Способ получения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения

 

Изобретение относится к производству специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. Способ заключается в том, что выделение специфической иммуноглобулиновой фракции проводят спиртовым методом при низких температурах. Фракционирование плазмы доноров ведут до стадии получения сухого осадка иммуноглобулина, который растворяют в 2 %-ном растворе глюкозы, добавляют пепсин. После протеолиза удаляют фермент гидроокисью алюминия, рН раствора доводят до 6,5-7,5, проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивание препарата для формирования осадка нестабильных белков. Осадок удаляют центрифугированием при 6000 об/мин и после стерилизующей фильтрации получают целевой продукт. Технический результат: получение внутривенного иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита с низкой антикомплементарной активностью.

Изобретение относится к производству специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Сырьем для получения препарата служит отобранная по данным реакции торможения гемагглютинации (РТГА) плазма доноров с титром противоэнцефалитных антител не менее 1:20. Плазма должна быть проверена на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита B (HB_sAg), антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и к вирусу гепатита C.

Прототипом изобретения является способ получения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутримышечного введения (ФС 42-3155-95, срок введения установлен с 3.10.95 , срок действия до 3.10.2000).

Известно, что внутримышечный человеческий иммуноглобулин имеет ряд существенных недостатков: в мышце разрушается до 30% введенного препарата; при лечении тяжелых форм инфекции невозможно в короткий срок достичь высокой концентрации антител в сыворотке больного; препарат обладает высокой антикомплементарной активностью, которая не позволяет вводить его внутривенно.

Целью настоящего изобретения является получение иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита с низкой антикомплементарной активностью.

Объединенный пул иммунной плазмы фракционируют этанолом на холоду; сырой осадок иммуноглобулина лиофилизируют; сухой порошок растворяют в 2% растворе глюкозы и обрабатывают пепсином в слабокислой среде в течение 18 часов; удаляют пепсин гидроокисью алюминия; доводят pH раствора до нейтрального значения; проводят стерилизующую фильтрацию, выстаивание препарата для формирования осадка нестабильных белков, который удаляют центрифугированием, и после осветляющей и стерилизующей фильтрации получают целевой продукт.

Пример. Иммунную плазму в количестве 360 л получили методом плазмафереза от доноров, имеющих естественный титр антител к вирусу клещевого энцефалита и выявленных скринингом. В котловой загрузке титр противоэнцефалитных антител составил 1:20 по данным РТГА.

Выделение специфической иммуноглобулиновой фракции проводили спиртовым методом при низких температурах. Было получено 6650 г сырого осадка фракции II. Вес после высушивания составил 2300 г. Для получения внутривенного препарата 500 г сухого полуфабриката иммуноглобулина растворяют в 2% растворе глюкозы, доводят pH раствора до 3,9 - 4,1 и добавляют пепсин с активностью не менее 2000 ед в количестве 25 - 50 мг на 100 г белка. Через 18 часов протеолиза при температуре +37^oC удаляют пепсин гидроокисью алюминия, доводят pH раствора до 6,5 - 7,5, проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию и выстаивание препарата в течение 1 - 3 месяцев при температуре (6 ± 4)^oC для формирования осадка коллоидно-нестабильных компонентов. С целью ускорения выпадения осадка препарат термостатируют в течение 24 часов. Осадок удаляют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 40 мин, проводят стерилизующую фильтрацию, получают 3,5 л готового препарата с титром противоэнцефалитных антител 1:40 и выше в РТГА. Внутривенный иммуноглобулин разливают во флаконы емкостью 50 мл по 25 мл целевого продукта.

В лаборатории препаратов крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови получено 8 серий препарата.

Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения представляет собой бесцветную, прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость.

Фракция иммуноглобулинов составляет не менее 100% общего белка.

Содержание белка - в среднем 5%.

Фракционный состав: на иммуноэлектрофореграмме выявляется интенсивная дуга преципитации IgG и не более одной дополнительной дуги.

Молекулярные параметры: мономеры - в среднем 77%, димеры - не более 7%, фрагменты - не более 16%.

Специфическая активность: титр антител к вирусу клещевого энцефалита составил 1:40 и выше по данным РТГА.

По сравнению с прототипом препарат обладает низкой антикомплементарной активностью: две 50%-ные гемолитические единицы комплемента (2CH₅₀) сохраняют активность в присутствии не менее 10 мг белка.

Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения стерилен, апирогенен, нетоксичен, протестирован на отсутствие HB_sAg и антител к ВИЧ.

Назначение препарата - лечение больных вирусным клещевым энцефалитом.

В настоящее время иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения проходит Государственные клинические испытания на трех базах: в г. Хабаровске, г. Екатеринбурге, г. Кирове.

Таким образом, получен новый препарат для лечения больных вирусным клещевым энцефалитом, имеющий существенные отличия от прототипа и нашедший применение в учреждениях здравоохранения.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутривенного введения, включающий этанольное низкотемпературное фракционирование плазмы доноров, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита в титре не менее 1 : 10 по данным РТГА, отличающийся тем, что сухой осадок иммуноглобулина растворяют в 2%-ном растворе глюкозы, обрабатывают пепсином в слабокислой среде в течение 18 ч, удаляют избыток пепсина гидроокисью алюминия, доводят pH раствора до 6,5 - 7,5, стерилизуют фильтрацией, проводят выстаивание препарата при температуре (6 ± 4)^oC в течение 1 - 3 месяцев для формирования осадка нестабильных белков, причем для ускорения выпадения осадка иммуноглобулин термостатируют в течение 24 ч, удаляют осадок центрифугированием при 6000 об/мин и после стерилизующей фильтрации получают целевой продукт с титром антител к вирусу клещевого энцефалита не менее 1 : 40.