. (G. Barany, et al, Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739, 1987).

Особенно предпочтительным способом получения полипептидов и их промежуточных пептидов, отвечающих настоящему изобретению, является способ с использованием твердофазного синтеза. Подложкой, используемой при проведении твердофазного синтеза полипептидов, отвечающих настоящему изобретению, является бензигидриламиновая смола или хлорометилированная полистирольная смола, на 1% прошитая дивинилбензолом, которые выпускает промышленность. В качестве защитной группы, выбранной для защиты α - аминогруппы, использовали трет-бутоксикарбонильную группу, которую удаляли на каждом этапе проведения синтеза. Исходный материал, содержащий защищенную аминокислоту, готовили из трет-бутоксикарбонильной аминокислоты, сочлененной с бензилгидриламиновой смолой или прикрепленной к хлорометилированной полистирольной смоле посредством KF. Синтез начинали с C-концевого радикала пептида и проводили с использованием аппаратуры ручного действия, ступенчато осуществляя разблокирование альфа-аминогруппы и присоединение следующей аминокислоты.

Очистка полипептидов
Полипептиды обычно очищали проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой, что делали на высокоэффективной жидкостной хроматографической системе фирмы "Рейнин" (фирма "Рейнин инк., Компани", г. Уобурн, шт. Миннесота), состоящей из трех насосов типа Rabbit HP HPLC фирмы "Рейнин", управляемых компьютером фирмы "Эррл Мейсинтош плас", инжектора фирмы "Реодин" и ультрафиолетового контрольного устройства с изменяемой длиной волны модели 87, выпускаемого фирмой "Ноер". Неочищенные пептиды (10 - 40 мг) загружали в колонку типа Макро фирмы "Дайнамакс" (21,2 на 250 мм) с набивкой из сферических частиц силикагеля марки C₁₈ (с размером пор 300 и размером частиц 12 мкм; производства фирмы "Рейнин инк., Компани") и элюировали в условиях существования линейного градиента, используя растворительную систему, состоящую из (A) 0,1% трифторуксусной кислоты и (B) 0,1% трифторуксусной кислоты в 70%-ном водном ацетонитриле, при скорости 2,0 мл/мин. У всех фракций оценивали чистоту и время удерживания, для чего использовали описанную ниже аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографическую систему.

Качество и характеристики элюирования неочищенного и очищенного пептида устанавливали посредством аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, для чего использовали жидкостной хроматограф модели 1090 производства фирмы "Хьюлетт-Какард", снабженный двухлучевым детектором, настроенным на длину волны 220 и 280 нм, колонкой с обращенной фазой (4,6 на 250 нм), содержащей набивку из материала W - порекс C₁₈ (с размером пор 300 и размером частиц 5 мкм). У растворительных систем A и B, описанных выше, скорость течения поддерживали величиной 1,2 мл/мин, и разделения проводили при комнатной температуре.

В большинстве случаев полипептиды дополнительно очищали, проводя повторно хроматографию с использованием той же самой колонки, но при несколько модифицированных условиях образования градиента. Методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что однородность у очищенных пептидов превышает 97%.

Аминокислотный анализ.

В настоящем изобретении аминокислотный анализ полипептидов проводили на аминокислотном анализаторе типа 6300 производства фирмы "Бекман", делая это на образцах, подвергнутых гидролизу при 110^oC в течение 20 ч, которые находились в герметичных откачанных пробирках, куда вводили 4 М метансульфоновую кислоту, содержащую 0,2% 3-(2-аминоэтил)-индола. Соотношения у аминокислот отвечали ожидаемым. Остатки в виде Leu-psi-Leu и Leu-psi-Phe давали абсорбционные пики со временами удерживания, соответственно равными 39,93 и 44,56 мин. В принятой методике анализа образование Tpi не обнаруживали по истечение 50 мин расщепления.

Методики анализа.

А. Тест на связывание рецептора
Связывание препарата ¹²⁵I-GRP (14-27) (гастриновысвобождающий пептид с числом членов в цепи 14 - 27 и меткой в виде иода-125) и смещение под воздействием антибомбезинов проводили на пластинках для тканевых культур с 24 углублениями (GIBCO), используя клетки линии Swiss 3Т3. Фибробласты линии Murine Swiss 3Т3 подвергали недельному воздействию среды DMEM, содержащей 10% FCBS (сыворотка коровьего плода) и противогрибковые препараты. Культуры инкубировали при 37^oC на воздухе, содержащем 5% Co₂. В углубления вводили 10⁵ клеток на углубление (жизнеспособностью выше 95%), и подвергали выращиванию до слияния и перехода в неподвижное состояние. Процедуру связывания продолжали в течение семи дней после введения клеток в углубление. Клетки дважды промывали связывающей буферной средой, беря по 0,5 мл (среда Игла, модифицированная Далбекко (среда DMEM), с содержанием 20 нМ HEPES-NaOH (с величиной pH, равной 7,4), 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 100 мкг/мл бацитрацина). Клетки затем инкубировали совместно с 0,2 нМ ¹²⁵I-GRP (14 - 27) при отсутствии или в присутствии разных концентраций антагонистов (при концентрациях 6·10^-11-6·10^-6 М, суммарный объем 0,4 мл).

Согласно Захари и Розенгурду (Zachary and Rosengurd, Pres, Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 85, 3636-3670) и Лейтону и др. (Layton et al., Cancer Ris., 1988, 43, 4783 - 4789) связывание препарата ¹²⁵I-GRP при 37^oC достигает максимальной величины за 30 мин и после этого спадает; таким образом, клетки инкубировали при 37^oC в течение 30 мин. После этого клетки дважды промывали охлажденным на льду (4^oC) связующим буферным раствором и дважды промывали охлажденным на льду фосфатнобуферным солевым раствором (PBS, мМ) следующего состава: NaCl - 138, KCl - 2,8, Na₂HPO₄ - 8, KH₂PO₄ - 1,45, CaCl₂ - 0,91, MgCl₂ - 0,49. Промытые культуры экстрагировали 0,5 М раствором NaOH, взятым в количестве 0,5 мл, и переносили в пробирки для счета. Углубления однократно промывали 0,5 мл дистиллированной воды (стерильные условия), и промывную воду добавляли в соответствующую пробирку. Затем радиоактивность образцов определяли на автоматическом гамма-счетчике (фирма "Микромедик систем, инк.", г. Хантсвилл, шт. Алабама).

Для определения типов рецепторного связывания, константы диссоциации Kd, константы ассоциации Ka, максимальной связывающей способности рецепторов Bmax и величины полумаксимального ингибирования IC₅₀ использовали компьютеризованную программу согласования кривых Ligand-PC, предложенную Мансоном и Родбардом (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 1987, 107, 220 - 239).

Величины IC₅₀ характеризуют концентрации антагонистов, вызывающие полумаксимальное ингибирование у GRP (14 - 27)-стимулированного роста (при концентрации 0.2 нМ). Константа диссоциации и максимальная связывающая способность у ¹²⁵I-CRP (14 - 27), имевшие место в проведенных опытах, составляли 1,32 нм 0,769 пм на 1 мг белка, соответственно, что находится в согласии с аналогичными величинами, приведенными в литературе для ¹²⁵I-GRP и ¹²⁵I-Tyr⁴-бомбезина. Характеристики связывания GRP-рецерторов на клетках линии 3Т3, полученные в проведенных экспериментах, находятся в хорошем согласии с величинами, найденными для связывания бомбезина с панкреатическими ацинозными клетками Дженсеном и др. (Jensen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UCA, 1978, 75, 6139 - 6143) и с слизеобразующими клетками Уэстендорфом и Шонбрунном (Westendorf and Schonbrunn, J. Biol. Chem., 1983, 258, 7527 - 7535).

