Фрагмент днк, способ получения натрийправастатина, плазмида экспрессии (варианты), рекомбинантный штамм (варианты)

 

Фрагмент ДНК имеет размер не менее 74 п.о. последовательности N 1. Получают фрагмент частичным перевариванием в направлении 5' --> 3'. Фрагмент ДНК обладает активностью промотора транскрипции в Streptomyces. Соответствует части 5'-некодирующей области в 1 т.п.о., непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, кодирующей цитохром Р-450_SCA-2. Для получения натрийправастатина культивируют штамм Streptomyces lividans ТК 21 или Streptomyces lividans SANK 62795, трансформированный экспрессирующим вектором ген Р-450_SCA-2 Streptomyces carbophilus, 5'-некодирующую область (1 т.п.о.) и фрагмент ДНК, обладающий активностью промотора. Культивирование ведут в среде, содержащей натрий-ML-236В и при условиях, обеспечивающих экспрессию цитохрома Р-450_SCA-2. Натрийправастатин извлекают из трансформантов и/или из культуральной среды. Плазмиды экспрессии конструируют на основе плазмиды pIJ702 с включением в нее фрагментов ДНК, обладающей активностью промотора. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans трансформирован плазмидой для продуцирования Р-450_SCA-2. Изобретение позволяет получить полезные белки в промышленном масштабе. 12 с. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил. , 2 табл.

Настоящее изобретение относится к новой форме промотора транскрипции, ассоциированного с геном, кодирующим цитохром P-450, присутствующий в Streptomyces carbophilus, векторам, содержащим такой промотор, к применению таких векторов при экспрессии белков, особенно, P-450_sca-2 клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, экспрессионным системам, содержащим такие клетки, и к применению таких белков и экспрессионных систем. Настоящее изобретение также дает возможность получения полезных белков в промышленном масштабе с использованием упомянутого промотора.

В последние годы прогресс в области генетической инженерии создал хорошую возможность для введения и экспрессии чужеродных генов в различных микроорганизмах. Особый прогресс достигнут в отношении использования Eshcerichia coli (Е. coli) в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков, и разработанные в результате способы лежат в основе коммерческого применения. Позднее существенный прогресс достигнут в исследованиях дрожжей как промышленной альтернативы E. coli.

Актиномицеты (и, в частности, род Streptomyces) представляют собой прокариотические микроорганизмы, обычно используемые при производстве антибиотиков. Гетерологичную ДНК обычно вводят в актиномицеты, используя систему вектор-хозяин, разработанную в 1980-е Hoopwood et al. [см. Hoopwood, D.A., et al. , (1987), "Methods in Enzymology", 153; 116-166, Academic Press, New York] . Этот метод дал возможность продолжать важные исследования и разработки систем экспрессионных векторов в актиномицетах. Примером промотора транскрипции, пригодного для экспрессионных векторов актиномицетов, является tipA - промотор, индуцируемый антибиотиком тиострептоном [см. Murakami, Т., et al., (1989), J. Bacteriol., 171, 1459].

Натрийправастатин, применяемый при лечении гиперлипемии, обладает полезным фармакологическим действием, поскольку способен понижать сывороточный холестерин [см. Arai, et al., (1988), Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38]. Натрийправастатин получают, главным образом, микробным гидроксилированием натрий-ML-236B - вещества, продуцируемого, нитчатым грибом Penicillium citrinum. Гидроксилирование обычно осуществляют в присутствии актиномицета Streptomyces carbophilus. Доказано, что агент, ответственный за активность гидроксилирования, представляет собой цитохром типа P-450_sca (далее сокращенно обозначаемый "P-450_sca") [см. Serizawa, et al., (1990), Biochimica et Biophysica Acta, 1084, 35-40].

Matsuoka et al. очистили цитохром P-450 из Streptomyces carbophilus, который способен катализировать гидроксилирование натрий-ML-236B в положении 6. Этот P-450_sca отличался тем, что существовал в трех формах - P-450_sca-1, P-450_sca-2 и Р-450_sca-3 [см.Matsuoka, et al., (1989), Eur. J. Biochem., 184, 707-713, и EP-A-0 281245], хотя не установлено, представляют ли эти формы изотопы или продукты различных генов.

Serizawa et al. , клонировали и экспрессировали ДНК, кодирующую P-450_sca-2 из Streptomyces carbophilus [см. патент Японии Kokai No. Hei 6-70780, и Watanabe, I. , et al., (1995), Gene, 163, 81-85]. ДНК, вместе с частью в 1 кб 5'-некодирующей области гена P-450_sca-2, клонировали в мультиреплицированную плазмиду pIJ702, и использовали для трансформации Streptomyces lividans, ТК21. Трансформированный ТК21 Streptomyces lividans конвертировал ML-236B до натрийправастатина даже быстрее, чем S. carbophilus, тем самым демонстрируя, что фрагмент в 1 кб содержит сильную промоторную активность. 5'-Некодирующая область в 1 кб не секвенирована.

В то же время было также установлено, что экспрессия P-450_sca является объектом субстратной индукции транскрипции, т.е., обнаружено, что ML-236B и фенобарбитал усиливают экспрессию Р-450 в 30 раз. Это установлено нозерн-блоттингом, который не обнаружил транскрипции в отсутствие ML-236B, но обнаружил три транскрипта, когда натрий-ML-236В присутствовал. Уровни транскрипции возрастали в течение 6 часов до максимальной степени в присутствии субстрата.

ДНК, кодирующая Р-450_SCA-2, имеет длину 1233 п.о., в то время как промоторная область имеет длину, очень близкую к этой величине - 1013 п.о., что делает трансформацию значительно труднее, чем если для трансформации используют только открытую рамку считывания (ORF). Однако уменьшение длины такого комплекса индуцированного субстратом промотора, с большой вероятностью, сделало бы промотор бесполезным. Кроме того, трансформация хозяина вектором, содержащим как ORF, так и 1-кб область, уже успешно осуществлена, так что нет необходимости в осознании укорачивания ORF или 5'- некодирующей области.

Однако временной лаг в шесть часов до достижения максимального продуцирования P-450 остается проблемой, причем этот временной лаг является основной проблемой при применении в промышленности.

Заявители обнаружили, что уменьшение длины 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном, кодирующим P-450_sca-2, к удивлению, не только устраняет усиливающее действие субстрата ML-236B, но также увеличивает эффективность промотора.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к ДНК, имеющей активность промотора транскрипции, причем упомянутая ДНК соответствует части, но не всей, 5'-некодирующей области в 1 кб, непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, причем упомянутая открытая рамка считывания кодирует цитохром Р-450.

Особенно предпочтительно, когда ДНК имеет активность промотора транскрипции по крайней мере в одном штамме Strep- tomyces carbophilus и/или по крайней мере в одном штамме Streptomyces lividans.

Преимущественно, настоящее изобретение относится к промотору транскрипции для белка, который экспрессируется в актиномицете, предпочтительно - в стрептомицете, который делает возможной существенную экспрессию белка в подходящей экспрессионной системе без транскрипции, которая должна быть индуцирована субстратом для белка. Такая экспрессия является выгодно конститутивной.

Настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательности для всего такого промотора или для его части; к ДНК, обладающей всей или частью активности такого промотора; к векторам, содержащим такие промоторы; к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами; и к способам получения рекомбинантного белка с использованием таких клеток.

Особым преимуществом настоящего изобретения является то, что оно относится к способу получения натрийправастатина посредством использования хозяина, экспрессирующего рекомбинатный белок Р-450, транскрипция которого регулируется таким промотором.

По существу, заявители установили, что уменьшение размера 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном Р- 450 S. carbophilus, в частности, 5'-некодирующей области, ассоциированной с геном P-450_sca-2, оказывает небольшое действие, или вовсе его не оказывает, на максимальную скорость транскрипционного промотирования, и что уменьшение размера также выгодно устраняет требование субстратной индукции. Эффект субстратной индукции является положительным эффектом, так что можно было бы ожидать, что его устранение оставит промотор, который промотирует только транскрипцию, на основном уровне. Вместо этого, укороченные промоторные области действуют значительно лучше, чем основной уровень, ассоциированный с 1-кб промотором. Даже такая небольшая длина как 74 п.о. все еще обладает активностью, имеющей преимущества, по сравнению с промотором в 1 кб.

Кроме того, выясняется, что скорость транскрипции промоторов с уменьшенной длиной является конститутивной, так что высокие скорости транскрипции достигаются сразу, вместо необходимости ждать достижения максимальных скоростей экспрессии, что происходит в течение шести часов после воздействия ML-236B или другого подходящего субстрата. Это обстоятельство является особенно важным для промышленности.

5'-Некодирующая область в 1 кб, имеющая активность промотора транскрипции, и которая непосредственно примыкает к ORF Р-450, также упоминается здесь как 5'-промотор. В частности, предпочтительно, чтобы это был промотор, ассоциированный с геном Р-450 S. carbophilus.

Хотя 5'-промотор относится к промотору, имеющему длину 1 кб, эта величина является только приблизительной длиной области, растягивающей 5' от области начала транскрипции (tsr) ORF. Располагается tsr вблизи позиции 384 последовательности N 1, и инициирующий кодон ATG следует сразу за позицией 428. Конец области, содержащей 5'-промотор, представляет собой сайт SacI, расположенный на 1013 п.о. в обратном направлении ORF. Сайт SacI этой области описан Watanabe et al. (см. выше), которые не определили длину 5'-промотора. Для облегчения обращения, 5'-промотор упоминается здесь как имеющий длину 1 кб, а не 1013 п.о., так как это, по существу, правильно, и не составляет отличительной особенности настоящего изобретения, как станет ясно из дальнейшего. В любом случае, промоторы настоящего изобретения должны быть короче, чем 5'-промотор полной длины в 1013 п.о.

Для 5'-области в 1 кб, соседней с геном Р-450, не является необходимостью содержать полную промоторную область этого гена, хотя размер области приводит к мысли, что на самом деле так и происходит. В действительности, оказывается, что промотор не занимает строго определенную область, вследствие того факта, что, как установили заявители, область менее 74 п.о. длиной еще обладает сравнимой или лучшей" активностью, чем первоначальный 5'-промотор в 1 кб. Однако это также является случаем, когда промоторы по настоящему изобретению обладают значительно лучшей промоторной активностью, когда их длина превышает 160 п.о., предпочтительно - 300 п.о., или больше.

ДНК по настоящему изобретению, также отнесенные здесь к промоторам по настоящему изобретению, соответствуют 5'-промотору в 1 кб, при условии, что они короче в длину, чем 1 кб 5'-промотора. Уменьшение длины может быть осуществлено любым подходящим способом, таким как удаление частей с помощью рестрикционных эндонуклеаз, путем создания специфических, но более коротких, последовательностей, или путем переваривания либо из 3'-, либо из 5'-конца последовательности, причем упомянутые способы включают комбинации вышеперечисленных способов.

Следует хорошо представлять, что промоторы настоящего изобретения должны быть, как правило, двухцепочечными (дц), чтобы проявить промоторную активность, хотя следует хорошо представлять, что настоящее изобретение также предусматривает применение любых комплементарных цепей, составляющих промоторы изобретения. Настоящее изобретение также распространяется на части промоторов, которые, в конечном счете, могут использоваться для конструирования промотора по настоящему изобретению.

Заявители обнаружили, в частности, что 5'-переваривание дает отличные результаты, так что даже составляющая в 74 п.о., расположенная у 3'-конца промоторной последовательности, все еще имеет превосходную активность. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения ДНК по настоящему изобретению соответствует 5'-промотору, частично переваренному в направлении 5'---> 3'. Минимальной длины промоторной ДНК не существует, при условии, что ДНК все еще обладает требуемой промоторной активностью.

Хотя хорошая промоторная активность видна при длине промотора менее 100 п. о. , особенно, у 3'-конца, оказывается, что значительное улучшение активности имеет место при длине от 158 до 320 п.о. Фрагмент в 320 п.о. обладает промоторной активностью почти в 5 раз большей, чем активность фрагмента в 158 п. о. Оба фрагмента являются 3'-концевыми фрагментами 5'-промотора в 1 кб. Это различие в промоторной активности не является критическим для настоящего изобретения, вследствие того факта, что длина в 152 п.о. (разница между двумя длинами) имеет минимальное влияние на трансформацию или экспрессию.

Если для специалиста в этой области техники желательно идентифицировать точную длину промотора, при которой происходит переход между большей и меньшей активностью, то необходимая для этого процедура должна быть совершенно ясна и незатруднительна для специалиста. Однако пользы в идентификации такой длины нет, так как нет ни практического различия, ни какого-либо преимущества, извлекаемого при применении в качестве промоторной последовательности 158 п.о. или 320 п.о.

Следует правильно представлять, что, вообще, предпочтительно использовать промотор скорее с достаточно более высокой активностью, чем с более низкой активностью, с тем, чтобы достичь максимальной транскрипции. Однако может случиться, что скорость транскрипции при использовании промотора с более высокой активностью станет нежелательно высокой, и что слишком много ресурсов хозяина исчерпывается при получении белка. В таком случае был бы желателен менее активный промотор.

Заявители также установили, что существует длина промотора где-то между 428 п. о. и 1 кб, при которой теряется зависимость от субстратной индукции. Хотя такая специфическая длина в 428 п.о. получена 5'-концевым перевариванием, вполне возможно, что любая последовательность в 428 п.о. или подобная, в пределах полной последовательности в 1 кб, может в равной степени служить в качестве промотора.

