Штамм arthrobacter sp. для разложения сырой нефти и нефтепродуктов

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для очистки загрязненных нефтью поверхностей. Предложен новый штамм Arthrobacter sp. МИП-89, ВКПМ-1576, который хорошо растет на средах с нефтью в качестве единственного источника углерода, наиболее активно потребляет тяжелые фракции нефти (C₂₄-C₃₃). Штамм непатогенен, характеризуется высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, и которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ В-3078 (36a-1), Rhodococcus luteus ВКПМ B-3077(25) и Micrococcus flavus ВКПМ В-3079 (53) /ав.св. СССР N 1493666, C 02 F 3/34, 1989), используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Использование указанных культур микроорганизмов возможно только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материальных и энергозатратах.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1339Д, используемый для разложения нефти и нефтепродуктов, который применяется для очистки воды и почвы от указанных продуктов. Недостатком известного штамма является недостаточная скорость утилизации нефти и неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта.

Наиболее близким аналогом является штамм Arthrobacter sp., ОС-1, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИГенитики" под номером Ас-1556 /пат. РФ 2128221/.

Целью данного изобретения является получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной цели предложен штамм Arhrobacter sp. МИП-89, выделенный при воздействии косметических излучений на штамм Arthrobacter sp. , ОС-1. ВКПМ Ас-1576 (справка о депонировании прилагается).

Выделение штамма осуществлялось путем рассевов образцов штамма ОС-1 после экспозиции в условиях космического полета.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey/Bergey Smanual of Systematis Bacteriology vol.l. 1984 p./.

Хранится штамм на агаризованых питательных средах при температуре 6-8^oC в течение месяца. Более длительное хранение штамма осуществляется в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Состав среды для хранения штамма: Мясо-пептонный агар (г/л): Мясная вода - 100,0 Агар - 20,0 NaCl - 5,0 Пептон - 10,0 Глюкоза - 7,0 Вода водопроводная - До 1 л Данный штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками.

Культура представляет собой подвижные, грамвариабельные короткие палочковидные мелкие клетки, расположенные хаотично. Культура полиморфна. Клетки подвижные, спор не образуют Размер клеток в пределах 0,5-0,7 - 0,7 - 1,5 мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На МПА через 2-е суток роста при 30^oC культура образует колонии неправильной формы, сероватого цвета, не очень крупные, плоские, маслянистой консистенции. Как правило, при выращивании на плотных средах на 2-3 сутки обнаруживается сплошной рост по штриху в виде образований сероватого цвета.

Культура не лизогенна, после хранения на плотных питательных средах в течение 2-3 недель негативных пятен не обнаружено (при T =30-35^oC).

На мясо-пептонном бульоне при 30^oC через 3 суток наблюдается помутнение среды, беловатый осадок, заметно образование тонкого пристеночного кольца, небольшое количество агломератов клеток в толще среды в виде хлопьев, слабая пленка на поверхности среды. Оптимум роста 28-30 ^oC, pH 6.8-7.2.

Размножение культуры осуществляли путем пересева на мясо-пептонном агаре.

Состав среды для размножения штамма следующий: Мясо-пептонный агар (г/л):
Мясная вода - 100
Агар - 20,0
NaCl - 5,0
Пептон - 10,0
Глюкоза - 7,0
Вода водопроводная - До 1 л
Условия культивирования на ферментационной питательной среде: температура 28-30^oC, pH 6,8-7,2, продолжительность культивирования 22 часа.

Состав ферментационной питательной среды:
Кормовые дрожжи БВК - 2%
Кукурузный экстракт - 1%
Физиолого-биохимические признаки:
Факультативный анаэроб, растет в диапазоне температур от 18 до 30^oC. Крахмал гидролизует слабо, молоко не пептонидирует, желатин не разжижает, казеин не гидролизует, некислотоустойчивый, каталазоположительный. Хорошо растет на МПБ, разбавленном средой Раймонда в отношении 1:1, с NaCl в концентрации 0,5 и 1,0%. При выращивании на средах с 5% NaCl наблюдается очень легкое помутнение среды, образование пристеночного кольца. При концентрации NaCl 10, 15, 20% рост отсутствует.

Отношение к источникам углерода.

Штамм ассимилирует углеводы с образованием кислот: из гексоз - глюкозу, из полисахаридов - слабо крахмал и из спиртов - маннит. При этом наблюдается подкисление среды от pH 7,0 до 5,5. Слабо усваивает сахарозу, мальтозу, рамнозу. На средах с арабинозой и лактозой рост не наблюдается. Данный штамм проявляет хорошую способность к росту на углеводородных субстратах: парафине (C₁₀ - C₁₃), гексадекане и сырой нефти, причем рост в этом случае наблюдается главным образом на границе раздела фаз. На жидкой среде Раймонда способен усваивать нефть и парафины в концентрации до 20%.