Пептид GRP (14 - 27) ингибирует связывание ¹²⁵I-GRP(14 - 27) с величиной IC₅₀, равной 2,32 нМ, что находится в согласии с данными Лейтона и др. (Layton, et al, Cancer, Res., 1988, 48, 4783 - 4789), которые приводят величину 2,2 нМ. Данные по связыванию полипептидов, отвечающие настоящему изобретению, приведены в приложенной табл. 1.

Величина IC₅₀ представляет собой концентрацию лиганда без метки, который наполовину сдвигает связывание специфического радиолиганда. Эта величина рассчитывается по уравнению, приведенному Ченгом и Прусоффом (Chend and Prusoff, Biochem. Pharmacol., 1973, 22, 3099), которое имеет следующий вид:
IC₅₀ = Kc (1 + L/Kh), где Kc и Kh - константы диссоциации соответственно лиганда без метки (холодный) и с меткой (горячий) и L - концентрация использованного радиолиганда.

B. Высвобождение амилазы
Выделенные панкреатические ацинусы готовили коллагеназным расщеплением поджелудочной железы, взятой у мужских особей крысы Уистара (Wistar) (150-180 г), которых выдерживали в течение ночи в закрепленном состоянии. Животных убивали посредством цервикального сдвига, и поджелудочную железу удаляли и затем подвергали расщеплению посредством высокочистой коллагеназы (CLSPA, 540 ед. /мг, фирма "Купер биомедикал", г. Фрихолд, шт. Нью-Джерси, США), что делали по способу, который предложили Амстердам, Соломон и Джеймисон (Amsterdam, Solomon and Jamieson, 1978).

Диспергированные ациниусы суспендировали в инкубационной среде, содержащей 24,5 мМ HERES, 98 мМ NaCl, 4,0 мМ KCl, 11,7 мМ KH₂PO₄, 1,0 мМ MgCl₂, 0,3 мМ CaCl₂, 5,0 мМ глюкозы, 1% (по весу в расчете на объем) смеси существенных и несущественных аминокислот (фирма "Зерфа Файнбиокемика", г. Гейдельберг, ФРГ), 2 мМ глутамина, 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,01% (по весу в расчете на объем) трипсинового ингибитора. Инкубационный раствор насыщали кислородом и выдерживали при 37^oC в ванне со встряхиванием (60 колебаний в минуту). Ациниозную суспензию инкубировали в присутствии различных концентраций гастриновысвобождающего пептида (GRP) или антагонистов гастриновысвобождающего пептида.

После инкубирования пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин, и от осадка отделяли надосадочную жидкость. Содержание амилазы в надосадочной жидкости и в растворенном осадке определяли раздельно, что делали так, как это описано у Бернфельда (Bernfeld, 1955). Секрецию амилазы выражали в виде процентного приращения над базисной величиной. Инкубации повторяли. Нестимулированное выделение амилазы за весь экспериментальный период брали за базисную величину.

При добавлении инкубационной среды в условиях постепенного возрастания концентрации происходило концентрационно зависимое ингибирование процесса выделения амилазы, стимулированного субмаксимальной концентрацией гастриновысвобождающего пептида (10^-9М).

C. Ингибирование захвата ³H-тимидина клетками линии 3Т3
Мелкоклеточные легочные злокачественные клетки использовали в течение 2-4 дней после пересева. Суспензии моноклональных культур готовили промывкой клеток (дважды промывали в фосфатно-солевом буферном растворе, затем пипеткой переносили их в фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,2 г/л глюкозы, 0,2 г/л этилендиаминотетрауксусной кислоты и 14 мМ хлористого лигнокаина) при 37^oC, что делали до тех пор, пока суспензия не становилась однородной (2-4 мин). Клетки трижды промывали и ресуспендировали в среде HITES без добавления FCSB. Культуры в день 0 высевали на пластину в количестве 1,34·10⁵ клеток, тогда же добавляли все пептиды, находящиеся в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей среду HITES и 0,125% альбумина. По истечении 48 ч в каждое углубление добавляли 1 мкКи тритированного тимидина, и инкубацию продолжали еще в течение 24 ч. Клетки затем промывали, наносили на фильтровальную бумагу из стекловолокна и промывали охлажденной на льду 50%-ной трихлоруксусной кислотой. Фильтровальную бумагу помещали в ампулы, содержащие сцинтилляционную среду, и проводили счет в течение 1 мин.

Анализ воздействия антагонистических аналогов гастриновысвобождающего пептида (GRP) на линию клеток 3Т3, ингибирование захвата тимина представлены в табл.2.

D. Ингибирование роста различных мелкоклеточных легочных злокачественных клеток
Мелкоклеточные легочные злокачественные клетки штаммов H-69 и H-345, полученные из Национального онкологического института, переводили в суспендированное состояние. Ингибирование индуцированного гастриновысвобождающим пептидом ДНК-синтеза, происходящего под воздействием антибомбезинов проводили, измеряя захват ³H-тимидина. Было показано, что ингибирование индуцированного гастриновысвобождающим пептидом ДНК-синтеза, происходящего под воздействием антибомбезинов, является значительным и носит концентрационно зависимый характер.

E. Воздействие на панкреатическую секрецию in vivo
Секреторные исследования проводили на шести находящихся в сознании кошках (2-3 кг), препарированных с введением постоянных желудочной и панкреатической фистул, что делали так, как это было описано ранее (Konturek et al., J. Physiology London, 1976, 257, 663-672). Короче говоря, канюля, использованная в желудочной фистуле, была типа, описанного ранее в литературе (Emas, Gastroenterology, 1960, 39, 886-782). Эта канюля была введена в область нахождения пилорической железы вблизи большой кривизны желудка. Панкреатическую фистулу делали, используя специальную металлическую канюлю Т-образной формы с поперечным и основным элементами, приспособленными изобретателями для кошек. Общая желчная протока была рассечена сразу у соединения с панкреатической протокой и трансплантирована к верхней части двенадцатиперстной кишки, чем обеспечивалось отделение потока желчи от потока панкреатического сока. Был образован небольшой дуоденальный карман, содержащий вход основной панкреатической протоки, и поперечный элемент панкреатической канюли был введен в этот карман. Основной элемент канюли был помещен в дистанальную двенадцатиперстную кишку примерно на 3 см ниже дуодено-дуоденостомии.

Секреторные исследования начинали вести по прошествии трех месяцев после хирургического вмешательства. Пищу удаляли из клеток по крайней мере за 18 ч до проведения каждого опыта. На протяжении каждого опыта (исключая опыт с кормлением) желудочную фистулу оставляли открытой, чем обеспечивалось вытекание наружу желудочного сока.

Секрет, поступающий из панкреатической фистулы, собирали непрерывно и делили на образцы со временем накопления по 15 мин. Регистрировали объем, и определяли концентрации белка и бикарбоната и выходы, что делали так, как это было описано ранее (Konturek et al., 1976).