Как описано выше, потеря зависимости от субстратной индукции является весьма выгодной. Однако в то же время, точная длина, при которой это случается, не является важной. Заявители демонстрируют, что активность промотора, имеющего длину 428 п.о., равноценна или несколько выше, чем полная активность 5'-промотора в 1 кб, по крайней мере, после субстратной индукции в течение одного часа. Таким образом, промотор длиной менее половины длины исходного промотора работает по крайней мере так же хорошо, как первоисточник, но без потребности в субстратной индукции. Это означает, что любой процесс, при котором скорость экспрессии является составным элементом, становится выгодным. Длины, превышающие 428 п.о., становятся все в большей степени громоздкими, не принося пользователю выгоды. Кроме того, в некоторый момент более длинные промоторы снова становятся также объектом субстратной индукции, тем самым сводя на нет любое преимущество, приобретенное за счет более коротких промоторов по настоящему изобретению.

Соответственно, ДНК по настоящему изобретению имеет, преимущественно, такую длину, при которой она показывает промоторную активность, равноценную, по существу, или большую, чем активность 3'-фрагментов в 320 и/или 428 п.о. 5'- промотора. В частности, представляется, что длина промотора не должна быть настолько велика, чтобы он подвергался субстратной индукции.

Термин "субстратная индукция" хорошо известен в технике. По существу, в природе часто требуются только определенные продукты экспрессии, когда присутствует определенный субстрат, на котором они могут действовать. В отсутствие упомянутого субстрата микроорганизм будет растрачивать ресурсы путем экспрессии продукта. Соответственно, различные системы в природе развились таким образом, что экспрессия продукта происходит только в присутствии субстрата.

В случае Р-450_sca-2 это достигается с помощью такого субстрата, как ML-236B, действующего в промоторном сайте с индуцированием транскрипции мРНК. Это не означает, что не существует другого средства, кроме ML-236B, которое является природным субстратом для цитохромов P- 450_sca. Могут существовать другие субстраты, в том числе, любые, которые являются предполагаемыми субстратами, если они отличаются от ML-236B, которые могут индуцировать 5'-промотор. Другим примером подходящего субстрата для индуцирования 5'-промотора, как упоминалось выше, является фенобарбитал. Однако точная природа индуцирующего фактора для 5'-промотора не является важной для настоящего изобретения, и в дальнейшем не будет здесь обсуждаться.

Хотя настоящее изобретение не претендует на теоретические выкладки, кажется вероятным, что, к удивлению, индукция цитохромов Р-450_sca-2 с помощью субстрата каким-то образом преодолевает блокировку транскрипции. Затем, как представляется, уменьшение размера промоторной области в 1 кб, особенно, путем переваривания 5'-конца промотора, служит для удаления блокировки. По этой причине заявители полагают, что не существует определенной длины промотора, при которой возобновляется субстратная индукция, скорее, промоторная активность снижается с возрастанием длины, начиная с определенного момента, так как восстанавливается блокировка промотирования транскрипции. Может начаться субстратная индукция, которая по эффективности прямо пропорциональна регенерации блокировки промотирования транскрипции, или она может быть только вероятной сразу по достижении определенной длины. В любом случае, предпочтительны промоторы, активность которых не снизилась вследствие возрастания длины чуть за 500 п.о. Иными словами, промоторы, которые имеют длину, превышающую 500 п.о., точнее - превышающую 428 п.о., и которые показывают снижение активности, не являются предпочтительными.

ДНК по настоящему изобретению соответствует части, или частям 5'-промотора. Под термином "соответствует" подразумевается, что ДНК по изобретению имеет тип промоторной активности, подобный типу активности 5 - промотора в том смысле, что она может служить для активирования транскрипции ORF цитохрома P-450_sca. Уровень, при котором происходит такое активирование, не является существенным признаком настоящего изобретения, и здесь не описываются уровни промоторной активности промоторов по настоящему изобретению. Единственным требованием является требование, чтобы промоторы по настоящему изобретению имели активность, которая, в определенном случае по крайней мере, лучше, как описано выше, чем активность 5'- промотора.

Промоторы настоящего изобретения могут непосредственно соответствовать части или частям 5'-промотора. В рядовом варианте осуществления изобретения 5'-промотор может быть переварен с 5'-конца, так что получающийся в результате промотор изобретения имеет ту же последовательность, что и остающаяся 3'-часть 5'-промотора. Если 5'-промотор переваривается из 5'-конца, а часть также удаляется посредством эндонуклеазного переваривания и лигирования, тогда получающийся в результате промотор изобретения будет соответствовать непосредственно двум важным частям 5'-промотора. В обоих этих примерах получающийся в результате промотор имеет последовательности, идентичные одной или нескольким частям 5'-промотора.

Промотор по настоящему изобретению будет, вообще, содержать одну или несколько последовательностей, подобных или идентичных последовательности или последовательностям 5'-промотора. Однако нуклеотидная последовательность промоторов по изобретению не нуждается в прямом соответствии последовательностям 5'-промотора. Хотя, вообще, предпочтительно, чтобы промоторы по изобретению участвовали в весьма существенной гомологии последовательностей с важными частями 5'-промотора, которым они соответствуют, это обстоятельство не является существенным. Единственным требованием является наличие требуемой промоторной активности.

Промоторы по настоящему изобретению могут отличаться от исходного 5'-промотора настолько, насколько это желательно, при условии, что получающийся в результате промотор все еще показывает требуемую промоторную активность. Вообще, путем изменения последовательности приобретается незначительное преимущество, и нет гарантии, что изменением последовательности оснований будет достигаться что-либо иное, кроме разрушения или падения промоторной активности. Однако не являются невозможными некоторые изменения последовательности оснований, чтобы получить какой-либо заметный эффект, особенно, если они не требуются для последовательности оснований, которая кодирует белок.

Изменения последовательности оснований, как правило, будут происходить через процедуру трансформации, или могут осуществляться, для удобства, таким образом, чтобы ввести, например сайт рестрикции. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает промоторы, которые отличаются от части, или от частей, 5'-промоторной последовательности, которой они соответствуют, путем, например делеций, инверсий, инсерций и замещений. В природе также могут происходить изменения встречающейся в природе 5'-промоторной последовательности, и промоторы изобретения на основе таких вариантов, также предусмотрены.

Другие различия и изменения последовательности и способы их осуществления будут достаточно ясны для специалистов в этой области техники, и настоящее изобретение их все предусматривает. Промоторы по настоящему изобретению, которые изменяются путем иным, чем природное изменение, также относятся к настоящему как мутанты, так что как мутанты, так и варианты охватываются настоящим изобретением. Однако следует отчетливо представлять, что экспрессия, "соответствующая части, но не всей 5'-некодирующей области в 1 кб, непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, причем упомянутая открытая рамка считывания кодирует цитохром P-450_sca", включает в себя все такие мутанты и варианты.

В основном, подходящие мутанты и варианты могут гибридизоваться при 60^oC в 6 х SSC с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность 1-428 последовательности N 1 из списка последовательностей. ДНК, с которой гибридизуются мутанты и варианты, может или не может образовывать часть более длинной последовательности.

Как обсуждалось, промоторы по настоящему изобретению обнаруживают превосходную активность к 5'-промотору в 1 кб. Это вовсе не означает, что уровень транскрипции ORF-объекта для активирования промотором по изобретению является более высоким, чем уровень, активированный 5'-промотором в 1 кб при индуцировании субстратом. Вместо этого, часто случается, что конститутивное активирование промотором по изобретению служит для обеспечения таких уровней белковой активности, которые являются еще более высокими после одночасового периода, например, по сравнению с уровнями, получаемыми с 5'-промотором после одночасовой субстратной индукции. Такое конститутивное продуцирование может быть далеким от предпочтительного для ослабления наращивания, которое впоследствии достигает уровней, которые, например превышают либо требуемые, либо полезные.

Хотя ДНК по настоящему изобретению пригодны, преимущественно, в случае цитохромов Р-450_sca, следует отчетливо представлять, что они могут попользоваться в сочетании с любой подходящей последовательностью для экспрессии в любом подходящем прокариотическом хозяине. В частности, промоторы по настоящему изобретению могут применяться в подходящих хозяевах-актиномицетах, особенно, в стрептомицетах. Промоторы изобретения соответствуют части или частям промотора, происходящего из S. carbophilus, и требуемая промоторная активность демонстрируется, если промотор изобретения способен активировать транскрипцию ORF цитохрома P-450_sca.

На основании вышесказанного, следует правильно представлять, что при оперативном связывании с подходящей ORF образуются другие промоторы изобретения. Также образуются векторы, такие как плазмиды, содержащие промоторы изобретения, особенно, когда промотор оперативно ассоциируется с ORF, и хозяева, содержащие такие векторы.

Нужные векторы необязательно являются экспрессирующими векторами. Такие другие векторы могут использоваться для мультиплицирования промоторов изобретения, или для обеспечения легко доступной библиотеки. Однако экспрессирующие векторы являются предпочтительными, и экспрессирующие системы, содержащие хозяина и экспрессирующий вектор изобретения, являются особенно предпочтительными.

В настоящее время особенно предпочтительно использовать S. lividans, когда в качестве клетки-хозяина для экспрессии продуктов из гетерологичной ДНК используют актиномицет. В случае цитохромов P-450_sca, особенно, P-450_sca-2, S. lividans также экспрессирует необходимую систему переноса электронов для возможности для цитохрома принимать участие в гидроксилировании ML-236B. Однако любой другой подходящий белок или продукт экспрессии также может быть экспрессирован через экспрессирующую систему, содержащую промотор настоящего изобретения.

Как правило, не является предпочтительной экспрессия эукариотической ДНК в прокариотах, таких как S. lividans, так как определенные посттрансляционные события, такие как гликозилирование, не имеют места в прокариотах, которые встречаются в природе в эукариотах. Однако это не предотвращает экспрессии эукариотических продуктов в системах настоящего изобретения, при условии, что существует понимание того, что любые требуемые посттрансляционные модификации, не происходящие в природе в экспрессирующей системе, не будут происходить без специальной пищи дли них.

Экспрессирующие системы настоящего изобретения особенно пригодны для экспрессии прокариотических продуктов экспрессии в большом количестве. Продукты экспрессии могут быть получены даже в еще больших количествах, если в экспрессирующей системе используются мультикопийные плазмиды, такие как pIJ702.

Экспрессирующие системы настоящего изобретения более пригодны для экспрессии продуктов, которые обычно экспрессируются только после субстратной индукции. Такие системы могут использоваться в процессах для получения некоторых веществ, таких как антибиотики. Такие процессы возможны, например, когда продукт экспрессии обладает активностью для превращения субстрата в конечный продукт, или в более поздний промежуточный продукт, или даже для разрушения субстрата. Такой процесс может вовлекать сокультуру экспрессирующей системы, если это уместно, с системой, продуцирующей субстрат, на который будет оказываться действие.

При условиях, при которых продукт экспрессирующей системы изобретения является нормально индуцируемым субстратом, сокультивация с субстратом, продуцирующим экспрессионную систему, обычно будет испытывать временный лаг, и появляется необходимость ожидания для экспрессирующей системы, чтобы продуцировать продукт экспрессии в достаточной степени. Используя экспрессирующие системы по настоящему изобретению, эту проблему устраняют, так как продукт синтезируется системой автоматически, исключая необходимость субстратной индукции, за счет чего устраняется фактор временного лага.

Следует правильно представлять, что экспрессирующие системы по настоящему изобретению являются особенно применимыми для экспрессии цитохромов Р-450, особенно, цитохромов P-450_sca, и наиболее специфически - цитохрома P-450_sca-2. Р-450_sca-2 экспрессируется S. carbophilus, как описано выше, и при получении натрийправастатина S. carbophilus сокультивируют, преимущественно, с Penicillium citrinum. В этой системе Р-450_sca-2 служит для гидроксилирования субстрата ML-236B, экспрессированного Penicillium citrinum, но только после задержки, хотя ML-236B индуцирует транскрипцию Р-450_sca-2. При использовании экспрессирующей системы настоящего изобретения более нет необходимости иметь лаговый период при производстве натрийправастатина, и это обстоятельство ведет к большим выгодам при промышленном производстве натрийправастатина.

Ниже описываются некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Предпочтительные промоторы настоящего изобретения гибридизуются с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность 1-428 или 1-320 последовательности N 1.

Промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность 1-428 последов. N 1 являются предпочтительными. Промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность 1-320 последов. N 1, также являются предпочтительными. Настоящее изобретение также относится к мутантам и вариантам таких промоторов.

Рассматриваются также векторы рекомбинантных ДНК, содержащие промоторы по настоящему изобретению, в частности, когда такие векторы содержат ДНК, кодирующие нужный полипептид под контролем промотора, и при этом вектор способен экспрессировать полипептид в подходящей клетке-хозяине. Предпочтительно, когда полипептид представляет собой цитохром P-450_sca-2.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами. Предпочтительными клетками-хозяевами являются актиномицеты, в частности, Streptomyces lividans. Особенно предпочтительным является Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Настоящее изобретение также относится к способу получения нужного полипептида, такого, как определяется выше, причем упомянутый способ включает культивирование трансформированной клетки-хозяина, определение которой дается выше, при условиях, допускающих продуцирование полипептида, чтобы продуцировать полипептид, и извлечение полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способу получения натрийправастатина, который включает культивирование штамма TK21 Streptomyces lividans, трансформированного экспрессирующим вектором изобретения, кодирующим Р-450_sca-2, в среде, содержащей натрий-ML-236B, и при условиях, допускающих продуцирование цитохрома Р-450_sca-2, и позволяющих превращать натрий-ML-236B в натрийправастатин в трансформированных клетках путем каталитического действия продуцированного в них цитохрома Р-450_sca-2, с последующим извлечением натрийправастатина из упомянутых трансформантов и/или упомянутой среды. Трансформированный штамм, предпочтительно, представляет собой Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM ВР-5299). Также предпочтительно, чтобы ML-236B продуцировался Penicillium citrinum, который сокультивируют с упомянутым штаммом.

