Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней

 

Сущность изобретения: последовательная комбинации обращенно-фазового и анионнообменного методов на хроматографической установке низкого давления. Способ предусматривает проведение загрузки и элюирования разделяемых компонентов во фронтально-вытеснительном режиме. Технический результат: получение высокоочищенного инсулина, содержащего не менее 7% основного вещества, не более 0,001% проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%. 12 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, конкретно, к способам очистки инсулина - препарата для лечения сахарного диабета.

Современные препараты инсулина производят из субстанции высокой степени очистки. Это связано с тем, что белковые примеси, обычно присутствующие в инсулинах, получаемых из поджелудочных желез животных, особенно проинсулины, эфиры инсулина и полимерные инсулины обладают высокой антигенной активностью и могут вызывать иммуногенные поражения сосудов и внутренних органов больных сахарным диабетом, которые применяют препараты недостаточно очищенных инсулинов. В Фармакопеях развитых стран, в частности Британской, Европейской и США содержание проинсулина в субстанции животных инсулинов ограничено 0,001%, высокомолекулярных белков (димерных и полимерных инсулинов) - 1% , дезамидоинсулинов - 3% [1].

Для производства высокоочищенной субстанции инсулинов различной природы в настоящее время широко применяют разнообразные хроматографические методы [2]. Основным критерием эффективности промышленной хроматографической технологии является производительность хроматографической колонны, выражаемой в количестве очищенного продукта, получаемого в единицу времени с единицы объема сорбента. При этом производительность колонны пропорциональна емкости, селективности и эффективности сорбента [3]. По этой причине в современных промышленных хроматографических процессах стремятся использовать высокоэффективные сорбенты, имеющие, как правило, сферическую или сфероидную форму и небольшой размер частиц (5-10 мкм), что обеспечивает при прочих равных условиях большую эффективность, а, следовательно, и более высокую производительность указанных сорбентов по сравнению с менее эффективными сорбентами с более крупными частицами неправильной формы.

С другой стороны, применение высокоэффективных сорбентов требует использования высокого давления (до 200 атм) на входе в колонну для реализации оптимальных скоростей потока мобильной фазы. Промышленные хроматографические системы высокого давления достаточно дороги, что в определенной степени препятствует их широкому использованию в производстве фармацевтических препаратов.

Большинство примесей, снижающих качество субстанции инсулина, представляют собой его близкие аналоги с минимальными структурными отличиями [4]. Поэтому для их отделения от основного продукта в препаративном масштабе приходится использовать либо высокоэффективные сорбенты и, соответственно, дорогостоящие хроматографические системы высокого давления, либо сорбенты и мобильные фазы, обеспечивающие высокую селективность разделения основного вещества и примесей. Только в этих случаях можно использовать высокие удельные нагрузки на сорбент, что делает процесс хроматографической очистки экономически рентабельным. При этом высокоселективные процессы экономически выгоднее высокоэффективных, так как в этом случае можно использовать относительно низкоэффективные сорбенты и, соответственно, более дешевые хроматографические системы низкого давления [5] .

В общем случае процесс препаративного хроматографического разделения может быть реализован, по крайней мере, двумя различными способами: элютивным или вытеснительным. В элютивном способе разделение компонентов смеси осуществляют за счет разницы в их коэффициентах распределения между мобильной и стационарной фазами. При этом, очевидно, что при больших удельных нагрузках на сорбент происходит значительное уширение и перекрывание пиков компонентов, что приводит к снижению выхода целевых продуктов [6].

В случае вытеснительного способа используют способность компонентов мобильной фазы или компонентов разделяемой смеси конкурировать за места на стационарной фазе таким образом, что в процессе нанесения смеси на сорбент и последующего элюирования формируется так называемый фронт вытеснения, то есть последовательность зон разделяемых компонентов, в которой каждый последующий компонент вытесняет предыдущий из стационарной фазы [7].

Теория процесса вытеснительной хроматографии только начинает разрабатываться, и в большинстве случаев параметры процесса подбираются эмпирическим путем. При удачно подобранных условиях степень перекрывания зон компонентов во фронте вытеснения незначительна, что позволяет использовать гораздо большие удельные нагрузки на сорбент, чем в случае элютивного способа [8].