На каждом животном проводили несколько серий опытов, что было необходимо для сопоставления секреторной способности. Гастриновысвобождающий пептид вводили внутривенно возрастающими дозами (1250 пмоль/(кг·ч) по гастриновысвобождающему пептиду) в однодневном тесте с добавлением или без добавления пептида 5. В опытах с кормлением желудочную фистулу оставляли закрытой, и каждой кошке давали примерно 50 г кудинарно обработанного и гомогенизированного растиранием мяса, которое обычно полностью съедалось. Внутривенное вливание физиологического раствора (примерно 10 мл/ч) производили на протяжении всего периода после приема пищи, и, когда панкреатическая секреторная реакция обнаруживала хорошо выраженное плато, вводили пептид 5, и секрецию изучали еще в течение 2 ч. В отдельных опытах на голодных кошках (без введения пептида и кормления мясом) основную панкреатическую секрецию (с открытой желудочной фистулой) измеряли в течение 2 ч, и затем пептид 5 (10 нмоль/(кг · ч)) добавляли в водимую среду с дозой, при которой полностью прекращалась панкреатическая секреция, индуцированная гастриновысвобождающим пептидом. Эти результаты приведены ниже.

Бомбезиновые аналоги в виде пептидов 5, 10 и 2 подвергали тестированию in vivo по ингибированию сывороточного гастрина после стимулирования гастриновысвобождающим пептидом. Через 8 мин после стимулирования гастриновысвобождающим пептидом (3 мкг на 100 г массы тела) уровни содержания сывороточного гастрина возрастали с 16,7 пг/мл (контрольный опыт) до 105 пг/мл. Крыса, которой за 10 мин до стимулирования гастриновысвобождающими пептидом были в виде пищевого комка введены пептидные антагонисты 5, 10 и 2, обнаруживала понижение у уровня гастриновой секреции (вводили 30 мкг на 100 г массы тела; через 8 мин наблюдали уровень в 36,8 пг/мл в случае пептида, 2, 24,2 пг/мл в случае пептида 10 и 39,2 пг/мл в случае пептида 5).

Бомбезин/GRP-антагонисты, отвечающие настоящему изобретению, являются полезными в терапии состояний гипергастринемии, например, пернициозной анемии, хронического атрофического гастрита, синдрома Золлингера- Эллисона и витилиго, связанной с диффузной гиперплазией желудочных энтерохромаффиноподобных клеток и повышенным риском развития первично-множественных желудочных карционоидных опухолей. Кроме того, энтерохромаффиноподобная клеточная гиперплазия легко продуцируется у животных, страдающих гипергастринемией.

Такая терапия обладает преимуществом в сравнении с существующими лекарственными препаратами, поскольку H₂-антагонисты тяготеют к циметидину, который вызывает появление гипергастринемии и может вести к появлению карциноидных опухолей у людей. Кроме того, прекращение терапии H₂-антагонистами ведет к немедленному рецидиву язв в силу существующей гипергастринемии.

Поскольку эти соединения, отвечающие настоящему изобретению, являются антагонистами бомбезин/GRP-рецепторов, они могут быть использованы в терапии рака легких, рака кишечника и рака желудка.

На основе этих результатов, приведенных выше, данных, полученных на крысах, пептиды, отвечающие настоящему изобретению, могут быть введены в виде фармацевтически приемлемых нетоксичных солей, таких как соли, получаемые при добавлении кислот, являются хлориды, бромиды, сульфаты, фосфаты, фумараты, глюконаты, таннаты, малеаты, цитраты, ацетаты, бензоаты, сукцинаты, альгинаты, памоаты, малаты, аскорбаты, тартраты и им подобные вещества.

Микрокапсулы и микрочастицы из этих пептидов, образованных из поли-DL- лактид-когликолида, могут рассматриваться в качестве предпочтительных и проведенных форм для введения. Может быть также применено внутривенное, внутримышечное или подкожное введение с использованием изотонического солевого, фосфатно-солевого буферного и им подобных растворов. Для введения в легкие могут быть также использованы аэрозоли.

Эти фармацевтические составы должны содержать пептид в сочетании с обычными фармацевтически приемлемым носителем. Дозировка должна составлять примерно от 1 до 1000 мкг пептида на 1 кг веса тела пациента, если речь идет о парентеральном способе. Терапия пациентов этими пептидами может проводиться точно так, как проводится клиническая терапия с использованием других агонистов и антагонистов в отношении LHRH, соматостатиновых аналогов или других пептидов.

Эти пептиды могут быть введены млекопитающим внутривенно, подкожно, внутримышечно, назально или через легкие в виде аэрозоля с достижением желудочного ингибирования или противоопухолевого эффекта. Эффективно действующая величина дозировки меняется в зависимости от формы введения и от характера места, обрабатываемого у мелкопитающего. Например, одной из типичных дозировочных форм является физиологический солевой раствор, содержащий пептид, причем этот раствор вводят в таком количестве, чтобы доза находилась в диапазоне примерно от 0,01 до 0,20 мг на 1 кг веса тела. Рецепт может быть выписан лишь один раз в месяц, и продолжительность лечения может составлять несколько месяцев.

Фармацевтический состав для внутримышечной инъекции длительного действия (сезамовое масло, гель)
Пептид 17 - 10,0 мг
Моностеарат алюминия, USP - 20,0 мг
Сезамовое масло, g.s. - до 1,0 мл
Моностеарат алюминия соединяют с сезамовым маслом и нагревают до 125^oC при перемешивании до тех пор, пока не образуется прозрачный желтый раствор. Эту смесь затем стерилизуют в автоклаве, и оставляют охлаждаться. Затем в стериальных условиях с растиранием в порошок добавляют пептид 17. Особенно предпочтительными антагонистами являются соли с небольшой растворимостью, например, памоаты и т.п. Они обнаруживают активность в течение длительного времени.

Водный раствор для внутримышечной инъекции
Пептид 22 - 500 мг
Неантигенный желатин - 5 мг
Вода для инъекций, g.s. - до 100 мл
Желатин и пептид 22 растворяют в воде для инъекций, затем раствор стерильно фильтруют.

Микрокапсулы длительного действия для BM инъекций из биологически разлагаемого полимера
Микрокапсулы готовят из следующих ингредиентов:
Гликолид/лактидный (25/75) сополимер (характеристическая вязкость 0,5) - 99
Пептид 26 - 1
Вышеупомянутые микрокапсулы (25 мг) суспендируют в 1,0 мл следующего носителя, %:
Декстроза - 5
Натрий-СМС (карбоксиметилцеллюлоза) - 0,5
Бензиловый спирт - 0,9
Твин 80 - 0,1
Вода, очищенная - 100
Хотя изобретение и было описано применительно к его предпочтительным вариантам реализации, следует понимать, что изменения и модификации, очевидные специалистам, имеющим обычную квалификацию в этой области техники, могут быть произведены без выхода за объем изобретения, которое излагается в формуле изобретения, приведенной ниже. В изобретении допускается возможность проведения замены, известной в этой области техники, которая не сильно влияет на его эффективность.