Промотор 5' не гомологичен какому-либо известному промотору, имеет ли он источником актиномицет или имеет какой-либо другой источник. Подобно другим промоторам, промоторы по настоящему изобретению вызывают инициацию транскрипции ДНК, кодирующей белок или полипептид в мРНК. Этот этап является первой частью внутриклеточного биосинтеза белков или полипептидов (термины, которые здесь являются взаимозаменимыми). Таким образом, промоторы изобретения являются промоторами транскрипции, причем эта функция обозначается как активность промоторов транскрипции. Промотор 5', как и промоторы, содержащие последовательности в 428, 320, 158, 101 и 74 п.о. последов. N 1, все обладают такой активностью.

Следует представлять, что промоторы по настоящему изобретению могут иметь одну или несколько дополнительных пар оснований, связанных в тандем, в обратном и/или прямом направлении. Такие дополнительные последовательности ограничены только в том, что не должна реинтродуцироваться субстратная индукция в заметной степени, и также в том, что должна сохраняться промоторная активность в полезной степени.

Полипептиды под контролем промоторов настоящего изобретения могут быть такими, как описано выше. Следует представлять, что они могут иметь любую аминокислотную последовательность, такую как, например, последовательность природной, вариантной или полимерной формы нового или известного белка; слитой формы двух или нескольких различных белков; или заново созданного полипептида. Как описано выше, предпочтительным полипептидом является цитохром Р-450_sca-2.

Что касается векторов, следует отчетливо представлять, что вектор, который трансформируется, должен представлять собой вектор, который способен к саморепликации в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, вектор должен содержать самореплицирующуюся последовательность или репликон. В случае актиномицетов, таким предпочтительным вектором является pIJ702.

Что касается хозяина, то особых ограничений нет, кроме того, что он должен быть подходящим для выбранного вектора. Вообще, могут использоваться любые клетки-хозяева, такие как клетки, собранные у дикого типа, или клетки могут быть приобретены путем закупки или передачи. Предпочтительными клетками-хозяевами являются актиномицеты, предпочтительно - Streptomyces carbophilus или Streptomyces lividans, и наиболее предпочтителен штамм TK21 Streptomyces lividans.

При таком способе получения натрийправастатина, какой описан выше, включающем культивирование трансформированного штамма Streptomyces lividans в присутствии натрий-ML-236B, получающийся в результате натрийправастатин может быть извлечен известными способами.

В простом варианте осуществления изобретения промоторы настоящего изобретения могут быть получены путем клонирования ДНК из Streptomyces carbophilus с использованием методологии Watanabe et al. [Gene, (1955), 163, 81-85]. Предпочтительным штаммом Streptomyces carbophilus, из которого могут быть клонированы промоторы настоящего изобретения, является Streptomyces carbophilus SANK 62585 (FERM ВР-1145).

В представленном варианте осуществления изобретения геномная библиотека может быть получена из полной геномной ДНК Streptomyces carbophilus с использованием в качестве клонирующего вектора, например, pUC18 (который можно получить от Takara Shuzo Ltd., Япония). Следует иметь в виду, что такие библиотеки и векторы образуют часть настоящего изобретения. Затем можно синтезировать олигонуклеотидный зонд на основе, например, предсказанной N-концевой аминокислотной последовательности P-450_sca-2. Этот олигонуклеотидный зонд затем может быть использован для идентификации клона из библиотеки, кодирующей по крайней мере часть P-450_sca-2. Так как N-конец белка кодируется 5'-концом ORF, тогда возможно, что любой клон, идентифицированный таким способом, также будет иметь достаточное количество 5'-нетранслированной и некодируюшей области, которая существует там, где располагается 5'-промотор. Подходящим способом скрининга с использованием библиотеки и олигонуклеотидного зонда является метод гибридизации колоний [см. Mania-tie, Т. , et al., (1982), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк. Любые методы, упоминаемые здесь, которые не сопровождаются какой-либо конкретной ссылкой, будут, как правило, описаны в "Molecular Cloning - A Laboratory Manual"].

Даже если клон, идентифицированный таким или каким-либо иным способом, содержит только часть промотора настоящего изобретения, еще можно получить полный клон. Из клона, содержащего только часть нужной ДНК, можно получить меченный зонд. Этот меченный зонд затем может быть использован в качестве матрицы для последующего скрининга геномной библиотеки, для того, чтобы идентифицировать и выделить клон, содержащий по крайней мере столько 5'-промотора, сколько требуется.

Следует ясно представлять, что настоящее изобретение предусматривает выделение клона, содержащего либо весь 5'- промотор, либо только часть 5'-промотора. Если получена полная последовательность, тогда, чтобы получить промотор по настоящему изобретению, обработку можно продолжить, например, таким способом, как субклонирование. Если получена неполная последовательность, тогда обработку также можно продолжить, как и в случае полной последовательности, или последовательность может быть достаточной как промотор изобретения без какого-либо существенного изменения в последовательности.

Следует также представлять, что предложенный выше способ клонирования и получения промотора по настоящему изобретению не является единственным способом, который можно использовать, и специалисту в этой области техники легко представить другие подходящие для этого способы. Можно изменить любую из стадий или даже общую методологию. Например, можно использовать зонд, полученный из 3'-конца 5'-промотора, а не зонд, соответствующий N-концевой последовательности Р-450_sca-2. Векторы не имеют особых ограничений, и можно использовать любой подходящий клонирующий вектор, такой как различные коммерчески доступные векторы, включая pBR322.

В соответствии с настоящим изобретением, следует также иметь в виду, что промоторы настоящего изобретения могут быть синтезированы химически с использованием сведений, приведенных для последов. N 1. Если промоторы по настоящему изобретению синтезируют химическим способом, тогда это можно осуществить, например, методом со сложным триэфирфосфитом [см. Hunkapillar, М., et al. , (1984), Nature, 310, 105-111]. Синтез возможно также осуществить, например, применяя сочетание методов клонирования и инженерии, используя приведенную здесь информацию. Подходящие способы такого синтеза хорошо известны в технике.

Возвращаясь к первоначально описанному способу получения промотора настоящего изобретения путем скрининга библиотеки, следует заметить, что промоторная ДНК может быть получена из клона, содержащего нужную последовательность, методами, хорошо известными специалистам в этой области техники [см. Maniatis, Т. , et al., (1982), цит. выше]. На пример, можно выделить фракцию плазмидной ДНК, и из плазмидной ДНК можно выделить промоторную ДНК, используя один или несколько ферментов рестрикции.

Предпочтительным штаммом, служащим в качестве источника 5'-промотора, является SANK 62795 Streptomyces lividans. Этот штамм депонирован, в соответствии с условиями Будапештского договора о депонировании микроорганизмов, 21 ноября 1995 в National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, под инвентарным номером FERM BP-5299. Streptomyces lividans SANK 62795 представляет собой актиномицет, содержащий вектор рекомбинантной ДНК pSCA1013-Δ(1013/428), который, в свою очередь, содержит ДНК, имеющую активность промотора транскрипции, и который состоит из нуклеотидной последовательности 1-428 последов. 1 в списке последовательностей, вместе с ДНК, кодирующей цитохром P-450_sca-2, причем плазмида способна продуцировать белок в актиномицетных клетках через активность промотора в 428 п.о.

В прилагаемом списке последовательностей в качестве источника последов. N 1 указывается S. carbophilus SANK 62585, имеющий инвентарный номер FERM ВР-1145. Это первоначальный источник 5'-промотора в 1 кб, которому соответствуют более короткие промоторы настоящего изобретения, и он депонирован Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, в соответствии с условиями Будапештского договора для депонирования микроорганизмов, 5 сентября 1985.

Как S. lividans 62795, так и S. carbophilus 62585 являются типичными примерами S. lividans и S. carbophilus, соответственно, и могут быть культивированы так, как описано в Hopwood, D.A., et al., (1985), "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Норидж, UK, где также описываются физические признаки этих штаммов. Эти два штамма можно отобрать по сопротивлению тиострептону.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, промотор транскрипции, имеющий нуклеотидную последовательность 1-428 последов. N 1 из списка последовательностей, выделяют посредством культивирования Streptomyces lividans SANK 62795 с последующим извлечением из клеток pSCA1013-Δ(1013/428) и перевариванием плазмиды ферментами рестрикции.

Если желательно, нуклеотидную последовательность любой клонированной ДНК можно определить, например, методом химической модификации Максама-Джильберта [см. Maxam, A.M., and Gilbert, W., (1980), Methods in Enzymology, 65, 499-599] , или методом терминации дидезоксицепи с использованием фага M13 [см. Messing, J., and Vieira, J., (1982), Gene, 19, 269-276].

Если желательно установить, гибридизуется ли последовательность специфической ДНК с ДНК, содержащей всю или часть нуклеотидной последовательности 1-428 из последов. N 1 из списка последовательностей, это можно осуществить следующим образом.

А именно, ДНК, которую проверяют, сначала необходимо подвергнуть электрофорезу на агарозном геле. Затем ДНК блоттируют на пленке из нитроцеллюлозы или найлона, после чего ДНК, абсорбированную на пленке, фиксируют путем термообработки или с помощью ультрафиолетового облучения. Затем используют зонд. Зонд имеет нужную длину нуклеотидной последовательности 1-428 последов. N 1, и его метят, например, радиоактивным изотопом, таким как ³²P, биотином, дигоксигенином или ферментом, и получают обычным образом либо по методу рассеянной затравки [см. Feinberg, A.P., et al., (1983), Anal. Biochem., 132, 6-13] , либо по методу "ник"- трансляции [см. Maniatis, Т., et al., (1982), цит. выше].

Нитроцеллюлозную или найлоновую пленку погружают в раствор для гибридизации, содержащий зонд, и затем инкубируют при подходящей, предварительно установленной температуре, такой как 60^oC. После инкубации пленку промывают, и можно определить зонд, применяя способы, соответствующие использованной метке.

Раствор для гибридизации обычно содержит SSC (хлорид натрия - цитрат натрия; 1 х SSC содержит 0,15 М хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия в деионизованной воде). Концентрация SSC в растворе для гибридизации составляет, предпочтительно, 4-8 х SSC, предпочтительнее - 6 х SSC. Температура инкубации составляет, предпочтительно, от 30^o до 70^oC, предпочтительнее - 60^oC.

ДНК, гибридизирующая с ДНК, имеющей всю или часть нуклеотидной последовательности 1-428 последов. N 1 из списка последовательностей, может быть клонирована из различных геномных библиотек описанным способом. Следует иметь в виду, что большая часть промоторов по настоящему изобретению будет гибридизоваться с ДНК, имеющей последовательность 428, а не с последовательностью 320 или с более короткими последовательностями, но длина последовательности, выбранной для экспериментов по гибридизации, может быть легко выбрана специалистами в этой области техники с использованием приведенной здесь информации.

Как описано ранее, ДНК, полученная таким способом, может быть искусственно модифицирована способами, хорошо известными в технике, такими как замещение, делеция или инсерция одного или нескольких нуклеотидов в нужном сайте, например, при помощи сайт-специфического мутагенеза [см. Mark, D.F., et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666]. Необходимо понимать, что настоящее изобретение распространяется на такую ДНК, при условии, что она обладает требуемой активностью промотора транскрипции.

Чтобы подтвердить, что ДНК, полученная так, как описано выше, обладает активностью промотора транскрипции, конструируют вектор, содержащий ДНК, тандемно связанную с ORF, и экспрессируют в подходящем хозяине. Сначала (I) создают вектор рекомбинантной ДНК, при этом ДНК, кодирующая подходящий белок, оперативно сшивается с предполагаемой промоторной ДНК и вставляется в подходящий вектор, такой как актиномицетная плазмида pIJ702 [см. Katz, Е., et al., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714], и затем (II) подходящую клетку-хозяина, которая допускает стабильную репликацию вектора, такую как клетка Streptomyces lividans в случае вектора, созданного из plJ702, трансформируют вектором, причем затем устанавливают уровень экспрессии белка, кодированного кодирующей ДНК.

При вышеописанном методе трансформацию можно осуществить в соответствии с Hopwood, et al. [см. Hopwood, D.A., et al., (1985), "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Норидж, UK] , когда трансформант представляет собой, например, стрептомицет. Следует иметь в виду, что ген, используемый для проверки промоторной активности, как правило, не должен присутствовать или экспрессироваться в хозяине до трансформации.

Уровни транскрипции можно легко установить нозерн-блоттингом, например при нозерн-блоттинге или нозерн-гибридизации [см. Maniatis, Т., et al., цит. выше] клетку-хозяина выращивают после трансформации. Затем РНК экстрагируют и очищают от клетки и подвергают электрофорезу на агарозном геле, и затем РНК блоттируют, например, на пленке из нитроцеллюлозы или из найлона. Зонд (ДНК, РНК или синтетический олигонуклеотид) можно пометить радиоизотопом, таким как ³²P, биотином, дигоксигенином или ферментом, специфически детектирующим ген для белка. Этот зонд затем можно использовать для определения, с помощью гибридизации, транскрибированной из гена мРНК.