Как правило, эффективность фронтально-вытеснительного препаративного хроматографического процесса зависит от следующих параметров - состава исходной разделяемой смеси и требуемого качества целевых продуктов, что определяет удельную нагрузку на сорбент, а также требования к сорбенту и начальному составу мобильной фазы; - характеристик используемого сорбента, которые определяют его емкость, селективность, динамику массообмена, совместимость с компонентами разделяемой смеси; - начального состава и скорости мобильной фазы, которые определяют состав динамической стационарной фазы, а также условия формирования первичного фронта вытеснения адсорбированных компонентов разделяемой смеси за счет реализации эффекта самовытеснения; - условий элюирования хроматографической колонны (градиент, скорость потока и др.), которые определяют порядок элюирования и степень перекрывания хроматографических зон разделяемых компонентов, то есть выход и качество получаемых продуктов.

В случае хроматографической очистки инсулинов проблема подбора параметров процесса усложняется высокой лабильностью молекул инсулина, а именно их способностью быстро и необратимо денатурировать под действием самых различных факторов, в том числе при контакте с гидрофобными и некоторыми металлическими поверхностями, в присутствии целого ряда неорганических и органических соединений, при повышении или значительном понижении температуры и др. [9] .

По этой причине в технологических процессах очистки инсулинов необходимо использовать только полностью совместимые с ними материалы и реагенты. Требования стабильности инсулинов накладывают определенные ограничения на температурные условия процесса, на материалы колонок, фильтров и трубопроводов, а также на сорбенты и состав мобильных фаз [10].

В научно-технической и патентной литературе приведены примеры использования различных препаративных хроматографических методов в очистке инсулинов различной природы.

Гель-проникающую хроматографию предложено использовать для очистки инсулинов от примесей димерных и полимерных инсулинов [11]. Однако, данный вид хроматографии можно применять только в элютивном варианте, то есть при небольших удельных нагрузках и низких скоростях элютрования, что делает указанные процессы экономически неэффективными.

Ионообменную препаративную хроматографию, в частности на карбоксиметил-, диэтиламиноэтил- и других ионообменных сорбентах предложено использовать для очистки инсулинов от инсулиноподобных примесей, в частности от дезамидоинсулинов [12]. Однако, и в этом случае подобранные условия позволяют использовать лишь невысокие удельные нагрузки на сорбент, что снижает эффективность процесса.

Обращенно-фазовую препаративную хроматографию предложено использовать для очистки инсулинов от проинсулинов и других инсулиноподобных примесей.

Приведенные в литературе данные свидетельствуют об успешном применении в этом случае фронтально-вытеснительного способа хроматографирования. Однако, в указанных работах достаточно высокая удельная нагрузка на сорбент (около 10% от полной сорбционной емкости сорбента) и требуемые выходы очищенных целевых продуктов достигались лишь при использовании высокоэффективных колонн и хроматографических систем высокого давления [13].

Мы обнаружили, что достаточно эффективной очистки инсулина от инсулиноподобных примесей и проинсулина с реализацией фронтально-вытеснительного способа хроматографирования можно достичь на низкоэффективных сорбентах с использованием хроматографических систем низкого давления за счет комбинирования методов обращенно-фазовой и анионообменной препаративной хроматографии. При этом удельная нагрузка на сорбенты составляет не менее 30% от их полной сорбционной емкости, что значительно превышает приведенные в литературе показатели.

Наиболее близким аналогом по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ очистки инсулина путем использования хроматографических методов [14].

Недостатками [14] являются невозможность получения инсулина требуемой чистоты.

Техническим результатом изобретения является высокая степень очистки инсулина с содержанием не менее 97% основного вещества, не более 0,001 проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%.

Технический результат достигается тем, что в способе очистки природного инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней, включающем различные типы хроматографии, согласно изобретению, хроматографическую очистку осуществляют последовательно в две стадии обращенно-фазовым и анионообменным методами во фронтально-вытеснительном режиме с использованием селективной десорбции целевого продукта с хроматографических колонн.