Общие операции при проведении синтеза полипептидов, совершаемого на основе образования вида BOC (бутоксикарбонил)-аминокислота-смола
Операция I:
1) промывка CH₂Cl₂ (3 раза по 1 мин),
2) деблокирование 50%-ной трифторуксусной кислотой в CH₂Cl₂ дважды в течение 5 мин и 25 мин, соответственно, в случае пептидных смол, содержащих D- или L-Trp или Tpi, деблокирование проводят 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты в CH₂Cl₂, содержащим 5% меркаптоэтанола и 5% анизола,
3) промывка СH₂Cl₂ (6 раза по 1 мин),
4) нейтрализация 10%-ным раствором триэтиламина в CH₂Cl₂ (2 раз по 3 мин),
5) промывка CH₂Cl₂ (6 раз по 1 мин),
6) сочленение: I) добавление BOC (бутоксикарбонил)-аминокислоты (3 эквивалента) и HOBt (1-гидроксибензотризол) (3,3 эквивалента) в диметилформамиде (3 минуты); II) добавление 20%-ного раствора диизопропилкарбодиимида (3 эквивалента) в CH₂Cl₂ и встряхивание в течение 60 - 90 мин,
7) промывка CH₂Cl₂ (2 раза по 1 мин), этиленом (2 раза по 1 мин) и CH₂Cl₂ (5 раз по 1 мин).

Операция II:
при введении восстановленной пептидной связи -CH₂NH-стадию 6 операции I модифицируют следующим образом:
1) промывка диметилформамидом (2 раза по 1 мин),
2) добавление трет-бутоксикарбониллейцинового альдегида (3 эквивалента) в диметилформамиде, содержащем 1% уксусной кислоты,
3) добавление NaBH₃CN (3,5 эквивалента) в диметилформамиде и встряхивание в течение 60 мин,
4) промывка 50%-ным метиловым спиртом (3 раза по 1 мин), 100%-ным метиловым спиртом (3 раза по 1 мин) и CH₂Cl₂ (3 раза по 1 мин).

Операции III.

При сочленении Boc-Asn, Boc-Gln и Boc-Gly стадию 6 операции I модифицируют следующим образом.

Раствор 20%-ного диизопропилкарбодиимида (3 эквивалента) добавляют к смеси диметилформамида с трет-бутоксикарбониламинокислотой (3,0 эквивалента) и 1-гидроксибензотриазоом (3,3 эквивалента) при 0^oC в течение 15 мин и при комнатной температуре 15 нерастворимые вещества удаляют фильтрованием, фильтрат добавляют к пептидной смоле и встряхивают с Boc-Gln или Boc-Asn в течение 2 - 4 ч или с Boc-Gly в течение 1 ч.

Операция IV
При введении Fmoc(9-фторенилметилоксикарбонил)-аминокислоты проводят следующие стадии:
1) после деблокирования и нейтрализации промывают CH₂Cl₂ (3 раза по 1 мин) и диметилформамидом (3 раза по 1 мин),
2) сочленение I) добавлением Fmoc-аминокислоты (3 эквивалента) и 1-гидроксибензотриазола (3,3 эквивалента) в диметилформамиде (3 мин),
II) добавлением 20%-ного раствора диизопропилкарбодиимида (3 эквивалента) в CH₂Cl₂ и встряхивание в течение 60 мин,
3) промывка этанолом (3 раза по 1 мин), диметилформамидом (3 раза по 1 мин),
4) деблокирование Fmoc-группы 50%-ным пиперидином в диметилформамиде в течение 30 мин,
5) промывка диметилформамидом (6 раз по 1 мин),
6) еще одно сочленение проводится так, как это описано на стадии 2.

После получения требуемых промежуточных пептидов с формулой I пептидную смолу затем обрабатывают жидким HF в присутствии анизола, в результате чего получают полипептид в свободной форме, у которого в формуле 1:X-водород и Y - NH₂ или OH, или в защищенной форме, у которого в формуле I : A² - Glu(OMe) или His(Bz).

Обращение функциональной группы, находящейся в N,C-концевых положениях, или боковой цепной группы полипептида из свободной или защищенной формы в еще одну N- или C-концевую группу или боковую группу функциональной группы полипептида проводили в растворе, используя надлежащий реактив. Например, блокирующий полипептид, содержащий группу Glu в
B. Пример получения L- и D-Boc-Tpi
К перемешиваемой суспензии, состоящей из 10,8 г (50 мМ) D-Tpi в 250 мл 0,2 н. раствора NaOH и 7,5 мл триэтиламина, добавляли 10 г ди-трет-бутилбикарбоната, смесь перемешивали в течение 4 ч, затем добавляли еще 10 г бикарбоната, и после перемешивания в течение 3 ч добавляли еще 10 г. Смесь перемешивали в течение ночи и экстрагировали (2 раза по 100 мл) простым эфиром, который сливали. К водному слою добавляли лимонную кислоту, делая его до достижения величины pH, равной 3 - 5. Твердые вещества собирали, промывали водой и сушили на воздухе в течение ночи.

Твердые вещества суспендировали в 100 мл тетрагидрофурана. Растворялись почти все твердые вещества. Нерастворимые вещества удаляли фильтрованием, и тетрагидрофуран удаляли под вакуумом. Остаток растирали с простым эфиром, в результате чего получали 9,20 г или 58% вещества. Это вещество обладало той же температурой плавления, что и исходное вещество, но отличалось по растворимости и своим характеристикам при проведении тонкослойной хроматографии на кремнеземе в условиях использования элюента в виде смеси, состоящей из трихлорметана, метилового спирта и уксусной кислоты, взятых в соотношении 85 : 15 : 0,5.

Тем же самым методом из 2:55 г L-Tpi получали 2,22 г или 59% Boc-Tpi.

2. Пример получения Boc-Leu-CHO
Сложный метиловый эфир трет-бутоксикарбониллейцина (35 г, 134 мМ), находящийся в сухом толуоле (250 мл) в среде азота, охлаждали смесью сухого льда с ацетоном, и на протяжении 30 мин в толуол добавляли 25%-ный диизобутиловый гидрид алюминия (150 мл). Смесь перемешивали в течение 20 мин, что делали в ванне из сухого льда с ацетоном после добавления диизобутилового гидрида алюминия, затем осторожно добавляли метанол (15 мл). Смесь выливали в охлажденную льдом воду, взятую в количестве 1000 мл, встряхивали и фильтровали. Толуол отделяли, и водную фазу реэкстрагировали простым эфиром (3 раза по 300 мл). Толуольные и эфирные экстракты соединяли и сушили (сульфатом натрия). Полученную маслянистую жидкость быстро пропускали через колонку с набивкой из силикагеля (размером 3 на 50 см), для чего использовали 1500 мл 15%-ной смеси этилового эфира уксусной кислоты в петролейном эфире. Альдегид Boc-Leu получали в виде маслянистой жидкости (27,6 г).

Пример 2.

Номер пептида и структура приведены ниже.

1. NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu -NH₂
2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
3. D-Trp-Gln-(MENH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
6. D-Tpi-Gln(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
Полипептиды этого примера, содержащие фрагменты Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Leu-NH₂, но имеющие два разных остатка в N-концевом положении, строили поэтапно на бензигидриламиновой смоле в соответствии со стандартными способами проведения твердофазного синтеза.