Уровни транскрипции также можно легко определить PCR [Polymerase Chain Reaction - полимеразная цепная реакция, см. Innis, М.А., et al., (1990), "PCR PROTOCOLS", Academic Press, Нью-Йорк]. Сначала получают РНК по методу, подобному методу для нозерн-гибридизации. Затем из мРНК, которая действует как матрица, синтезируют кДНК, используя обратную транскриптазу. При обратной транскрипции можно использовать, в качестве праймера, либо олиго (dT) [олиготимидин] , который имеет тенденцию быть скорее неспецифическим, либо олигонуклеотид, имеющий последовательность, гомологичную части гена, кодирующего белок, который экспрессируют. Используя такую кДНК в качестве матрицы, можно осуществить полимеразную цепную реакцию с использованием двух олигонуклеотидных праймеров. Праймеры комплементарны оппозиционным цепям ORF, и сайты, с которыми они комплементары, имеют разделенные местоположения в пределах гена, так что цепи, генерированные PCR, способны гибридизоваться друг с другом. После осуществления реакции в течение заданного времени получающуюся в результате дцДНК подвергают электрофорезу, и детектируют, например, на нитроцеллюлозе, чтобы определить уровень транскрипции нужной ДНК, основываясь на присутствии или отсутствии полосы ожидаемой длины.

Уровни экспрессии продукта могут быть установлены путем определения физиологической активности полученного белка. Так, например, можно получить вектор рекомбинантной ДНК, при этом ДНК, кодирующая белок с заданной активностью, такой как фермент, оперативно соединяется, таким путем как лигирование, с 3'-концом предполагаемого промотора. Затем уровни экспрессии ORF, соединенной с предполагаемым промотором, можно проанализировать способом, соответствующим продукту экспрессии.

В случае, когда такая плазмида кодирует цитохром Р-450_sca-2, и упомянутая плазмида совместима с S. lividans, плазмиду можно ввести в штамм Streptomyces lividans, не продуцирующий P-450_sca-2, и затем в присутствии натрий-ML-236B можно культивировать трансформант. Количество продуцированного натрийправастатина затем указывает на уровень экспрессии P-450_sca-2, как промотированную предполагаемым промотором.

Следует ясно представлять, что способы анализа продуктов экспрессии могут быть приспособлены именно для необходимых продуктов. Например, предполагаемый промотор может быть оперативно связан с геном устойчивости к лекарственным средствам, таким как хлорамфениколацетилтрансферазный ген [см. Gorman, C. M., et al., (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051], или с люциферазным геном [см. de Wet, J. R., et al., (1987), Mol. Cell. Biol., 7, 725-737] , которые могут быть определены методами, хорошо известными в технике. Также могут быть использованы другие способы анализа экспрессии через активность продукта экспрессии.

Другой способ определения экспрессии, например, заключается в распознавании продукта с использованием соответствующего антитела. Снова получают экспрессирующий вектор, содержащий предполагаемый промотор, опреративно связанный с ORF, и трансформируют в подходящего хозяина, и культивируют при подходящих для экспрессии условиях. Культуральную среду или гомогенат трансформированных клеток подвергают действию антитела, и измеряют количество комплекса антиген-антитело. Подходящими способами измерения являются радиоиммуноанализ [см. Berson, R.S., et al., (1973), "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology", Vol. 2A, 2B, North-Holland Publishing Co. , Амстердам], иммуноферментный анализ с аффинной хроматографией [см. Engvall, Е., (1980), Methods in Enzymology, 70 (A), 419-439], вестерн-блоттинг [см. Harlow, Е., et al., (1988), "Antibodies - A Laboratory Manual", p. 471, Cold Spring Harbour Laboratory, Нью- Йорк] и иммунопреципитация [см. Kessler, S.W., et al., (1981), "Methods in Enzymology", 73(B), 442-459], в зависимости от того, каким образом желательно измерить взаимодействие, и помечается ли антитело или антиген каким-либо способом. В любом случае, следует ясно представлять, что настоящее обсуждение этих способов не являются исчерпывающим, и для специалистов в этой области техники будут очевидны другие способы.

Следует также иметь в виду, что для специалистов в этой области техники будут доступны и очевидны многие другие способы определения транскрипционной промоторной активности предполагаемых или фактических промоторов настоящего изобретения, и что настоящее изобретение включает все такие способы. Например, когда белок, который экспрессируют, обладает иными характерными свойствами, чем активность или антигенность, способы, определяемые таким свойством, также, прямо или косвенно, используются для анализа такой активности.

Как только установлено, что ДНК, предназначенная для применения в качестве промотора настоящего изобретения, обладает, как промотор, необходимой активностью, ее можно использовать для построения экспрессирующего вектора для любого подходящего нужного белка. С этой целью можно использовать любого подходящего хозяина, и упомянутый хозяин может или не может быть таким же, как хозяин, которого использовали, чтобы доказать, обладает ли фактически ДНК промоторной активностью. Белок не ограничивается по своей последовательности, и может иметь любую аминокислотную последовательность. Как упоминалось выше, такие последовательности могут выбираться, но не ограничиваться перечисленным, среди природной, вариантной или полимерной формы нового или известного белка (или пептида); слитой формы двух или нескольких типов различных белков (или пептидов); или заново созданного полипептида. Также, как установлено ранее, предпочтительным продуктом экспрессии является цитохром Р-450_sca-2, причем подходящим вектором является pSCAl013-D(1013/428), причем упомянутый вектор можно выделить из Streptomyces lividans, SANK 62795 (FERM ВР-5299).

Следует иметь в виду, что термины "продукт экспрессии", "белок" и "полипептид", вообще, являются взаимозаменяемыми, и используются здесь именно в таком смысле. При определенных условиях, полипептид, транслированный из первоначальной ДНК, не является конечным продуктом, но является промежуточной формой конечного продукта, причем для получения требуемого продукта требуются посттрансляционные модификации. В случае P-450_sca-2 в гем-кольцо в белке необходимо ввести железо, чтобы генерировать конечный продукт экспрессии. Таким образом, хотя термины "продукт экспрессии", "белок" и "полипептид" используются здесь как синонимы, в нужном контексте специалисты в этой области техники распознают различия между этими терминами.

Помимо актиномицетов, примеры подходящих хозяев для промоторов по настоящему изобретению включают такие прокариоты, как Escherichia coli и Bacillus subtilis.

В случае, когда в качестве хозяев используются неактиномицетные штаммы, или когда выбранный актиномицетный штамм не соответствует типу вектора, следует ясно представлять, что вектор должен включать репликон, подходящий для штамма, о котором идет речь, такой как происходящий из вида, который совместим с хозяином. Требуются плазмидный вектор, содержащий ориджин репликации, и последовательности-регуляторы, соответствующие хозяину. В случае, когда промотор настоящего изобретения не работает в конкретном хозяине, и специалисту в этой области техники, чтобы заставить его работать, с трудом удается его модифицировать, даже в присутствии других подходящих регулярных последовательностей, применение такого варианта может ограничивается. Например, такая ситуация может быть пригодной для размножения промотора. Следует отчетливо представлять, что когда такие модификации и/или соответствующие регулярные последовательности легко доступны и/или распознаются специалистами в этой области техники, тогда такие ситуации включаются в настоящее изобретение.

Хотя экспрессирующие векторы настоящего изобретения не нуждаются в особенностях иных, чем те, которые требуются для экспрессии в данном хозяине, следует иметь в виду, что можно использовать критерии врожденного отбора. Такие критерии включают критерии, в соответствии с которыми плазмида предоставляется хозяину - такие свойства, как селективность экспрессии и трансформации, для того, чтобы модифицировать фенотип.

Подходящий способ трансформации для использования с актиномицетом включает образование актиномицетной культуры в сферопластах с использованием лизоцима. Затем добавляют буферный раствор, содержащий векторы рекомбинантных ДНК и полиэтиленгликоль, чтобы ввести вектор в клетки-хозяева, с помощью, например, любого из методов Thompson или Hopwood [см. Thompson, C.J., et al. , (1982), J. Bacteriol., 151, 668-677, или Hopwood, D.A., et al., (1985), "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich] . В качестве селективного маркера в трансформационной плазмиде часто используется ген, устойчивый к тиострептону [см. Hopwood, D. A. , et al. , (1987), "Methods in Enzymology", 153, 116, Academic Press, Нью-Йорк], но настоящее изобретение этим случаем не ограничивается.

Если, для того, чтобы экспрессировать продукт под контролем промотора настоящего изобретения, желательно трансформировать Е. coli, тогда общий соответствующий способ представляет собой способ, при котором к комплементарным клеткам добавляется вектор нужной рекомбинатной ДНК. Компетентные клетки получают, как правило, в присутствии солей, таких как хлорид кальция, хлорид магния и хлорид рубидия [см. Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580].

Альтернативный способ включает электропорацию, которая включает применение импульсов высокого напряжения к суспензии, содержащей хозяина Е. coli и экспрессирующий вектор, посредством чего вызывается включение вектора в клетки [см. Electroporation: Dower. W.J., et al., (1988), Nucleic Acid Res., 16, 6127, и Calvin, N.M., et al., (1988), J. Bacteriol., 170, 2796].

Подходящие селективные маркеры, т.е., маркеры, предоставляющие хозяину определенный фенотип, включают такие маркерные устойчивые к лекарственным средствам гены, как гены, предоставляющие устойчивость к ампициллину или тетрациклину. Однако значительно большее их число будет очевидным для специалистов в этой области техники, и настоящее изобретение, как и во всех других случаях конкретных примеров, не ограничивается перечисленным.

В случае, когда в качестве клетки-хозяина предполагается В. subtilus, подходящим способом является способ, при котором клетки-хозяева получают в протопластах, используя лизоцим. Затем к протопластам добавляют буферный раствор, содержащий векторы рекомбинантной ДНК и полиэтиленгликоль, после чего электропорацией вводят вектор в клетки-хозяева (см. выше) [см. Cheng, S., et al., (1979), Mol. Gen. Genet., 168, 111]. В предпочтительном варианте осуществления изобретения маркер, устойчивый к лекарственным средствам, такой, как маркер для устойчивости к хлорамфениколу, используют в качестве селективного маркера для трансформированной клеточной линии, но следует иметь в виду, что можно использовать и многие другие селективные маркеры.

Независимо от хозяина, нужный трансформант может быть культивирован с использованием способов, хорошо известных специалистам в этой области техники, причем нужный полипептид продуцируется культурой либо внутриклеточно, либо вне клетки, или и так, и так. Среды, которые используют в культуре, можно выбрать подходящим образом среди различных типов сред, обычно применяемых для уместных клеток-хозяев. Вообще, такие условия культивирования, которые принимаются как нормальные для отдельного хозяина, также могут использоваться для экспрессии нужного полипептида, после внесения любых модификаций, обусловленных, например, свойствами полипептида.

Например, типичными питательными веществами для использования в качестве источника углерода для актиномицетов являются глюкоза, сахароза, крахмал, глицерин, крахмальный концентрат, меласса и соевое масло. В качестве источника азота подходящими являются соевая мука, зерно пшеницы, мясной экстракт, пептон, кукурузный экстракт, сухие дрожжи и сульфат аммония. Кроме перечисленного выше, в сочетании, при необходимости, также с успехом могут использоваться неорганические соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, карбонат или фосфат кальция, и добавки для способствования росту микроорганизма или промотирования продуцирования нужного полипептида.

И снова, применимыми для трансформированных микроорганизмов являются методы культивирования, как правило, соответствующие хозяину, о котором идет речь, включая такие методы, как культивирование в жидкой среде и глубокое культивирование, пригодные для производства в промышленном масштабе.

Предпочтительно, чтобы условия культивирования, если нет иных указаний, или специально здесь оговоренных, включали температуру в интервале от 20 до 37^oС, предпочтительно - от 26 до 28^oС.

Продукт экспрессии под контролем промотора настоящего изобретения получают, как правило, внутриклеточно или экстрацеллюлярно, а иногда - и так, и так. Продукт может быть выделен, очищен и извлечен различными методами, которые хорошо известны специалистам в этой области техники, в частности, такими способами, которые основаны на физических или химических свойствах полипептида. В случае, когда полипептид экспрессируется снаружи, полипептид может быть выделен, очищен и извлечен из получающегося в результате супернатанта, например, путем центрифугирования культуральной среды, чтобы удалить клетки.

Чтобы выделить и очистить полипептид, который накопился внутри клеток, клетки сначала суспендируют в растворе, содержащем ингибитор протеазы, и затем гомогенизируют, используя средства, которые обычно хорошо известны специалистам в этой области техники, такие, как, например ультразвуковой гомогенизатор.

Хотя, вообще, нет необходимости в разъяснении настоящего изобретения, следует иметь в виду, что примеры конкретных способов выделения, очистки и сбора нужных полипептидов включают такие методы, как преципитацию белков, ультрафильтрацию, хроматографию на молекулярных ситах (гель-фильтрацию), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, различные соответствующие типы жидкостной хроматографии, в том числе, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), диализ и сочетание перечисленных методов.

В любом случае, следует отчетливо представлять, что, используя настоящее изобретение, нужный полипептид можно легко получить в промышленном масштабе, как с высоким выходом, так и с высокой степенью чистоты.