Оптимальными условиями достижения указанного результата являются следующие: - в качестве исходного сырья используют инсулин-сырец с содержанием основного вещества не менее 80%, наиболее предпочтительно содержание не менее 90%; содержание проинсулина, дезамидоинсулинов, полимерных инсулинов и других инсулиноподобных примесей составляет не более 5% каждой, наиболее предпочтительно содержание не более 3% каждой примеси; - хроматографическую очистку осуществляют после предварительной очистки раствора исходного инсулина-сырца от нерастворимых и липидо-пигментных примесей последовательной фильтрацией через мембранный фильтр и фор-колонку с сорбентом в условиях, обеспечивающих эффективное отделение липидо-пигментных примесей, с получением раствора технического инсулина; - стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют на препаративном хроматографе низкого или среднего давления, который позволяет реализовать режим последовательной и параллельной работы не менее двух хроматографических колонн с использованием прямого и обратного потока элюирующих растворов, а также ступенчатого или градиентного элюирования; - стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют путем нанесения исходного раствора технического инсулина на последовательно соединенные колонны в режиме фронтально-вытеснительной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание загрязняющих примесей-проинсулина и полимерных инсулинов на предколонне, с последующим разъединением колонн и градиентным элюированием рабочей колонны с постепенным увеличением содержания органического модификатора в элюирующем растворе в специально подобранных условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с сорбента и одновременно эффективное вытеснение целевым продуктом инсулиноподобных примесей;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии проводят на гидрофобных сорбентах на основе силикагеля, поверхность которого модифицирована мономерными или полимерными силоксанами, содержащими углеводородные радикалы C4-C20, наиболее предпочтительны радикалы C12-C18; диаметр пор указанных сорбентов составляет 10-30 нм, наиболее предпочтителен интервал 15-20 нм; удельная поверхность сорбентов составляет 80-300 м/г, наиболее предпочтителен интервал 100-200 м/г; размер частиц составляет 30-70 мкм, наиболее предпочтителен размер 30-50 мкм; форма частиц сорбента - сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; полная сорбционная емкость сорбентов по инсулину составляет не менее 80 г/л сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не вызывает денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на сорбент исходного инсулина-сырца используют его растворы с концентрацией белка 50-200 мг/мл, наиболее предпочтительна концентрация 80-150 мг/мл, в смеси водных растворов ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид или фосфат, наиболее предпочтителен сульфат, в качестве катионов используют аммоний, натрий или калий, наиболее предпочтителен аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, изобутанол, а также ацетонитрил, диметилформамид или диметилацетамид, наиболее предпочтителен этанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,1 моль/л, наиболее предпочтительна 0,03-0,07 моль/л; концентрация органического модификатора составляет 10-20 об.%, наиболее предпочтительна 12-15 об.% ; значение pH раствора исходного инсулина-сырца составляет 2,0-3,5, наиболее предпочтительно значение 2,5-3,0; линейная скорость жидкой фазы внутри хроматографической колонны составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,4 см/мин;
- количество вводимого в колонны частично очищенного инсулина-сырца составляет 10-40 вес. % от полной емкости используемого обращенно-фазового сорбента, наиболее предпочтительно количество 20-30 вес.%;
- стадию анионообменной хроматографии осуществляют путем введения раствора частично очищенного с помощью обращенно-фазовой хроматографии инсулина-сырца в колонку с анионообменным сорбентом в режиме фронтальной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание с сорбентом дезамидоинсулина и других подобных загрязняющих примесей, с последующим элюированием колонны с увеличением содержания ионного модификатора в элюирующем растворе в условия, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента;
-стадию анионообменной хроматографии проводят на сорбентах на основе силикагеля или гидрофильного пористого полимера, поверхность которого модифицирована химическими ионогенными группами, обладающими свойствами слабых анионообменников, наиболее предпочтительны диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ)- группы; диаметр пор указанных сорбентов составляет 15 - 50 нм, наиболее предпочтителен диаметр 20-30 нм; размер частиц составляет 20-150 мкм, наиболее предпочтителен размер 20-50 мкм; форма частиц сорбента сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; обменная емкость анионообменника составляет не менее 0,1 мэкв/мл сорбента; полная сорбционная емкость по инсулину составляет не менее 30 мг/мл сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не должен вызывать денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на анионообменник используют раствор инсулина с концентрацией белка 20-50 мг/мл, наиболее предпочтительна 25-30 мг/мл; в водных растворах ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид и фосфат, наиболее предпочтительны сульфат и хлорид; в качестве катионов используют натрий, калий и аммоний, наиболее предпочтительны калий и аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, изо-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрил, деметилформамид и диметилацетамид, наиболее предпочтителен изопропанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,05 моль/л, наиболее предпочтительна концентрация 0,013-0,017 моль/л; объемная концентрация органического модификатора в растворе составляет 25-35 , наиболее предпочтительна концентрация 28-30 об; значение pH исходного раствора инсулина составляет 7,5-8,5, наиболее предпочтительно значение 7,8-8,0; линейная скорость жидкой фазы внутри анионообменной колонки составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,3 см/мин;
- количество вводимого в анионообменную колонну исходного инсулина составляет 30-70 вес.% от полной сорбционной емкости используемого анионообменника по инсулину, наиболее предпочтительно количество 40-60.%;
- все технологические операции по хроматографической очистке инсулина-сырца осуществляют при температуре 5 -20^oC, наиболее предпочтительна температура 8-15^oC.

Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример
1,28 кг инсулина-сырца, содержащего 90% основного вещества, 3% проинсулина, 3% дезамидоинсулина, 3% полимерных инсулинов и 1% других инсулиноподобных примесей, растворяют в 10 литрах 0,05 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 10 об.% этанола и необходимое для растворения инсулина количество серной кислоты. Полученный раствор с концентрацией белка 120 г/л pH 2,5 фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр и затем для очистки от липидо-пигментных примесей пропускают через форколонну (10х30 см), содержащую 1,5 кг гидрофобного сорбента (Octadecyl-Silica, 15 нм, 35-75 мкм) со скоростью 60 мл/мин. Для селективной десорбции инсулина форколонну промывают 5 литрами 0,05 М раствора сульфата аммония в 10%-ном водном растворе этанола с pH 2,5.

Полученный раствор частично очищенного инсулина наносят на последовательно соединенные предколонну (20х30 см, 1,5 л сорбента Octadecyl-Silica, 15 нм, 20- 30 мкм) и рабочую колонну (20х50 см, 7 л сорбента Octadecyl-Silica, 15 нм, 35-75 мкм) со скоростью 50 мл/мин. После нанесения инсулина на сорбент колонны промывают 6,5 литрами 0,05 М раствора сульфата аммония в 10%-ном водном растворе этанола с pH 2,5 со скоростью 150 мл/мин.

После промывки предколонну отсоединяют от рабочей колонны и проводят селективную десорбцию инсулина с предколонны 10 литрами 0,04 М раствора сульфата аммония в 25%-ном водном растворе этанола с pH 2,5 со скоростью 150 мл/мин. Селективную десорбцию инсулина с рабочей колонны осуществляют в градиентном режиме со скоростью 200 мл/мин в течение 300 мин, постепенно по заданной программе повышая содержание этанола в элюирующем растворе с 10% до 25%.

В процессе десорбции инсулина с предколонны и рабочей колонны собирают фракции по 3-5 л, состав которых определяют с помощью аналитической количественной ВЭЖХ в описанных в литературе условиях. Объединяют фракции очищенного инсулина, содержащего менее 0,001% проинсулина, менее 1% полимерных инсулинов и менее 1% инсулиноподобных примесей. Получают 30 л раствора, к которому для осаждения инсулина добавляют 30 л воды и с помощью 7%-ного водного раствора аммиака доводят pH полученного раствора до 5,7. Для завершения коагуляции инсулина раствор перемешивают в течение 10 часов при температуре 10-15^oC.

После отстаивания надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 х g в течение 30 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость декантируют, а осадок дважды промывают водой с pH 5,8 с последующими центрифугированием в тех же условиях.

На стадии обращенно-фазовой хроматографии получают 3,8 кг влажной пасты частично очищенного инсулина, содержащей 28% белка. Выход составляет 92% от загруженного инсулина-сырца.

Указанную выше влажную пасту растворяют в рассчитанном объеме 0,015 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 30% изопропанола, с pH 9,5 таким образом, чтобы получить раствор с массовой концентрацией белка 30 г/л. Приготовленный раствор фильтруют через мембранный фильтр и затем наносят на анионообменную колонну (30х50 см, сорбент Amicon DEAE- Silica, 20-50 мкм, 8 л) со скоростью 200 мл/мин. После нанесения исходного раствора инсулина колонну промывают 10 литрами 0,015 М водно-спиртового раствора хлорида калия, содержащего 30% изопропанола, с pH 7,8 со скоростью 200 мл/мин.

Селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента проводят промывкой 20 литрами 0,015 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 30% изопропанола, с pH 7,8 со скоростью 200 мл/мин с последующей промывкой колонны 40 литрами того же элюирующего раствора, содержащего дополнительно 0,015 моль/л хлористого аммония.

В процесс десорбции собирают фракции объемом 3-5 л, состав которых определяют с помощью количественной аналитической ВЭЖХ в описанных в литературе условиях. По результатам анализа объединяют фракции таким образом, чтобы получить инсулин, содержащий менее 1% дезамидоинсулинов.

Из полученного раствора очищенный инсулин кристаллизуют в виде цинкового комплекса в описанных в литературе условиях. После фильтрации и сушки в вакууме получают кристаллическую субстанцию очищенного свиного инсулина, отвечающего международным и отечественным фармакопейным требованиям.

Выход целевого продукта на стадии анионообменной хроматографии составляет 80% от загруженного инсулина.

Настоящее изобретение позволяет использовать высокие удельные нагрузки на сорбенты, составляющие не менее 30% от их полной сорбционной емкости, так как способ предусматривает проведение загрузки и элюирования разделяемых компонентов во фронтально-вытеснительном режиме. В результате получают высокоочищенный инсулин, содержащий не менее 97% основного вещества, не более 0,001% проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%.

Литература
1. British Pharmacopeia, 1993.

2. Патент США N 4129560 (12.12.78).

3. Helenius et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74, N 2.

4. Патент Великобритании , N 881885.

5. McLeod A et al. J. Chromatogr., 1984, 285, 319-331.

6. Сох G.B. J.Chromatogr., 1992, 599, 195-203.

7. Kopaciewicz W. et al. - J.Chromatogr., 1987, 409, 111-124.

8. Lee A.L. et al. - J.Chromatogr., 1988, 443, 31-43.

9. Felinger A. et al. - J. Chromatogr., 1992, 609, 35-47.

10. Snyder R. et al. - J.Chromatogr., 1991, 536, 57-73.

11. Европейский патент N 0547544 A 2 (14.12.92)
12. Kroeff E.P. et al. - J.Chromatogr., 1989, 461, 45-61/
13. Европейский патент N 0474213 A 1.

14. Международная заявка, WO 81/00674.0

Формула изобретения

1. Способ очистки природного инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней, включающий различные типы хроматографии, отличающийся тем, что хроматографическую очистку осуществляют последовательно в две стадии обращенно-фазовым и анионообменным методами во фронтально-вытеснительном режиме с использованием селективной десорбции целевого продукта с хроматографических колонн.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют инсулин-сырец с содержанием основного вещества не менее 80%, наиболее предпочтительно содержание не менее 90%; содержание проинсулина, дезамидоинсулинов, полимерных инсулинов и других инсулиноподобных примесей составляет не более 5% каждой, наиболее предпочтительно содержание не более 3% каждой примеси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку осуществляют после предварительной очистки раствора исходного инсулина-сырца от нерастворимых и липидо-пигментных примесей последовательной фильтрацией через мембранный фильтр и фор-колонку с сорбентом в условиях, обеспечивающих эффективное отделение липидно-пигментных примесей, с получением раствора технического инсулина.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют на препаративном хроматографе низкого или среднего давления, который позволяет реализовать режим последовательной и параллельной работы не менее двух хроматографических колонн с использованием прямого и обратного потока элюирующих растворов, а также ступенчатого или градиентного элюирования.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют путем нанесения исходного раствора технического инсулина на последовательно соединенные колонны в режиме фронтально-вытеснительной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание загрязняющих примесей-проинсулина и полимерных инсулинов на предколонне, с последующим разъединением колонн и градиентным элюированием рабочей колонны с постепенным увеличением содержания органического модификатора в элюирующем растворе в специально подобранных условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с сорбента и одновременно эффективное вытеснение целевым продуктом инсулиноподобных примесей.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии проводят на гидрофобных сорбентах на основе силикагеля, поверхность которого модифицирована мономерными или полимерными силоксанами, содержащими углеводородные радикалы С4-С20, наиболее предпочтительны радикалы С12-С18; диаметр пор указанных сорбентов составляет 10 - 30 нм, наиболее предпочтителен интервал 15 - 20 нм; удельная поверхность сорбентов составляет 80 - 300 м/г, наиболее предпочтителен интервал 100 - 200 м/г; размер частиц составляет 30 - 70 мкм, наиболее предпочтителен размер 30 - 50 мкм; форма частиц сорбента - сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; полная сорбционная емкость сорбентов по инсулину составляет не менее 80 г/л сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не вызывает денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина.