Бензилгидриламиновую смолу, взятую в количестве 0,50 г (0,9 ммоля NH₂ на 1 г), дважды по три минуты обрабатывали 10%-ным триэтиламином в CH₂Cl₂ (нейтрализация) и шесть раз промывали CH₂Cl₂. Смолу смешивали с 1,35 ммолями Boc-Leu и 1,50 ммолями 1-гидроксибензотриазола в диметилформамиде, и смесь выдерживали в течение 3 мин. Добавляли 20%-ный 1,3-диизопропилкарбодиимид совместно с 1,3 ммолями CH₂Cl₂. Смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 60 мин. Полученную Boc-Leu-BHA (бензилгидриламиновую) смолу промывали CH₂Cl₂, что делали дважды с метанолом, три раза промывали CH₂Cl₂ и затем подвергали тесту по Кейзеру (Kaiser, Anal Biochem., 34, 595 (1970)). В случае неполного сочленения методику по сочленению повторяли.

Удаление Boc-группы (деблокирование) из Boc-Leu-BHA-смолы проводили в растворе в виде 50%-ной трифторуксусной кислоты в дихлорметане, что делали в течение 5 мин, фильтровали, обработку вновь повторяли в течение 25 мин и затем шесть раз промывали дихлорметаном.

Нейтрализацию проводит так, как это было описано выше в случае получения BHA-смолы (бензгидраламиновой смолы).

Сочленение Boc-Leu=CHO осуществляли проведением следующей операции II:
1) двухкратная промывка диметилформамидом,
2) добавление 1,5 ммоля Boc-Leu-CHO в диметилформамиде, содержащем 1% уксусной кислоты.

3) добавление 2,0 ммолей NaBH₃CN в диметилформамиде и встряхивание в течение 60 мин,
4) промывка 50%-ным метанолом в воде два раза, 100%-ным метанолом два раза и CH₂Cl₂ 3 раза.

После удаления Boc-группы из Boc-Leu-psi-Leu-ВНА-смолы и нейтрализации сочленение Boc-His(Z) проводили так, как это описано в операции I.

Сочленение Boc-Gly-проводили по операции III.

Раствор 1,3-диизопропилкарбодиимина с концентрацией 20% (1,5 ммоля) в CH₂Cl₂ добавляли к раствору диметилформамида, состоящему из 1,5 ммоля Boc-Gly и 1,65 ммоля бутанола и находящемуся при 0^oC, перемешивали при охлаждении в течение 15 мин и при комнатной температуре в течение 15 мин, осадок отфильтровывали, добавляли к смоле и встряхивали в течение 60 мин.

Последующие аминокислотные остатки Boc-Val, Boc-Ala и Boc-Trp затем последовательно вводили, сочленяя по способу, указанному в операции I, в результате чего получали 0,90 г защищенной пептидной смолы со структурой Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-смола (2/1 Res).

После включения Ros-Trp проводили деблокирование Boc-группы, для чего воздействовали 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты в дихлорметане, содержащем 5% меркаптоэтанола и 5% анизола, в результате чего получали TFA · Trp-Ala-Val-Glu-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-смолу (2/2 Res).

Образование TFA·Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-смолу (2/2 Res), взятую в количестве 0,91 г, делили на восемь порций (примерно по 100 мг каждая), которые использовали для проведения синтеза конструируемых защищенных полипептидных смол в соответствии с методиками, описанными в операции I применительно к сочленению Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Boc-D-Tpi и Boc-His(Z) и в операции III применительно к сочленению Boc-GIn.

Последовательное добавление Boc-Gln и Boc-Trp к указанной выше гептапептидной смоле (2/2 res) дает:
2/2/01 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA- смолу.

Последовательное сочленение Boc-Gln и Boc-D-Trp с гептапептидной смолой (2/2/res) дает:
2/2/02 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu- BHA-смолу.

Сочленение Boc-Gln и Boc-5F-D-Trp с гептапептидной смолой (2/2/res) ведет к получению:
2/2/04 Boc-5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu- BHA-смолы.

Последовательным сочленением Boc-Gln и Boc-D-Tpi получают:
2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi- Leu-BHA-смолу.

Последовательным сочленением Boc-Glu (OMe) и Boc-D-Tpi получают:
2/2/06 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu- psi-Leu-BHA-смолу.

Последовательным сочленением Boc-His (Z)- и Boc-D-Tpi получают:
2/07-Boc-D-Tpi-His(Z)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA- смолу.

Последовательным сочленением Boc-His (Bz)- и Boc-D-Tpi получают:
2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA- смолу.

После удаления Boc-группы воздействием 50%-ной трифторуксусной кислотой в дихлорметане, содержащем 5% меркаптоэтанола и 5% анизола, Boc-деблокированную полипептидную смолу промывают дихлорметаном, метанолом и дихлорметаном, что в каждом случае делают три раза, и обрабатывают свежепререгнанной HF (5 мл) и анизолом (0,25 мл), что делают при 0^oC в течение 1 ч. Растворитель отгоняют в вакууме, промывают простым эфиром или этилацетатом, затем экстрагируют 70 - 80%-ной уксусной кислотой и подвергают лиофилизации, в результате чего получают сырой продукт:
2/3/01 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂.

Номер пептида и структура приведены ниже.

4. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
5. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
6. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
7. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
8. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
2. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂
.

.

Смесь, состоящую из 40 мг Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi- Leu-psi-Leu-NH₂ (2/3/1) и 20 мкл триэтиламина, находящегося в 0,5 мл диметилформамида, и 20 мг KOCN, находящегося в 100 мкл воды, перемешивали при 0^oC, затем в смесь по каплям добавляли 100 мкл уксусной кислоты и перемешивали при 0^oC в течение 1 ч. Реакционную смесь подвергали очистке, в результате чего получали пептид, номер и структура которого приведены ниже:
1. NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu- NH₂.

Пептид 3 готовили последовательным сочленением Fmoc-Gly(OBut) и Fmoc-D-Trp по способу, указанному в операции IV, с Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-смолой (2/2/Res), в результате чего получали Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu- BHA-смолу (2/4/3). Пептидную смолу обрабатывали 10%-ной трифторуксусной кислотой, находящейся в дихлорметане, содержащем 5% 2-меркаптоэтанола, что делали в течение 30 мин, в результате чего происходило удаление бутильной группы из карбоксильной группы глутаминовой кислоты (Glu). После шестикратной промывки дихлорметаном метиламин (MeNH₂) пробулькивали через слой Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-смолы (2/5/Res), находящейся в 5 мл диметилформамида, что делали при 0^oC в течение 5 мин, добавляли 0,25 мл 20%-ного 1,3-диизопропилкарбодиимина в дихлорметане и проводили взаимодействие при 0^oC в течение 2 ч. Затем смолу промывали дихлорметаном и Fmoc-группу удаляли пиперидином.

Пептид 3 D-Trp-Gly(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu- NH₂ (RC-3490) получали после обработки HF.

Очистку проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием растворительной системы, состоящей из A) 0,1% трифторуксусной кислоты и B) 1% трифторуксусной кислоты в 70%-ном ацетонитриле. Оказалось, что у очищенных пептидов, полученных методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, чистота превышает 97%. Времена удерживания у полипептидов этого примера приводятся в табл. 3.