Следует также отчетливо представлять, что возможно определить активность полипептида, полученного с помощью трансформированных клеток-хозяев настоящего изобретения, используя неочищенный или частично очищенный образец препарата. P-450_sca-2 может быть получен из Streptomyces lividans по способу, описанному выше, и использован непосредственно при получении, например, натрийправастатина. Необходимая для переноса электронов система присутствует в клетках S. lividans, так что получить трансформированный хозяйский микроорганизм, который катализирует гидроксилирование натрий-ML-236B в положении 6, относительно просто.

В приводимом варианте осуществления изобретения промотор, как правило, используют в помощь экспрессии цитохрома, но это затем можно использовать, например, при продуцировании натрийправастатина. Любое количество натрийправастатина, полученного упомянутым способом, затем может быть извлечено по методу Serizawa, et al. [см. Serizawa, N., et al., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. В таком способе можно использовать SANK 62795 (FERM ВР-5299) Streptomyces lividans.

Настоящее изобретение далее будет описываться с помощью примеров, причем примеры являются иллюстративными, но не ограничивающими настоящее изобретение. Любые методы, препараты, растворы и т.п., которые специально не определяются, можно обнаружить в работе "Molecular Cloning - A Laboratory Handbook" (цит. выше). Все растворы являются водными растворами, если нет иных указаний.

В описанных ниже примерах делаются ссылки на фиг. 1-5.

Фиг. 1 представляет собой схему построения плазмиды pSCA1013-Δ(1013/428), содержащей 428 п.о. 5'-некодирующей области гена P-450_sca-2.

На фиг. 2 приводится схема построения плазмиды, содержащих промоторы изобретения в 320, 158, 101 и 74 п.о. [pSCA1013-Δ(1013/320), pSCA1013-Δ(1013/158), pSCA1013-Δ(1013/101) и pSCA1013-Δ(1013/74), соответственно], полученных из 3'-конца 5'-некодирующей области гена Р-450_sca-2.

На фиг. 3 дается рестрикционная карта плазмиды pSCA1013-Δ(1013/428), полученной на фиг. 1.

На фиг. 4 дается рестрикционная карта плазмиды pSCA101, содержащей часть гена 450_sca-2 вместе с 5'-промотором в 1 кб.

Фиг. 5 представляет собой схему построения плазмиды pSCA205, содержащей 5'-промотор и ORF P-450_sca-2.

В примерах демонстрируется, что возможно получить нужный полипептид в микроорганизме-хозяине, используя промотор настоящего изобретения.

Пример 1 Выделение промотора P-450_sca-2 и создание плазмидного вектора для экспрессии цитохрома P-450_sca-2 (1-1) Построение плазмид pSCA101 и pSCA108 Плазмиды pSCA101 и pSCA108 конструируют путем клонирования различных фрагментов области, содержащей ген Р-450_sca-2 и промотор, причем эти фрагменты происходят от геномной ДНК Streptomyces carbophilus, по способу, описанному Watanabe с сотрудниками [см. Watanabe, I., et al., (1995), Gene, 163, 81-85, и патент Японии Kokai No. Hei 6-70780]. На фиг. 4 приводится карта плазмиды pSCA101. Эта плазмида конструируется путем лигирования фрагмента PvuII в 1,7 кб, полученного от геномной ДНК Streptomyces carbophilus, в сайт PvuII pBR322 (получено от Takara Shuzo Ltd., Япония). Этот фрагмент в 1,7 кб содержит целый 5'-промотор гена Р-450_sca-2 и ДНК, кодирующую 5'-конец этого гена. Плазмида pSCAl08 конструируется путем лигирования фрагмента SacI в 2,0 кб, полученного от геномной ДНК Streptomyces carbophilus, в сайт SacI pUC18 (получено от Takara Shuzo Ltd. , Япония). Этот 2,0-кб фрагмент содержит полную кодирующую область гена цитохрома P-450_sca-2.

Детали описанного выше способа приводятся ниже.

(1-2) Конструирование pSCA106 Используя 100 единиц PvuII, переваривают 10 мкг ДНК pSCA101 при 37^oC в течение 3 часов. Переваривание осуществляют в буфере для рестрикции с добавлением фермента (Takara Shuzo). Конкретно, используемый буфер представляет собой H-буфер, поставляемый Takara Shuzo, Япония. В примерах, следующих далее, как и в этом примере, когда используют ферменты рестрикции, но источник и/или буфер не оговариваются, фермент поставляется Takara Shuzo, и его используют в соответствии с рекомендациями изготовителя, и буфер является H-, К- или L-буфером, как требуется, также по поставкам Takara Shuzo.

Продукты реакции ферментативного гидролиза разделяют электрофорезом на 1% (м/о) агарозном геле, причем агарозный гель помещают в камеру для электрофореза типа субмарины, содержащую водный раствор 90 мМ трис-HCl буфера, 90 мМ борной кислоты и 2,5 мМ ЭДТК (рН 8,3), и проводят его при 100 В в течение 3 часов.

После электрофореза гель встряхивают в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 20 минут, чтобы окрасить ДНК. Агарозный срез, содержащий нужный фрагмент в 1,7 кб, вырезают из геля, используя лезвие бритвы. Идентифицировать фрагменты окрашенной ДНК дает возможность длинноволновое УФ-облучение. Вырезанный фрагмент в 1,7 кб переносят в диализную трубку (предел просачивания 12000-14000 Da, Gibco), которую затем запаивают. Затем эту запаянную трубку помещают в камеру для электрофореза типа субмарины, содержащую водный раствор 90 мМ трис-HCl буфера (рН 8,3), 90 мМ борной кислоты и 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК).

Затем фрагмент ДНК элюируют из среза агарозного геля, используя ток в 100 В, в течение 2 часов. Получающийся в результате раствор в диализной трубке затем обрабатывают смесью (50:50 по объему) фенола и хлороформа, чтобы любые загрязняющие белки вынести в органическую фазу. Этот способ традиционен и хорошо известен специалистам в этой области техники. Затем ДНК извлекают из водной фазы обычными приемами преципитации этанолом и сушат при пониженном давлении [см. "Molekular Cloning - A Laboratory Manual", цит. выше]. Этот способ извлечения ДНК из агарозного геля, который описан выше, обозначается здесь как "вырезание".

Используя 10 единиц фермента рестрикции Smal, переваривают 10 мкг ДНК pUC119 (Takara Shuzo) при 25^oC в течение 3 часов. Переваренную ДНК обрабатывают смесью (50:50 по объему) фенола и хлороформа (называемую далее просто фенол-хлороформ), и извлекают преципитацией этанолом, подобно описанному выше, и извлеченную ДНК затем сушат при пониженном давлении.

Вырезанные концы линеаризованной плазмиды дефосфорилируют, используя 4 единицы щелочной фосфатазы (Toyobo). Реакцию дефосфорилирования осуществляют при 37^oC в течение 30 минут в 200 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТК, рН 8,0, приготовлен в дистиллированной воде). После этого раствор обрабатывают фенолхлороформом, и дефосфорилированную ДНК извлекают из водной фазы осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Добавляют 50 нг полученного выше фрагмента PvuII в 1,7 кб к 100 нг дефосфорилированной ДНК SmaI pUC119 в 50 мкл буфера для лигазы (6,6 мМ хлорида магния, 10 мМ дитиотрейтола, 0,1 мМ ATP (аденозин-5'-трифосфат) и 66 мМ трис-HCl, рН 7,6, приготовлен в дистиллированной воде), содержащего 1800 единиц ДНК-лигазы фага Т4 (Takara Shuzo), и в течение 2 часов осуществляют реакцию лигирования. Компетентные клетки штамма HB101 Е. coli трансформируют частью раствора для реакции лигирования по методу Hanahan [см. Hanahan, D., (1980), J. Mol. Biol., 166, 557-580]. Получающиеся в результате трансформированные клетки выращивают в L-среде (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л хлорида натрия, приготовлена в дистиллированной воде), содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Клетки, выращенные в L-среде, затем высевают на твердую L-среду при 37^oC, и отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Колонии, отобранные таким способом, затем размножают на твердой L-среде, и из отобранного числа трансформантов получают плазмидную ДНК. Плазмидную ДНК от каждого трансформанта переваривают с подходящими ферментами рестрикции, и получающуюся в результате ДНК анализируют электрофорезом на агарозном геле, чтобы подтвердить идентификацию трансформанта, содержащего ожидаемую плазмиду. Плазмиду, сконструированную таким путем, называют pSCA106.

(1-3) Конструирование pSCA111 Плазмида pSCA111 содержит 5'-промоторную область гена Р-450_sca-2, из плазмиды pSCA106, лигированной со структурным геном Р-450_sca-2, полученного от pSCA108. Схема построения следующая.

Переваривают 10 мкг ДНК pSCA108, полученной выше, со 100 единицами SacI при 37^oC в течение 5 часов в буфере, снабженном набором (Takara Shuzo). Получающиеся в результате продукты ферментативного гидролиза разделяют электрофорезом на 1% (м/о) агарозном геле, и из геля вырезают фрагмент ДНК SacI в 2 кб.

Одновременно, 10 мкг ДНК pSCA106, полученной, как описано выше, переваривают при 37^oC в течение 3 часов со 100 единицами SacI в буфере, снабженном набором. Продукты ферментативного гидролиза разделяют электрофорезом на 1% (м/о) агарозном геле, и из геля вырезают фрагмент SacI в 4 кб.

Концы полученного таким образом фрагмента SacI в 4 кб дефосфорилируют способом, подобным способу, описанному в разделе (1-2). После дефосфорилирования раствор обрабатывают фенолхлороформом, и осаждением этанолом извлекают ДНК из водной фазы и сушат при пониженном давлении.

Получающийся в результате фрагмент ДНК SacI в 4 кб (100 нг) и 50 нг фрагмента ДНК SacI в 2 кб, полученного в первой части этого раздела, который содержит структурный ген P-450_sca-2, смешивают в буфере для лигазы, содержащем 1800 единиц ДНК-лигазы фага T4, до конечного объема 50 мкл, и проводят реакцию лигирования в течение 2 часов при 16^oC. Компетентные клетки штамма HB101 Е. coli трансформируют частью раствора для реакции лигирования по методу, подобному методу, описанному выше в разделе (1-2), и получают pSCA111.

(1-4) Конструирование pSCA212 Переваривают 10 мкг ДНК из ДНК pSCA111, полученной в 1-3, со 100 единицами каждого из XbaI и PstI в течение 3 часов при 37^oC. Получающуюся в результате переваренную ДНК обрабатывают фенолхлороформом, и ДНК из водной фазы извлекают осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Затем область в обратном направлении гена P-450_sca-2, содержащуюся в pSCA111, выделяют в направлении 5'--->3', как описано у Henikoff [см. Henikoff, S. , (1984), Gene, 28, 351-359]. Добавляют 200 единиц экзонуклеазы 111 (Takara Shuzo) к 10 мкг высушенной ДНК pSCA111 в 100 мкл буфера для экзонуклеазы (50 мМ трис-HCl, 5 мМ хлорида магния, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, рН 8,0, приготовлен в дистиллированной воде), и дают возможность реакции проходить в течение 5 минут при 37^oC. После этого реакцию останавливают путем нагревания при 65^oC в течение 5 минут, и затем реакционный раствор обрабатывают фенолхлороформом. Затем ДНК из водной фазы извлекают осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Получающуюся в результате высушенную ДНК в течение 30 минут при 37^oC обрабатывают 50 единицами маш-нуклеазы (Takara Shuzo) в 40 мкл 30 мМ ацетатного буфера (pH 5,0), содержащего 100 мМ хлорида натрия, 1 мМ ацетата цинка и 5% (по объему) глицерина. Еще раз обрабатывают ДНК фенолхлороформом, извлекают из водной фазы осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Осажденную ДНК при 37^oC в течение 5 минут обрабатывают 5 единицами ДНК-полимеразы фага Т4 (Takara Shuzo) в 10 мкл буфера для ДНК-полимеразы фага T4 [33 мМ трис-HCl, 66 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния, 0,5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Takara Shuzo), pH 7,9, приготовлен в воде]. Обработанную таким образом ДНК затем обрабатывают фенолхлороформом, извлекают осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Сочетание обработок маш-нуклеазой и ДНК-полимеразой фага T4 обеспечивает отсутствие прилипания фрагмента ДНК по 5'- или 3'-концам.

Затем ДНК в течение 30 минут при 37^oC обрабатывают 10 единицами щелочной фосфатазы при конечном объеме 400 мкл буфера для щелочной фосфатазы (50 мМ трис-HCl, 1 мМ хлорида магния, pH 9,0, приготовлен в дистиллированной воде). Продукт реакции затем обрабатывают фенолхлороформом, извлекают осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Получающуюся в результате ДНК смешивают со 100 нг фосфорилированного линкера XbaI (Takara Shuzo) в буфере для лигазы, содержащем 1800 единиц ДНК-лигазы фага T4, до конечного объема 50 мкл, и дают возможность протекать реакции лигирования в течение 2 часов при 16^oC. Компетентные клетки штамма HB101 Е. coli трансформируют частью раствора для реакции лигирования по методу, подобному методу, описанному в разделе (1-2), и получают pSCA212.

(1-5) Конструирование плазмиды pSCA301 Переваривают 10 мкг мультикопийной плазмиды plJ702 [см. Katz, Е., et al. , (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714] при 37^oC в течение 3 часов со 100 единицами SacI и 100 единицами SphI в H-буфере. Продукты ферментативного гидролиза подвергают электрофорезу на 1% (м/о) агарозном геле, и из геля вырезают фрагмент ДНК, соответствующий полосе в 5,4 кб.