7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что для нанесения на сорбент исходного инсулина-сырца используют его растворы с концентрацией белка 50 - 200 мг/мл, наиболее предпочтительна концентрация 80 - 150 мг/мл; в смеси водных растворов ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид или фосфат, наиболее предпочтителен сульфат; в качестве катионов используют аммоний, натрий или калий, наиболее предпочтителен аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, вторбутанол, трет-бутанол, изобутанол, а также ацетонитрил, диметилформамид или диметилацетамид, наиболее предпочтителен этанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01 - 0,1 моль/л, наиболее предпочтительна 0,03, - 0,07 моль/л; концентрация органического модификатора 10 - 20 об.%, наиболее предпочтительна 12 - 15 об.%; значение рН раствора исходного инсулина-сырца 2,0 - 3,5, наиболее предпочтительно значение 2,5 - 3,0; линейная скорость жидкой фазы внутри хроматографической колонны 0,1 - 0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2 - 0,4 см/мин.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что количество вводимого в колонны частично очищенного инсулина-сырца составляет 10 - 40 вес.% от полной емкости используемого обращенно-фазового сорбента, наиболее предпочтительно количество 20 - 30 вес.%.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию анионообменной хроматографии осуществляют путем введения раствора частично очищенного с помощью обращенно-фазовой хроматографии инсулина-сырца в колонку с анионообменным сорбентом в режиме фронтальной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание с сорбентом дезамидоинсулина и других подобных загрязняющих примесей, с последующим элюированием колонны с увеличением содержания ионного модификатора в элюирующем растворе в условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что стадию анионообменной хроматографии проводят на сорбентах на основе силикагеля или гидрофильного пористого полимера, поверхность которого модифицирована химическими ионогенными группами, обладающими свойствами слабых анионообменников, наиболее предпочтительны диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ)-группы; диаметр пор указанных сорбентов 15 - 50 нм, наиболее предпочтителен диаметр 20 - 30 нм; размер частиц 20 - 150 мкм, наиболее предпочтителен размер 20 - 50 мкм; форма частиц сорбента сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительная сферическая или сфероидная форма; обменная емкость анионообменника не менее 0,1 мэкв/мл сорбента; полная сорбционная емкость по инсулину составляет не менее 30 мг/мл сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не должен вызывать денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что для нанесения на анионообменник используют раствор инсулина с концентрацией белка 20 - 50 мг/мл, наиболее предпочтительна 25 - 30 мг/мл; в водных растворах ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид и фосфат, наиболее предпочтительны сульфат и хлорид; в качестве катионов используют натрий, калий и аммоний, наиболее предпочтительны калий и аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, изо-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрил, деметилформамид и диметилацетамид, наиболее предпочтителен изопропанол; концентрация ионного модификатора 0,01 - 0,05 моль/л, наиболее предпочтительна концентрация 0,013 - 0,017 моль/л; объемная концентрация органического модификатора в растворе 25 - 35%, наиболее предпочтительна концентрация 28 - 30 об.%; значение рН исходного раствора инсулина 7,5 - 8,5, наиболее предпочтительно значение 7,8 - 8,0; линейная скорость жидкой фазы внутри анионообменной колонки 0,1 - 0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2 - 0,3 см/мин.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что количество вводимого в анионообменную колонну исходного инсулина составляет 30 - 70 вес.% от полной сорбционной емкости используемого анионообменника по инсулину, наиболее предпочтительно количество 40 - 60%.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что все технологические операции по хроматографической очистке инсулина-сырца осуществляют при 5 - 20^oC, наиболее предпочтительна температура 8 - 15^oC.