Результаты проведения аминокислотных анализов полипептидов, отвечающих этому примеру, соответствовали ожидаемым. Например, аминокислотные отношения у пептида 2 со структурой D-Trp-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH₂ составляли 1,11: 2,09:0,90: 1,03:0,95:0,92 (Gln:Trp:Ala:Val:Gly:His). Остаток Leu-psi-Leu-обнаруживал абсорбционный пик со временем удерживания 39,95 мин. Группу Tpi в пептидах 5, 6, 7 и 8 не обнаруживали.

Пример 3
Номер пептида и структура приведены ниже.

9. NH₂CO-Tpr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
11. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
12. D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
.

.

Полипептиды, отвечающие этому примеру, содержат одинаковый фрагмент Trp-Ala-Val-Cly-His-Leu-psi-Phe-NH₂. Вос-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу (3/1/res) стоили поэтапно, что делали на 0,5 г бензгидриламиновой смолы (ВНА-смола) (9,0 ммоля NH₂ на 1 г) в соответствии с правилами проведения твердофазного синтеза, описанными в случае примера 2, исключением было лишь то, что при первом сочленении брали фрагмент Boc-Phe вместо фрагмента Boc-Leu.

Часть пептидной смолы, содержащую в каждом случае примерно 150 мг Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-ВНА-смолы (3/1/Res), сочленяли с другими двумя остатками, что делали по методикам, описанным в операции 1 применительно к сочленению Boc-Trp-Boc-D-Trp, Boc-D-Tpi и Boc-Glu (OMe) и в операции III применительно к сочленению Boc-Gln, в результате чего получали конечную полипептидную смолу.

При последовательном сочленении Boc-Gln и Boc-Trp с упомянутой выше гептапептидной смолой (3/1/res) получали:
3/2/09 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу.

Последовательным добавление Boc-Gln и Boc-D-Trp к гептапептидной смоле (3/1/res) получали:
3/2/10 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу
Сочленением Boc-Gln и Boc-D-Tpi с гептапептидной смолой (3/1/res) получали:
3/2/12 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Glu (OMe) и Boc-D-Tri с гептапептидной смолой (3/1/res) строили:
3/2/10 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу.

После удаления Boc-группы воздействием 50%-ной трифторуксусной кислотой, находящейся в дихлорметане, содержащем 5% меркаптоэтанола и 5% анизола, полипептидную смолу промывали дихлорметаном, метанолом и дихлорметаном, делая это в каждом случае по три раза, и обрабатывали свежеперегнанной HF (5мл) и анизолом (0,25 мл), что делали при 0^oC в течение 1 ч. Растворитель отгоняли в вакууме, экстрагировали 70-80%-ной уксусной кислотой и подвергали лиофилизации. В результате этого получали следующие пептиды:
3/3/09 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂.

Номер пептида и структура приведены ниже
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
12. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
13. D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂
.

.

Пептид, содержащий группу NH₂CO в N-концевом положении, готовили по следующей методике.

Смесь, состоящую из 40 мг сырого полипептида (3/3/9) Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂ и 20 мкл триэтиламина, находящегося в 0,5 мл диметилформамида, и 20 мг KOCN в 100 мкл воды, перемешивали при 0^oC, в указанную выше смесь затем по каплям добавляли 100 мкл уксусной кислоты, и реакцию при перемешивании вели при 0^oC в течение 1 ч. Реакционную смесь, содержащую требуемый пептид 9 вида NH₂CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂ подвергали очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пептид II готовили последовательным сочленением двух Fmoc-аминокислот, что делали по способу, указанному в операции IV по твердофазному синтезу.

Смолу TFA. Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA (3/1/Res), взятую в количестве 150 мг, нейтрализовали 10%-ным триэтиламином, промывали CH₂Cl₂ и диметилформамидом и сочленяли с Fmoc-Glu (OBut), в результате чего получали Fmoc-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val- Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala- Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-смолу получали после деблокирования 50%-ным пиперидином в сочетании с Fmoc-D-Trp. Бутильную группу (But) удаляли из Fmoc-защищенной пептидной смолы обработкой 10%-ной трифторуксусной кислотой, находящейся в дихлорметане, содержащем 2% меркаптоэтанола, которая продолжалась 30 мин. Метиламид MeNH₂ пробулькивали через слой (200 мг) смолы Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala- Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA (3/6/11), находящейся в 5 мл диметилформамида, что делали при 0^oC в течение 5 мин, добавляли 0,2 мл 20%-ного 1,3-диизопропилкарбодиимида, находящегося в дихлорметане, и смесь перемешивали при 0^oC в течение 2 ч. Смолу затем промывали дихлорметаном, и Fmoc-группу удаляли пиперидином. После обработки HF и анизолом пептид 11 D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe- NH₂ подвергали очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Времена удерживания пептидов, отвечающих этому примеру, приведены в табл. 4.

Отношения у аминокислот, найденные при проведении аминокислотных анализов, отвечали ожидаемым. Например, отношения у пептида 10 вида D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH₂ составляли 1,15:0,96:0,95:1,01:0,94: 1,97 (Glu: Gly: Ala: Val: His:Trp), и получался пик со временем удерживания 44,56 мин. Отношения у пептида 13 составляли 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 ((Glu:Cly:Ala:Val:His:Trp), и наблюдали абсорбционный пик для Leu-psi-Phe со временем удерживания 44,56 мин. Фрагмент Tpi у пептида 13 не обнаруживали.

Пример 4.

Номер пептида и другие приведены ниже.

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
15. D-P-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
18. D-Trp-Gle-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
21. D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
24. NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi- Tpi-NH₂
25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
.

.

Leu-psi-Tpi-BHA-смолу готовили взаимодействием Boc-Leu-psi-Trp-BHA-смолы с формальдегидом в соответствии с методами, приведенными ниже.

Boc-Leu-psi-Trp-BHA-смолу получали из 0,1 бензгидриламиновой (BHA) смолы (0,9 ммоля BH₂ на 1 г) последовательными сочленением с Boc-Trp и Boc-Leu-CHO, что делали по способу, указанному в операции I и операции II. Диметилформамид, взятый в количестве 10 мл и содержащий 1% уксусной кислоты, добавляли к указанной выше пеетидной смоле, и затем приводили во взаимодействие с 1 мл 10%-ного формальдегида, что делали при комнатной температуре в течение 60 мин, и промывали диметилформамидом, метанолом и дихлорметаном.

Все полипептиды, отвечающие этому примеру, содержат общий фрагмент Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу (4/1/Res) строили поэтапно на Leu-psi-Tpi-BHA-смоле последовательным сочленением с Boc-His (Z) (операция I), Boc-Gly (операция III), Boc-Val, Boc-Ala и Boc-Trp (операция I).

Часть указанной выше промежуточной пептидной смолы в количестве 150 мг подвергали двум дальнейшим сочленениям, делая это по методикам, описанным в операции I для сочленения Hca, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBz), Boc-D-Phe, Boc-D-Trp, Boc-His (Bz), Boc-Tpi, Boc-D-Tpi, AC-Tpi и Hna-Tpi и в операции III для сочленения Boc-Gln, в результате чего получали конечные пептидные смолы.