Как часть процедуры клонирования, необходимо получить двухцепочечный олигонуклеотид, имеющий внутренние сайты расщепления Hind 111 и EcoRI, а также ДНК-концы, подходящие для лигирования в сайты SacI и SphI. Такой двухцепочечный олигонуклеотид конструируют путем отжига двух одноцепочечных олигонуклеотидов, описанных ниже. Оба олигонуклеотида синтезируют методом с фосфорамидитом, используя синтезатор ДНК (модель 380, Applied Biosystems) [см. Beacage, S. L., et al., (1981), Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862]. Последовательности следующие: последовательность N 2 5'-GATCTAAGCTTGAATTCGCATG-3'; последовательность N 3 5'-CGAATTCAAGCTTA-3'.

Смешивают по 14 мкмолей каждого олигонуклеотида с TE-буфером до конечного объема 400 мкл. Смесь нагревают до 100^oC в течение 5 минут, и затем постепенно охлаждают до 25^oC. Двухцепочечный олигонуклеотид образуется между двумя комплементарными одноцепочечными олигонуклеотидами.

Смешивают 100 нг полученного таким образом двухцепочечного олигонуклеотида с 1 мкг фрагмента в 5,4 кб pIJ702, который переварен с SacI и SphI в буфере для лигазы, содержащем 1800 единиц ДНК-лигазы фага T4, до конечного объема 100 мкл, и дают возможность протекать реакции лигирования в течение 2 часов при 16^oC. Часть реакционной смеси трансформируют в сферопласты, полученные из штамма TK21 Streptomyces lividans. Получающиеся в результате трансформанты культивируют в присутствии тиострептона, чтобы отобрать клетки, содержащие плазмиду. Процедура использования штамма TK21 Streptomyces lividans описана ниже в способе [1]. Плазмидную ДНК затем отделяют от трансформантов, устойчивых к тиострептону, по способу [2], описанному ниже.

Способ [I]
Трансформация штамма TK21 Streptomyces lividans
Трансформацию штамма TK21 Streptomyces lividans осуществляют в соответствии со способом Thompson [см. Thompson, C.J., et al., (1982), J. Bacteriol. , 151, 668-677] . Подробности относительно растворов даются в конце этого протокола.

Инокулируют штрихом штамм TK21 Streptomyces lividans [см. Hopwood, D.A., et al., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2257-2269] в 20 мл жидкой среды GPY и культивируют в течение 3 суток при 28^oC при перемешивании при 120 об/мин. После этого клетки в этой жидкой предкультуральной среде ресуспендируют, используя гомогенизатор Teflon® и 5 мл жидкой среды разводят в 110 мл среды S-GGCY, и затем выращивают клетки еще в течение 24 часов в колбе Sakaguchi при 28^oC, при перемешивании при 120 об/мин. После этого клетки в культуральной среде собирают центрифугированием (10 минут, 4^oC, 1600 х g). Получающийся в результате клеточный осадок промывают Р-буфером и снова центрифугируют (10 минут, 4^oC, 1600 х g), и получают осадок, и стадию промывки осуществляют еще два раза.

Ресуспендируют 1 г промытого осадка клеток в 10 мл Р-буфера, и затем к клеточной суспензии добавляют такой же объем Р-буфера, содержащего 20 мг/мл лизоцима, и все культивируют при осторожном перемешивании в течение 1,5 часов при 30^oC и 120 об/мин. В результате образуются сферопласты TK21 Streptomyces lividans.

Затем суспензию сферопластов дважды фильтруют, каждый раз через 8 слоев марли, и затем центрифугируют в течение 10 минут при 4^oC и 1600 х g, и получают осадок. Осажденные сферопласты затем дважды промывают Р-буфером, как описано выше, и собирают центрифугированием в течение 10 минут при 4^oC и 1600 х g. Осадок ресуспендируют в 0,8 мл Р-буфера, и оставляют его стоять на льду. Затем к 100 мкл суспензии сферопластов добавляют 20 мкл реакционной смеси при реакции легирования, и оставляют суспензию стоять на льду еще в течение 2 минут, после чего к суспензии добавляют 500 мкл Р-буфера, содержащего 20% (м/о) полиэтиленгликоля 1540. Затем суспензию оставляют на льду еще в течение 2 минут, после чего добавляют 5 мл Р-буфера. Затем 100 мкл этой суспензии осторожно наносят слоем на пластину из 10 мл среды для регенерации, содержащей 2% (м/о) бактоагара, и выращивают клетки на этой твердой среде при 28^oC в течение приблизительно 20 часов. Нагревают до 45^oC 5 мл жидкой среды для регенерации, содержащей 0,7% (м/о) бактоагара и 75 мкг/мл тиострептона, и выливают на агаровую пластину. Затем пластину инкубируют при 28^oC, и через 3-5 суток отделяют устойчивый к тиострептону штамм.

Составы сред и буферов, используемых при вышеописанной процедуре трансформации, приводятся ниже. Во всех случаях в качестве растворителя используют дистиллированную воду.

а) Среда GPY
Глюкоза - 20 г/л (м/о)
Полипептон - 10 г/л (м/о)
Дрожжевой экстракт - 1 г/л (м/о) - (pH 7,0-7,2)
б) Среда S-GGCY
Раствор А
Сахароза - 340 г/л (м/о)
Глицерин - 4 г/л (м/о)
Глицин - 1 г/л (м/о)
Казаминовая кислота - 4 г/л (м/о)
Дрожжевой экстракт - 1 г/л (м/о)
Сульфат магния, 7-водный - 1 г/л (м/о)
Хлорид кальция, 2-водный - 0,1 г/л (м/о)
Раствор солей следовых металлов^Д) - 4 мл/л (о/о)
Раствор Б
Дигидрофосфат калия - 20 г/л (м/о)
Дикалийгидрофосфат, 12-водный - 80 г/л (м/о)
Растворы А и Б стерилизуют по отдельности, и 100 мл
А смешивают с 10 мл Б.

в) P-буфер
Сахароза - 102 г/л (м/о)
Сульфат калия - 0,248 г/л (м/о)
Хлорид магния, 6-водный - 2,00 г/л (м/о)
Раствор солей следовых металлов^Д) - 1,98 мл/л (о/о)
Дигидрофосфат калия - 49,5 г/л (м/о)
Хлорид кальция, 1-водный - 3,64 г/л (м/о)
TES (pH 7,2) - 5,67 г/л (м/о)
г) Среда для регенерации
Сахароза - 100 г/л (м/о)
Глюкоза - 9,69 г/л (м/о)
Казаминовая кислота - 96,9 мг/л (м/о)
Дрожжевой экстракт - 1,94 г/л (м/о)
Солодовый экстракт - 4,84 г/л (м/о)
Сульфат калия - 243 мг/л (м/о)
Хлорид магния, 6-водный - 9,84 г/л (м/о)
Дигидрофосфат калия - 48,4 мг/л (м/о)
Хлорид кальция, 2-водный - 2,85 г/л (м/о)
TES (pH 7,2) - 5,56 г/л (м/о)
Раствор солей следовых металлов^Д) - 1,94 мл/л (о/о)
Гидроксид натрия - 0,00484
L-пролин - 2,91 г/л (м/о)
DL-норлейцин - 48,4 мг/л (м/о)
L-тирозин - 0,969 мл/л (о/о)
д) Раствор солей следовых металлов
Хлорид цинка - 40 мг/л (м/о)
Хлорид железа (II), 6-водный - 200 мг/л (м/о)
Хлорид меди (II), 2-водный - 10 мг/л (м/о)
Хлорид марганца (II), 4-водный - 10 мг/л (м/о)
Борат натрия, 10-водный - 10 мг/л (м/о)
Молибдат аммония, 4-водный - 10 мг/л (м/о)
Способ (II)
Получение плазмидной ДНК из актиномицетов
Устойчивый к тиострептону штамм, полученный выше по способу [I], выращивают в течение 3 суток при 28^oC и 200 об/мин в термостате с перемешиванием (Tokyo Dennetsu Keiso Co. Ltd., Япония) в 100 мл среды GPY, содержащей 25 мкг/мл тиострептона. Затем клетки в культуральной среде осаждают центрифугированием при 4000 х g и 4 в течение 10 минут. Получающийся в результате осадок ресуспендируют в 4 мл 25 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего 10 мг/мл лизоцима (Sigma), 50 мМ глюкозы и 10 мМ ЭДТК, и инкубируют при 30^oC в течение 1 часа. После этого клеточную суспензию смешивают с 8 мл 1% (м/о) раствора додецилсульфата натрия, содержащего 0,2 М гидроксида натрия. Получающуюся в результате смесь перемешивают и оставляют стоять на льду в течение 10 минут. После этого к смеси добавляют 6 мл водного раствора 3 М ацетата натрия (pH 4,8), все перемешивают и затем центрифугируют при 11000 х g, при 4^oC в течение 15 минут.

Весь получающийся в результате супернатант вносят в колонку с Qiagen chips 500 (Funakoshi), которую предварительно уравновешивают 10 мл соответствующего буфера [50 мМ 3-(N-морфолино)-пропансульфоновой кислоты ("MOPS"), 750 мМ хлорида натрия, 15% (о/о) этанола, 0,15% (о/о) тритона Х-100, (pH 7,0), приготовлен в воде]. Затем колонку промывают 30 мл промывочного буфера [50 мМ MOPS, 1 М хлорида натрия, 15% (о/о) этанола, pH 7,0, приготовлен в воде] , и затем из колонки элюируют плазмидную ДНК, используя 15 мл буфера для элюирования [50 мМ трис-HCl, 1,25 М хлорида натрия, 15% (о/о) этанола, pH 8,5, приготовлен в воде].

К получающемуся в результате элюату добавляют 10,5 мл изопропанола, и эту смесь центрифугируют в течение 15 минут (11000 х g, 4^oC), чтобы осадить ДНК. Осажденную ДНК ресуспендируют в 400 мкл TE-буфера, к которому затем добавляют 5 мкл 2 мг/мл рибонуклеазы A (Sigma), чтобы удалить любую примесную ДНК, причем дают возможность реакции протекать в течение 30 минут при 37^oC. После этого ДНК обрабатывают фенолхлороформом и осаждают, обрабатывая водный слой этанолом. Осажденную плазмидную ДНК сушат при пониженном давлении.

(1-6) Конструирование pSCA1013-Δ(1013/428)
Переваривают 10 мкг ДНК pSCA301, полученной выше в 1-5, со 100 единицами EcoRI и 100 единицами HindIII в течение 3 часов при 37^oC в H-буфере. Получающийся в результате продукт ферментативного гидролиза обрабатывают фенолхлороформом, и путем осаждения с этаналом из водной фазы извлекают ДНК. Осажденную ДНК сушат при пониженном давлении.

Параллельно, переваривают в H-буфере 10 мкг ДНК pSCA212 со 100 единицами EcoRI и 100 единицами Hind111 при 37^oC в течение 3 часов. Продукты ферментативного гидролиза подвергают электрофорезу на 1% (м/о) агарозном геле, и из геля вырезают фрагмент ДНК в 2,2 кб, кодирующий цитохром P-450_sca-2.

Добавляют 200 нг полученного таким образом фрагмента ДНК pSCA212 в 2,2 кб к 100 нг фрагмента ДНК pSCA301 EcoRI-HindIII в 100 мкл буфера для лигазы, содержащего 1800 единиц ДНК-лигазы фага T4, и осуществляют реакцию лигирования при 16^oC в течение 2 часов. После этого ДНК из реакционной смеси трансформируют в Streptomyces lividans, как описано выше в способе [I], и полученный таким способом устойчивый к тиострептону штамм Streptomyces lividans называют SANK 62795. Плазмидную ДНК из этого штамма получают по способу [2], описанному выше, и эту плазмиду называют pSCA1013-Δ(1013/428).

Способ, описанный в этом разделе, отображается на фиг. 1, и на фиг. 3 показывается карта получающейся в результате плазмиды. Полученная плазмида pSCA1013-Δ(1013/428) способна к репликации в видах актиномицетов. Она содержит приблизительно 0,4 кб из ДНК, происходящей от 5'-промотора гена цитохрома P-450_sca-2, и включает всю кодирующую последовательность P-450_sca-2.

(1-7) Конструирование pSCA205
Обрабатывают HindIII в H-буфере 10 мкг полученной так, как в примере 1-3, pSCA111 при 37^oC в течение 5 часов, после чего реакционный раствор обрабатывают фенолхлороформом и осаждают этанолом, и осажденную ДНК сушат при пониженном давлении. "Затупляют" HindIII-концы pSCA111, используя набор для "затупления" ДНК (Takara Shuzo). Фракцию с тупыми концами обрабатывают фенолхлороформом, ДНК осаждают этанолом и сушат при пониженном давлении.

Полученную ДНК растворяют в 200 мкл TE-буфера, и к раствору добавляют 4 единицы щелочной фосфатазы (Toyobo). Затем этот раствор инкубируют при 37^oC в течение 30 минут, чтобы дефосфорилировать затупленные концы. Затем дефосфорилированный фрагмент обрабатывают фенолхлороформом, извлекают из водной фазы осаждением этанолом и сушат при пониженном давлении.

Затем к 100 нг дефосфорилированной и затупленной pSCA111 добавляют 16,5 нг линкера SacI, и фрагмент циркуляризируют, используя набор для лигирования ДНК (Takara Shuzo), образуя плазмиду pSCA112, в которой сайт HindIII pSCA111 замещен сайтом SacI (см. фиг. 5).