Последовательным сочленением Boc-Gln и Hca c упомянутой выше гептапептидной смолой (4/1/res) получали:
4/2/14 Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Последовательным добавлением Boc-Gln и D-pGlu к гептапептидной смоле (4/1/res) получали:
4/2/15 D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Последовательным сочленением Boc-Glu(OBz) и Boc-Phe с упомянутой выше промежуточной пептидной смолой (4/1/res) получали
4/2/16 Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln и Boc-D-Phe с гептапептидной смолой (4/1/res) получали:
4/2/17 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln и Boc-D-Trp с гептапептидной смолой (4/1/res) строили:
4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-His(Br) и Boc-D-Trp с гептапептидной смолой (4/1/res) стоили:
4/2/19 Boc-D-Trp-His(Br)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln(MeO) и Boc-Tpi с гептапептидной смолой (4/1/res) строили:
4/2/21 Boc-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln и Boc-Tri с гептапептидной смолой (4/1/res) строили:
4/2/22 Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln и Ac-Tpi (с гептапептидной смолой (4/1/res) строили:
4/2/23 Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Gln и Hna-Tpi с гептапептидной смолой (4/1/rec) строили:
4/2/25 Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-смолу.

Сочленением Boc-Glu и Boc-D-Tpi c гептапептидной смолой (4/1/res) строили:
4/2/26 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi- Tpi-BHA-смолу.

После удаления Boc-группы и обработки указанных выше образований HF и анизолом, как это описано в примере 2 и 3, соответственно получали следующие пептиды:
Номер пептида и структура приведены ниже.

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
15. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
.

4/3/16 Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
.

17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
21. D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-Nh₂
22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glu-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂
Пептид Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂(16) (4/3/16), взятый в количестве 20 мг. совместно с 5 мг дифенилфосфорилазида и 10 мг KHCO₃, находящимися в 0,5 мл диметилформамида, перемешивали при 0^oC в течение 24 ч. Реакционную смесь подвергали очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием растворительной системы B (40-70%), что делали в течение 60 мин, в результате чего получали пептид 16:
Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂,
количество которого составляло примерно 4,5 мг. Его очищали (частота выше 95%) методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием растворительной системы при концентрациях 25-65%, что делали в течение 40 мин. Время удерживания составляло мин.

Смесь, состоящую из 40 мг сырого полипептида 22 вида Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂, 20 мкл триэтиламина, находящегося в 0,5 мл диметилформамида, и 20 мг KOCN, находящегося в 100 мкл воды, перемешивали при 0 ^oC. Через несколько минут в указанную выше смесь по каплям добавляли 100 мкл уксусной кислоты, и реакционную с перемешиванием вели при 0^oC в течение 1 ч. Реакционную смесь, содержащую требуемый (олиго) - пептид вида: пептид 24 NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi- Tpi-NH₂ подвергали очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Смолу Fmoc-D-Trp-Gln(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)- Leu-psi-Tpi-BHA (4/2/Res) готовили последовательным сочленением Fmoc-Glu(OBut) и Fmoc-D-Trp с Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)- Leu-psi-Tpi-BHA-смолой (4/1/Res) по способу, указанному в операции IV. После удаления But-группы воздействием 10%-ной трифторуксусной кислотой, находящейся в дихлорметане, содержащем 2%-2-меркаптоэтанола, что делали в течение 30 мин, пептидную смолу подвергали взаимодействию с метиламином и 1,3-диизопропилкарбодиимином, что делали по методикам, описанным в примере 3 применительно к пептидной смоле (3/6/11), в результате чего получали Fmoc-D-Trp-Glu (MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- BHA-смолу (4/3/Res). После удаления Fmoc - группы воздействием пиперидина пептидную смолу обрабатывали HF (5 мл) и анизолом (0,25 мл что делали при 0^oC в течение 1 ч, в результате чего получали пептид 20:
D-Trp-Glu - (MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-Nh₂.

Время удерживания пептидов, отвечающих настоящему примеру, приведены в табл. 5
При проведении аминокислотного анализа пептидов, отвечающих настоящему примеру, были получены ожидаемые составы. Например, полипептид D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH₂ (17) обладал отношениями 1,04:0,99:0,96: 1,00: 0,94: 0,99: 1,06 (Gln:Gly:Ala:Val:Phe:His:Trp). При проведении аминокислотного анализа фрагмент Tpi не был обнаружен в пептидах 17, 24 и 26.

Пример 5
Номер пептида и структура приведены ниже.

27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
Пептиды, отвечающие этому примеру, содержат общий фрагмент Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂ или Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp (For) -NH₂. Смолу Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For) -BHA (5/1/Res) создавали на 1,0 г бензгидриламиновой смолы (BHA-смола) (0,9 ммоля NH₂ на 1 г) последовательным сочленением с проведением операций по твердофазному синтезу, описанных в примере 2, исключением было лишь то, что при первом сочленении вместо Boc-Leu брали Boc-Trp (For). Указанные выше пептидные смолы в виде порций по 250 мг использовали при проведении синтеза следующих защищенных пептидных смол, которые окончательно получали сочленением с MPP, Boc-D-Phe, Boc-D-Trp или Boc-D-Tpi соответственно, что делали по методике, описанной в операции I.

5/2/27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(2)-Leu-psi-Trp(For)-BHA смол
5/2/28. Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-p(For)-BHA смол
5/2/29. Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-BHA смол
5/2/30. Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-BHA смол
После удаления Boc-группы воздействием 50%-ной трифторуксусной кислоты, находящейся в дихлорметане, содержащем 5% меркаптоэтанола и 5% анизола, половину каждой из указанных выше пептидных смол обрабатывали HF (5 мл) и анизолом (0,25 мл), что делали при 0^oC в течение 1 ч, в результате чего получали следующие пептиды:
Номер пептида и структура приведены ниже
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH₂
Оставшуюся половину каждой пептидной смолы обрабатывали фтористоводородной кислотой, содержащей 5% анизола и 5% димеркаптоэтанола, что делали при 0^oC в течение 1 ч, в результате чего получали следующие пептиды:
Номер пептида и структура приведены ниже.

27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH₂
Указанные пептиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные времена удерживания приведены в табл. 6.

Данные, полученные при проведении аминокислотного анализа пептидов, отвечающих этому примеру, соответствовали ожидаемым. Например, пептид 28 обладал следующими аминокислотными отношениями: 0,98:0,92:1,03:0,97:0,98:1,09 (Gly:Ala:Val:Phe:His:Trp). Фрагмент Tpi в пептидах 30 и 34 не был обнаружен.

Пример 2
Пример пептида и структура приведены ниже.

35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
37. NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
38. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe
39. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH
40. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-N₂H₂ CONH₂
В качестве исходного материала использовали Boc-Trp- OCH₂-смолу, которую готовили по следующей методике. Смесь, состоящую из ClCH₂-смолы (1,0 г 0,7 ммоля хлора на 1 г) Boc-Trp (2,0 ммоля Trp) и KF (4 ммоля), находящихся в 20 мл диметилформамида: перемешивали при 70 - 80^oC в течение 4 ч. Затем Boc-Trp-OCH₂-смолу дважды промывали, используя в каждом случае метанол, воду, метанол, диметилформамид и дихлорметан. Смолу Boc-Leu-psi-Trp-OCH₂ получали сочленением Boc-Leu-CHO с Trp-OCH₂-смолой, проводя операцию II. Смолу Boc-Leu и -psi-Tpi-OCH₂ получали взаимодействием Boc-Leu-psi-Trp- OCH₂-смолы с формальдегидом, что делали по методике, описанной в примере 4. Последовательным сочленением Boc-His(Z), Boc-Gly-Boc, Val-Boc-Ala-Boc-Trp и Boc-Gln, проводимым по операциям твердофазного синтеза, описанным ранее, получали 1,60 Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- OCH₂-смолы (6/1/Res). Часть указанной выше промежуточной пептидной смолы использовали для получения Boc-Tpi-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCH₂-смолы (6/2/35), чего достигали сочленением с Boc-Tpi. Еще одну аликвоту пептидной смолы использовали для получения Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)- Leu-psi-Tpi-OCH₂-смолы (6/2/36), чего достигали сочленением с Boc-D-Tpi.