Чтобы получить фрагмент SacI в 2,8 кб из pSCA112, содержащий структурный ген P-450_sca-2 и его промотор, pSCA112 частично переваривают с SacI следующим образом. Обрабатывают 22,1 мкг pSCA112 1250 единицами SacI при 37^oC в течение 22 часов в L-буфере. Получающиеся в результате фрагменты подвергают электрофорезу на 1% (м/о) агарозном геле, и вырезают фрагмент в 2,8 кб. Этот фрагмент переносят в диализную трубку и элюируют против буфера 1 х TBE при 150 B в течение 1,5 часов, и получают Sacl-фрагмент в 2,8 кб. Раствор, содержащий SacI-фрагмент, обрабатывают фенол-хлороформом, и ДНК, осажденную этанолом, сушат при пониженном давлении.

Всю полученную ДНК растворяют в TE-буфере, содержащем 1 г/мл хлорида цезия, и затем добавляют бромистый этидий до концентрации 0,1 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при 120000 об/мин (650000 х g) при 15^oC в течение 2 часов, чтобы отделить SacI-фрагмент в 2,8 кб. Осадок затем три раза экстрагируют изопропанолом, насыщенным хлоридом натрия и содержащим 50 мМ трис-HCl, чтобы удалить бромистый этидий. Промытую жидкость затем диализуют в течение ночи в TE- буфере при 4^oC. Получающуюся в результате фракцию осаждают этанолом, затем промывают водным 70% (о/о) раствором этанола и сушат при пониженном давлении, получают 76 мкг частично очищенного фрагмента SacI (2,8 кб).

Этот частично очищенный фрагмент SacI загрязнен фрагментом ДНК в 3,2 кб, обычно происходящим из pUC119. Чтобы удалить этот фрагмент, 75 мкг частично очищенного фрагмента SacI (2,8 кб) обрабатывают 205 единицами PvuI при 37^oC в течение 12 часов в K-буфере. Продукт реакции затем подвергают электрофорезу на 1% (м/о) агарозном геле, чтобы получить фрагмент SacI в 2,8 кб. Фрагмент, вырезанный из геля, диализуют, как описано выше, но на этот раз только в течение 1 часа, и вымывают фрагмент ДНК. Диализованный раствор обрабатывают фенолхлороформом, осаждают ДНК и сушат при пониженном давлении.

Высушенную ДНК затем растворяют в 2 мл TE-буфера, содержащего 1 г/мл хлорида цезия, после чего добавляют бромистый этидий до концентрации 0,1 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при 120000 об/мин (650000 х g) при 15^oC в течение 2 часов, чтобы отделить SacI-фрагмент в 2,8 кб. Изолят затем три раза экстрагируют изопропанолом, насыщенным хлоридом натрия и содержащим 50 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), чтобы удалить бромистый этидий. После такой промывки фрагмент диализуют в течение ночи в TE-буфере при 4^oC. Эту диализованную ДНК затем осаждают этанолом и промывают водным 70% (о/о) раствором этанола, и сушат при пониженном давлении. Высушенную ДНК растворяют в 20 мкл TE-буфера. Конечный выход составляет 9,8 мкг фрагмента SacI (2,8 кб), содержащего структурный ген P-450_sca-2 и его промотор.

Параллельно в L-буфере обрабатывают 200 мкг pIJ702 300 единицами SacI при 37^oC в течение 20 часов. Раствор обрабатывают фенолхлороформом, и водный слой обрабатывают этанолом, чтобы осадить ДНК. Осажденную ДНК сушат при пониженном давлении. Высушенную ДНК растворяют в 800 мкл TE-буфера, и затем к реакционной среде добавляют 80 единиц щелочной фосфатазы и выдерживают при 37^oC в течение 30 минут. После этого раствор снова обрабатывают фенолхлороформом, и водный слой обрабатывают этанолом для осаждения ДНК, и осажденную ДНК сушат при пониженном давлении. Высушенную ДНК растворяют в TE-буфере, содержащем 1 г/мл хлорида цезия, после чего добавляют бромистый этидий до концентрации 0,1 мг/мл.

Полученный раствор центрифугируют при 120000 об/мин (650000 х g) при 15^oC в течение 2 часов, чтобы отделить pIJ702, обработанную SacI. Полученный осадок три раза экстрагируют изопропанолом, насыщенным хлоридом натрия и содержащим 50 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), чтобы удалить бромистый этидий. Затем фрагмент диализуют в течение ночи в TE-буфере при 4^oC. Эту диализованную ДНК затем осаждают этанолом и промывают водным 70% (о/о) раствором этанола, и сушат при пониженном давлении. Вышеописанный способ дает 37 мкг SacI и обработанной щелочной фосфатазой pIJ702.

К SacI и обработанной щелочной фосфатазой pIJ702 в TE-буфере добавляют 2,4 мкг фрагмента SacI в 28 кб, полученного из pSCA112. Два фрагмента лигируют с помощью набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo). Трансформируют полученной плазмидой TK21 Streptomyces lividans, и плазмиду очищают от трансформанта по методу Hopwood (Hopwood et al., "Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual", John Innes Institute, Norwich, 1985). Плазмиду обозначают pSCA205.

Пример 2
Секвенирование нуклеиновой кислоты
Плазмидную ДНК, полученную так, как описано в примере 1, готовят для секвенирования щелочной денатурацией, применяя способ Zhanq [см. Zhang, Н., et al. , (1988), Nucleic Acids Res., 16, 1220]. Денатурацию осуществляют путем инкубации 5 мкг плазмидной ДНК в течение 5 минут при 37^oC в 20 мкл 10 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего 0,2 мМ ЭДТК и 0,2 М гидроксида натрия. ДНК извлекают из этого раствора осаждением этанолом. Осажденную ДНК промывают 70% (о/о) этанолом и сушат при пониженном давлении. Полученную ДНК используют в качестве матрицы для секвенирования нуклеиновой кислоты.

Секвенирование ДНК осуществляют, используя набор с 7-деазасеквеназой, версия 2,0 (Toyobo). Результат показывает, что 5'-область гена цитохрома Р-450_sca-2, присутствующая в плазмиде pSCA1013-D(1013/428), имеет длину в 428 п.о. Эта последовательность воспроизводится в виде последов. N 1, номера нуклеотидов 1-428.

Пример 3
Получение и измерение количества натрийправастатина
Единичные колонии каждого из штаммов SANK 62795 Streptomyces lividans, TK21/pSCA205 и TK21 S. lividans инокулируют из твердой среды в отдельные 500-мл колбы Эрленмейера, каждая из которых содержит 100 мл дрожжевой среды [2% (м/о) глюкозы, 1% (м/о) пептона, 0,1% (м/о) дрожжевого экстракта (Difco), pH 7,0, приготовлена в дистиллированной воде], содержащей 20 мкг/мл тиострептона. Культуры выращивают в течение 3 суток при перемешивании при 200 об/мин при 28^oC. По 5 мл каждой культуральной среды инокулируют в отдельные, по 100 мл, партии дрожжевой среды, содержащей 20 мкг/мл тиострептона, и затем каждую культивируют в течение 24 часов при 28^oC и 200 об/мин. После этого добавляют натрий-ML-236B до конечной концентрации 500 мкг/мл [см. Endo, A. , et al., (1976), J. Antibiotics, 29, 1346, и Serizava, N., et al., (1983), J. Antibiotics, Vol. XXXVI, N 7, 887-891], и продолжают культивирование при перемешивании при 200 об/мин, при 28^oC, еще в течение 4 часов. После этого извлекают часть каждой жидкой культуры, и используют эту часть для измерения продуцирования натрийправастатина. Каждый образец анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией при следующих рабочих условиях:
колонка - радиальный насадочный стакан C18 (Waters);
растворитель - 0,1% (м/о) фосфатный буфер, содержащий 30% (о/о) ацетонитрила и 0,1% (о/о) триэтиламина, pH 3,2;
скорость потока 1 мл/мин;
длина волны детекции 237 нм;
время удерживания натрийправастатина 11,9 минут.

Осуществляют также хроматографию с известным количеством натрийправастатина при условиях, идентичных условиям, описанным выше, и используют в качестве стандарта для сравнения [см. Serizawa, N., et al., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. Количество натрийправастатина, продуцированного различными штаммами S. lividins, вычисляют путем сравнения площади правастатинового пика на графике детектируемого образца и площади правастатинового пика стандарта с известным количеством правастатина.

Штамм SANK 62795 Streptomyces lividans продуцирует 51 мкг/мл натрийправастатина, TK21/pSCA205 S. lividans продуцирует 11 мкг/мл натрийправастатина, в то время как штамм TK21 Streptomyces lividans не продуцирует натрийправастатин в сколько-нибудь поддающемся определению количестве. Это обстоятельство четко демонстрирует преимущество промоторов настоящего изобретения.

Пример 4
Конструирование плазмид pSCA1013-Δ(1013/320), pSCA1013-Δ(1013/158), pSCA1013-Δ(1013/101) и pSCA1013-Δ(1013/74)
Чтобы лучше охарактеризовать промоторную область гена Р-450_sca-2, конструируют ряд плазмид, которые содержат различные фрагменты 5'-промоторной области, присоединенной к структурному гену P-450_sca-2. Далее обозначение "P-450_sca-2" будет использоваться по отношению к структурному гену, кодирующему интактную аминокислотную последовательность Р-450_sca-2.

Плазмиды настоящего примера, а именно pSCA1013-Δ(1013/320), pSCA1013-Δ(1013/158), pSCA1013-Δ(1013/101) и pSCA1013-Δ(1013/74), конструируют следующим образом. (Детали построения схематически показаны на фиг. 2). Каждая из плазмид имеет вставки с 5'-промоторами, переваренными в направлении 5'---> 3', полученные таким же способом, как описано в примерах 1-4. Поскольку длина переваренного фрагмента после переваривания с экзонуклеазой 111 не может быть предсказана точно, каждая плазмида содержит промотор разной длины.

1) Конструирование pSCA1013-Δ(1013/320)
pSCA213 получают из ДНК pSCA111 процедурой, подобной процедуре, описанной в примере 1-4 (см. фиг. 2). ДНК pSCA213 переваривают с EcoRI и HindIII, и продукты ферментативного гидролиза подвергают электрофорезу на 1% (м/о) агарозном геле, и из геля вырезают фрагмент ДНК EcoRI-HindIII приблизительно в 2,1 кб, содержащий ген Р-450_sca-2 и область 5'-промотора. Вырезанную ДНК обрабатывают фенолхлороформом и извлекают из водной фазы, используя осаждение этанолом, и осажденную ДНК сушат при пониженном давлении.

Переваривают с EcoRI и HindIII 100 нг pSCA301, и обрабатывают, как описано в примере 1-6. Эту ДНК добавляют к приблизительно 200 нг фрагмента EcoRI-HindIII в 2,1 кб, полученного выше, в буфере для лигазы, содержащем 1800 единиц ДНК-лигазы фага T4, до конечного объема 100 мкл, и позволяют протекать реакции в течение 2 часов при 16^oC. После этого лигированную ДНК переносят в Streptomyces lividans, как описано выше в способе [1]. Полученный таким способом устойчивый к тиострептону штамм Streptomyces lividans называют TK21/pSCA1013-Δ(1013/320). Получают из этого штамма описанным выше способом [2] плазмидную ДНК, и эту плазмиду называют pSCA1013-Δ(1013/320).

2) Конструирование pSCA1013-Δ(1013/158)
Плазмиду pSCA214 получают из ДНК pSCA111 процедурой, подобной процедуре, описанной в примере 1-4 (см. фиг. 2). Способом, подобным способу вышеприведенного раздела 1), pSCA214 переваривают с EcoRI и HindIII, и получают фрагмент ДНК EcoRI-HindIII длиной приблизительно в 1,93 кб, содержащий ген P-450_sca-2 и область 5'-промотора. Этот фрагмент используют для трансформации pSCA301, как описано выше в 1).

Полученный таким способом устойчивый к тиострептону штамм Streptomyces lividans называют TK21/pSCA1013-Δ(1013/158). Получают из этого штамма описанным выше способом [2] плазмидную ДНК, и эту плазмиду называют pSCA1013-Δ(1013/158).

3) Конструирование pSCA1013-Δ(1013/101)
Плазмиду pSCA215 получают из ДНК pSCA111 процедурой, подобной процедуре, описанной в примере 1-4 (см. фиг. 2). Способом, подобным способу вышеприведенного раздела 1), pSCA215 переваривают с EcoRI и HindIII, и получают фрагмент ДНК EcoRI-HindIII длиной приблизительно в 1,87 кб, содержащий ген P-450_sca-2 и область 5'-промотора. Этот фрагмент используют для трансформации pSCA301, как описано выше в 1).

Полученный таким способом устойчивый к тиострептону штамм Streptomyces lividans называют TK21/pSCA1013-Δ(1013/101). Получают из этого штамма описанным выше способом [2] плазмидную ДНК, и эту плазмиду называют pSCA1013-Δ(1013/101).

4) Конструирование pSCA1013-Δ(1013/74)
Плазмиду pSCA216 получают из ДНК pSCA111 процедурой, подобной процедуре, описанной в примере 1-4 (см. фиг. 2). Способом, подобным способу вышеприведенного раздела 1), pSCA216 переваривают с EcoRI и HindIII, и получают фрагмент ДНК EcoRI-HindIII длиной приблизительно в 1,85 кб, содержащий ген Р-450_sca-2 и область 5'-промотора. Этот фрагмент используют для трансформации pSCA301, как описано выше в 1).