После удаления Boc-группы воздействием 50%-ной трифторуксусной кислоты, находящейся в диэтилмалеате (DEM), содержащем 5% меркаптоэтанола и 5% анизола, трансэтирификацию проводили следующим образом. Смешивали 0,5 г Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu- psi-Tpi-OCH₂ смолы (6/3/35), метанол (15 мл), находящийся в диметилформамиде (15 мл) и диизопропилэтиламин (3 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение трех дней. Смолу промывали диметилформамидом (3 раза) и метанолом (3 раза). Фильтрат и промывные воды соединяли и упаривали на роторном испарителе в вакууме, что детали с целью удаления растворителей. После обработки HF и анизолом получали 123 г сырого пептида 35
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OCH₃.

Пептид 36 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi- Tpi-OCH₃.

получали тем же способом, но при этом в качестве исходного вещества брали смолу (6/2/36).

Смесь, состоящую из Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi- Tpi-OCH₃ (пептид 35) (40 мл), 20 мкл триэтиламина, находящегося в 0,5 мл диметилформамида, и 50 мг соединения KOCN, находящегося в 100 мкл воды, перемешивали при 0^oC, по прошествии нескольких минут добавляли 50 мкл уксусной кислоты, и взаимодействие вели при 0^oC в течение 1 ч. Смесь затем подвергали очистке, в результате чего получали пептид 37
NH₂CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-psi-Tpi-OCH₃
Смесь, состоящую из D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu- psi-Tpi-OCH₃ (пептид 36) и раствора метиламина в метаноле (2 мл), взятых в весовом отношении 1: 2, перемешивали под комнатной температуре в течение 16 ч. После упаривания на роторном испарителе в вакууме остаток сушили вымораживанием и обрабатывали HF и анизолом. Получали продукт в виде пептида 38 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- psi-Tpi-NHCH₃, который подвергали очистке методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии.

Еще одну часть смолы D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu- psi-Tpi-OCH₂ (6/2/35) подвергали взаимодействию с HF и анизолом, в результате чего получали
пептид 39 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH.

Смесь, состоящую из пептида 39 (40 мг), (Boc)₂O (20 мг) и триэтиламина (0,5 мкл), находящихся в 0,5 мл диметилформамида перемешивали при 0^oC в течение 4 ч и подвергали лиофилизации. После промывки простым эфиром остаток совместно с 1-гидроксибензотриазолом (10 мг) и N₂H₃CONH₂ (20 мг) подвергали взаимодействию с DCl (100 мкл, 20%-ный раствор DCl в дихлорметане), что делали на протяжении ночи при 0^oC, диметилформамид испаряли, промывали простым эфиром и удаляли Boc-группу, воздействуя 50%-ной трифторуксусной кислотой, содержащей 5% меркаптоэтанола и анизол, в результате чего получали сырой пептид 40
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- N₂H₂CONH₂.

Формула изобретения

1. Производные нонапептидов общей формулы I
X - A₁ - A₂ - T_rp - Ala - Val - Gly - His - Teu - psi Tpi Q,
где Q - Ome, NH₂;
X - водород, ацетил, CONH₂;
A₁ - (D- или L-)Phe, D-Trp, (D- или L-) - pi, D-p-Glu;
A₂ - Gln, Gly (OMe), Glu (MeNH), Glu, His (BZ),
или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.

2. Нонапептид по п.1 формулы
D - Phe - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

3. Нонапептид по п.1 формулы
D - Phe - Glu - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

4. Нонапептид по п.1 формулы
D - Trp - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

5. Нонапептид по п.1 формулы
Trp - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

6. Нонапептид по п.1 формулы, выбранной из группы
NH₂ CO Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

CH₃ CO Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

7. Нонапептид по п.1 формулы
D - Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

8. Нонапептид по п.1 формулы
D - Trp - Glu(OMe) - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

9. Нонапептид по п.1 формулы
D - Trp - Glu(NHMe) - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

10. Нонапептид по п.1 формулы
D - Trp - His(BZ) - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi Tpi NH₂.

11. Нонапептид по п.1 формулы I, в которой A - D -или L - Tpi.

12. Производные нонапептидов общей формулы I по п.1, обладающие антагонистической активностью против бомбезина.

13. Производные нонапептидов общей формулы II
D - Tpi - A₂ - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi - A 9 NH₂,
где A₂ - Gln, Glu (OMe), His, His (Bz);
A₉ eu, Phe, Trp, Trp (For),
или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.

14. Производные нонапептидов по п.2 формулы
D - Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - eu - psi eu NH₂.

15. Производные нонапептидов по п.2 формулы
D - Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu - psi Phe NH₂.

16. Производные нонапептидов по п.2 формулы
D - Tpi - Gln - Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu - psi TrpNH₂.

17. Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью против бомбезина, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит производное нонапептида формулы I по п.1 в эффективном количестве.

18. Способ получения производных нонапептидов общей формулы I по п.1, заключающийся в ступенчатом наращивании пептидной цепи, который проводят, защищая аминогруппу, находящуюся в α- положении, и концевую карбоксигруппу ковалентно связывают с синтетическим полимерным носителем, используемым для этой цели, после чего α- защищающую группу отщепляют, карбоксигруппу последующей аминокислоты восстанавливают до образования группы
которую затем связывают с α- аминогруппой, подвергнутой предварительно деблокированию, после чего α- аминозащищающую группу второй аминокислоты деблокируют и карбоксигруппу последующей аминокислоты затем связывают с деблокированной α- аминогруппой второй аминокислоты, а затем ступенчато в последовательности, соответствующей структурной формуле I, присоединяют другие аминокислоты, от полученного пептидил-полимера отщепляют носитель и при необходимости защитные группы, полученные пептиды в случае необходимости ацилируют и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде соли с фармацевтически приемлемой кислотой.

19. Способ получения производных нонапептидов общей формулы II по п.13, заключающийся в ступенчатом наращивании пептидной цепи, которое проводят, защищая аминогруппу, находящуюся в α- положении, и концевую карбоксигруппу ковалентно связывают с синтетическим полимерным носителем, используемым для этой цели, после чего α- защищающую группу отщепляют, карбоксигруппу последующей аминокислоты восстанавливают до образования группы

которую затем связывают с α- аминогруппой, подвергнутой предварительному деблокированию, после чего α- аминозащищающую группу второй аминокислоты деблокируют и карбоксигруппу последующей аминокислоты затем связывают с деблокированной α- аминогруппой второй аминокислоты, а затем ступенчато в последовательности, соответствующей структурной формуле II, присоединяют другие аминокислоты, от полученного пептидил-полимера отщепляют смолу-носитель и при необходимости защитные группы и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде соли с фармацевтически приемлемой кислотой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3