Полученный таким способом устойчивый к тиострептону штамм Streptomyces lividans называют TK21/pSCA1013-Δ(1013/74). Получают из этого штамма описанным выше способом [2] плазмидную ДНК, и эту плазмиду называют pSCA1013-Δ(1013/74).

5) Определение размера и нуклеотидной последовательности фрагментов промоторов
Длину фрагментов 5'-промотора, присутствующих в каждой из плазмид pSCA1013-Δ(1013/320), pSCA1013-Δ(1013/158), pSCA1013-Δ(1013/101) и pSCA1013-Δ(1013/74), определяют по способу, описанному в примере 2.

Показано, что в плазмиде pSCA1013-Δ(1013/320) ДНК 5' до кодирующей области P-450_sca-2 имеет длину 320 п.о., соответствующую нуклеотидам NN 109-428 последов. N 1.

Показано, что в плазмиде pSCA1013-Δ(1013/158) ДНК 5' до кодирующей области P-450_sca-2 имеет длину 158 п.о., соответствующую нуклеотидам NN 271-428 последов. N 1.

Показано, что в плазмиде pSCA1013-Δ(1013/101) ДНК 5' до кодирующей области Р-450_sca-2 имеет длину 101 п.о., соответствующую нуклеотидам NN 328-428 последов. N 1.

Показано, что в плазмиде pSCA1013-Δ(1013/74) ДНК 5' до кодирующей области Р-450_sca-2 имеет длину 74 п.о., соответствующую нуклеотидам NN 355-428 последов. 11 1.

6) Продуцирование натрийправастатина при посредничестве плазмид
По способу, описанному в примере 3, измеряют продуцирование натрийправастатина для следующих штаммов: TK21/ pSCA1013-Δ(1013/320) Streptomyces lividans, TK21/pSCA1013- Δ(1013/158) Streptomyces lividans, TK21/pSCA1013-Δ(1013/101) Streptomyces lividans и TK21/pSCA1013-Δ(1013/74) Streptomyces lividans. Штамм TK21 Streptomyces lividans используют в качестве контроля. Результаты приводятся в табл. 1.

Таким образом, можно видеть, что все 5'-промоторы плазмид, полученных в этом примере, обнаруживают полезную промоторную активность.

Пример 5
Индукция транскрипции с помощью ML-236B при измерении нозерн-блоттингом
1) Получение полной РНК
Перечисленные штаммы S. lividans, т.е., S. lividans TK 21/pSCA1013-Δ(1013/428), S. lividans TK21/pSCA1013-Δ(1013/320), S. lividans TK21/pSCA1013-Δ(1013/158), S. lividans TK21/pSCAl013-Δ(1013/101) и S. lividans TK21/pSCA1013-Δ(1013/74), культивируют по способу, подобному способу, описанному в примере 3.

Как и в примере 3, в тестовых экспериментах к культуре добавляют натрий-ML-236B до конечной концентрации 500 мкг/мл. Контрольные, или негативные, эксперименты проводят так же, но без добавления ML-236B. На этой стадии после добавления ML-236B в тестовых экспериментах культивирование продолжают при 28^oC и 200 об/мин в течение 1 часа. После этого культуральную среду центрифугируют при 4^oC и 4000 х g в течение 10 минут, и осадки сразу же замораживают в жидком азоте и хранят при температуре ниже -80^oC.

По 3 г каждого замороженного осадка измельчают в порошок в ступке, предварительно охлажденной сухим льдом. Этот порошок затем помещают в центрифужную пробирку, наполненную 15 мл раствора гуанидинтиоцианата [4 М гуанидинтиоцианата (Fluka), 4% (м/о) саркозила (Sigma), 0,1% (м/о) антивспенивателя A (Sigma), 20 мМ динатриевой соли ЭДТК, 4 мМ 2-меркаптоэтанола и 25 мМ тринатриевой соли лимонной кислоты (pH 7,0)], и энергично перемешивают. Клеточный дебрис затем гомогенизируют в течение 30 минут, используя гомогенизатор-политрон. Полученный гомогенат затем центрифугируют при 9000 об/мин (10000 х g) в течение 15 минут при 4^oC. Полученные таким образом супернатанты снова центрифугируют при 9000 об/мин (10000 х g) в течение 15 минут при 4^oС. Затем по 7 мл каждой полученной в результате супернатантной фракции осторожно наливают слоем на 3 мл 5,7 М раствора хлорида цезия, содержащего 0,1 М динатриевой соли ЭДТК, который предварительно помещен в пробирку для ультрацентрифугирования (13 PA: Hitachi Koki Co., Ltd.), и центрифугируют при 4^oC и 30000 об/мин (40000 х g) в течение 15 часов. После этого получающийся в результате осадок растворяют в 0,3 мл 10 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего 1 мМ динатриевой соли ЭДТК ("ТЕ-буфер"), и затем к полученному препарату добавляют 30 мл 3 М буфера уксусная кислота/ацетат натрия (pH 5,2) и 1 мл этанола. Затем этот препарат центрифугируют при 14500 об/мин (18000 х g) в течение 5 минут при 4^oC. Осадок сушат при пониженном давлении и растворяют в 40 мкл ТЕ-буфера, и используют на последующих стадиях как образец полной РНК.

II) Получение зонда
Переваривают в H-буфере 10 мкг pSCA205 со 100 единицами PvuII при 37^oC в течение 3 часов, и проводят электрофорез на 1% (м/о) агарозном геле, чтобы вырезать PvuII-фрагмент в 0.49 кб. Получающийся в результате фрагмент ДНК очищают, используя фенолхлороформ, осаждают ДНК этанолом и сушат при пониженном давлении. Помечают 500 нг этого фрагмента ДНК ³²P- dTCP (2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат) (6000 Ки/ммоль), используя набор для "ник"-трансляции (Amersham). Получающийся в результате меченный PvuII-фрагмент (0,49 кб) дважды осаждают этанолом, чтобы удалить весь непрореагировавший ³²P-dTCP. Полученный зонд растворяют в 400 мл ТЕ-буфера и хранят при температуре ниже -20^oC.

III) Нозерн-гибридизация
Подвергают 10 мкг каждой полной РНК электрофорезу на 1,2% (м/о) агарозном геле при 100 В в течение 4 часов в 20 мМ MOPS-буфере (Sigma), содержащем 0,92 М формальдегида, 8 мМ уксуснокислого натрия и 1 мМ ЭДТК (pH 7,0). После этого гель осторожно встряхивают в 0,1 М ацетате аммония. Затем гель перемешивают в течение 1 часа в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 8,0), содержащем 1 М ацетата аммония. Полную РНК переносят на найлоновую мембрану (PALL Ultrafiltration Corp.) и фиксируют стандартными способами. Найлоновую мембрану затем помещают в 30 мл 5 х SSPE (180 мМ хлорида натрия, 0,1 мМ динатриевой соли ЭДТК, 18,6 мМ дигидрофосфата натрия двуводного и 101 мМ 12-водного гидродинатрийфосфата), содержащего 50% (о/о) формамида, 2,5 х раствора Денхардта [0,2 г/л бычьего сывороточного альбумина, 0,2 г/л фикола 400 (Pharmacia) и 0,2 г/л поливинилпирролидона] и 100 мкг/мл ДНК молок лосося, при 42^oC на 4 часа. Затем найлоновую мембрану вводят в реакцию со 100 мкл меченного фрагмента ДНК, полученного выше (0,49 кб), кодирующей частью P-450_sca-2, при 42^oС в течение ночи в 30 мл 5 х SSPE, содержащего 50% (о/о) формамида, 1 х раствора Денхардта, 100 мкг/мл ДНК молок лосося и 0,1% (о/о) додецилсульфата натрия (SDS). По окончании этой процедуры нейлоновую мембрану затем дважды промывают в 2 х SSPE, содержащего 0,1% (м/о) SDS, в течение 5 минут при комнатной температуре, и затем снова промывают в 1 х SSPE, содержащего 0,1% (м/о) SDS, в течение 10 минут при 55^oC, и затем, наконец, промывают в 0,1 х SSPE, содержащего 0,1% (м/о) SDS, в течение 15 минут при 55^oC. Затем мембрану сушат, и измеряют сравнительное продуцирование мРНК в 1,8 кб, транскрибированной из гена P-450_sca-2, используя "имидж"-анализатор BA 100 (Fuji film). Величины, полученные таким образом при негативном контроле для TK21/pSCA205 S. lividans, принимаются за 1, в то время как величины для других результатов оцениваются соответственно. Результаты приводятся ниже в табл. 2.

Из вышеприведенных результатов, можно ясно видеть, что промоторная активность интактной 5'-некодирующей области (1 кб) зависит от индукции натрий-ML-236B (S. lividans, TK21/pSCA205). Промоторы изобретения, напротив, не требуют такой индукции. Также следует иметь в виду, что данный пример проверяет уровни транскрипции, причем уровни экспрессии необходимо запаздывают после транскрипции.

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК, обладающий активностью промотора транскрипции в Streptomyces, соответствующий части 5'-некодирующей области в 1 т.п.о., непосредственно примыкающей к открытой рамке считывания Streptomyces carbophilus, кодирующей цитохром P-450_SCA-2, имеющий размер не менее 74 п.о. последовательности N 1, полученный частичным перевариванием в направлении 5' --> 3'.

2. Фрагмент ДНК по п.1, отличающийся тем, что проявляет активность промотора транскрипции по крайней мере в одном штамме Streptomyces carbophilus.

3. Фрагмент ДНК по п.1 или 2, отличающийся тем, что имеет активность промотора транскрипции по крайней мере в одном штамме Streptomyces lividans.

4. Фрагмент ДНК по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что имеет размер 300 п.о.

5. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что имеет размер менее 100 п.о.

6. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что имеет непрерывную последовательность из последовательности N 1, начинающуюся с 428 и продолжающуюся на всем или части расстояния до основания 1.

7. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 4 и 6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность 1 - 428 последовательности N 1.

8. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 4 и 6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность 1 - 320 последовательности N 1.

9. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 3 и 6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность 1 - 158 последовательности N 1.

10. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 3 и 6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность 1 - 101 последовательности N 1.

11. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 3, 5 и 6, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность 1 - 74 последовательности N 1.

12. Фрагмент ДНК по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что получен из SANK 62795 Streptomyces lividans, имеющего номер доступа FERM BP-5299.

13. Фрагмент ДНК по любому из пп.1 - 12, отличающийся тем, что имеет оперативную транскрипционную промоторную связь с открытой рамкой считывания.

14. Способ получения натрийправастатина, включающий культивирование штамма Streptomyces lividans TK 21 или Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299), трансформированного экспрессирующим вектором, содержащим ген P-450_SCA-2 Streptomyces carbophilus и 5'-некодирующую область (1 т.п.о.), в среде, содержащей натрий-ML-236 B, и при условиях, обеспечивающих экспрессию цитохрома P-450_SCA-2, и последующее извлечение натрийправастатина из трансформантов и/или культуральной среды, отличающийся тем, что вектор экспрессии содержит фрагмент ДНК по п.1, обладающий активностью промотора.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что культивирование проводят в присутствии Penicillium citrinum, продуцирующего ML-236B.

16. Плазмида экспрессии pSCA 1013-Δ (1013/428), сконструированная на основе pIJ 702, включающая фрагмент EcoRI-HindIII (2.2 т.п.о.), содержащий ген P-450_SCA-2 и область 5'-промотора размером 428 п.о., ген устойчивости к тиострептону, ori для обеспечения репликации в актиномицетах.

17. Плазмида экспрессии pSCA 1013-Δ (1013/320), сконструированная на основе pIJ 702, включающая фрагмент EcoRI-HindIII (2,1 т.п.о.), содержащий ген P-450_SCA-2 и область 5'-промотора размером 320 п.о., ген устойчивости к тиострептону, ori для обеспечения репликации в актиномицетах.

18. Плазмида экспрессии pSCA 1013-Δ (1013/158), сконструированная на основе pIJ 702, включающая фрагмент EcoRI-HindIII (1,93 т.п.о.), содержащий ген P-450_SCA-2 и область 5'-промотора размером 158 п.о., ген устойчивости к тиострептону, ori для обеспечения репликации в актиномицетах.

19. Плазмида экспрессии pSCA 1013-Δ (1013/101), сконструированная на основе pIJ 702, включающая фрагмент EcoRI-HindIII (1,87 т.п.о.), содержащий ген P-450_SCA-2 и область 5'-промотора размером 101 п.о., ген устойчивости к тиострептону, ori для обеспечения репликации в актиномицетах.

20. Плазмида экспрессии pSCA 1013-Δ (1013/74), сконструированная на основе pIJ 702, включающая - фрагмент EcoRI-HindIII (1,85 т.п.о.), содержащий ген P-450_SCA-2 и область 5'-промотора размером 74 п.о., ген устойчивости к тиострептону, ori для обеспечения репликации в актиномицетах.

21. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans T21/pSCA 1013-Δ (1013/428), продуцирующий P-450_SCA-2.

22. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans T21/pSCA 1013-Δ (1013/320), продуцирующий P-450_SCA-2.

23. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans T21/pSCA 1013-Δ (1013/158), продуцирующий P-450_SCA-2.

24. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans T21/pSCA 1013-Δ (1013/101), продуцирующий P-450_SCA-2.

25. Рекомбинантный штамм Streptomyces lividans T21/pSCA 1013-Δ (1013/74), продуцирующий P-450_SCA-2.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9