Отношение к источникам азота.

Штамм хорошо растет на средах с аммонийным и нитратным азотом (NaNO₃, NH₄NO₃NH₄Cl_[C.A]), когда нефть выступает в качестве единственного источника углерода.

Культура Arthrobacter sp. МИП-89 не патогенна для теплокровных.

На производственной питательной среде продуктивность культуры по биомассе составляет 2-3·10⁹ кл/мл, активность на песке с нефтью - на 7-е сутки биодеградация нефти отмечается в разведении 10¹ - 10⁸. Активность определяли на песке с нефтью методами спектрофотометрического и хроматографического анализа по количеству остаточной нефти.

Результаты проведенных исследований заявляемого штамма показывают, что изучаемые микроорганизмы не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаза, не проникают через естественные барьеры верхних дыхательных путей, не диссемилируют во внутренние органы при интраназальном поступлении в организм. При многократном интраназальном введении установлено, что микроорганизмы обладают слабым сенсибилизирующим и умеренно выраженным дисбиотическим действием.

В результате проведенной работы было установлено, что культура Arthrobacter sp. МИП-89 наиболее активно потребляет тяжелые фракции нефти (C₂₄ - C₃₃). В процессе жизнедеятельности микроорганизмов образуются вторичные метаболиты в виде жирных кислот с длиной цепи C₁₄ - C₂₀, именно они могут вносить свой вклад в количественную оценку фракции.

Примеры конкретного использования.

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями, а именно способностью к активному росту на средах с углеводородами (нефть, парафин, гексадекан).

Пример 1. Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с рабочим объемом заполнения питательной средой 30 мл на качалке при 350 об./мин, что обеспечивает коэффициент массопередачи по кислороду K_1a=90 час^-1. Продолжительность культивирования составляет 22-24 часа, конечная концентрация клеток в культуральной жидкости составляет в среднем 3·10⁹ кл/мл.

Пример 2. Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях, в пилотных и полевых экспериментах комплексно по следующим показателям: убыли суммы углеводородов, изменению фракционного состава нефти в процессе биодеструкции, изменению площади остаточной нефти и по отношению к общей площади загрязненной поверхности.

Культуральная жидкость после выращивания штамма бактерий - деструкторов нефти сгущали сепарированием до концентрации клеток 1·10⁹ - 10¹⁰ кл/мл. Для биообработки водных поверхностей культуральную жидкость заявляемого штамма разводили до конечной концентрации клеток 1·10⁶ кл/мл в пресной воде, добавляли 0,2% нитроаммофоски. Наносили готовый раствор из расчета 10 л/м² поверхности почвы. Через 10-15 дней проводили повторную биообработку загрязненной поверхности. При необходимости, в случае высокого уровня загрязнения, проводили третью биообработку через 10-15 дней после второй. На почвах при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление, если это было возможно. Обработку почвы и воды в пилотных испытаниях осуществляли из садовых леек, в полевых - с помощью поливальной или пожарной машины вместимостью 5-10 м³.

В лабораторных условиях обработку почвы, искусственно загрязненной нефтью, осуществляли в лабораторной посуде объемом 0,25-0,50 л. Лабораторные эксперименты проводили при комнатной температуре.

Пилотные испытания проводили на поверхности водоемов площадью 1-2 м² и более или на аварийно загрязненных почвах, где предварительно определяли уровень загрязнения.

Полевые испытания проводили на природных объектах после аварийных разливов нефти на них. И пилотные и полевые испытания проводили в летне-осенний период.

Пробы для анализа изначально и в динамике отбирали по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Массовый анализ исходного уровня загрязнения и дальнейший мониторинг процесса очистки почвенных объектов и воды от нефтяных загрязнений проводили гравиметрическим методом. Качественный состав загрязняющего агента проводили методами газо-жидкостной хроматографии. Количественный состав нефтяных фракций определяли с помощью площади пиков, качественный - по времени удержания. В качестве контроля использовали нативную нефть, не подвергавшуюся биодеградации.

Эффективность биодеградации загрязнения оценивали по убыли углеводородов нефти в процессе проведения биообработок, принимая за 100% исходную концентрацию загрязнения.

Учет численности живых клеток микроорганизмов во всех экспериментах проводили общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

В табл. 1, 2, 3 приведены результаты тестирования биодеградирующей способности и штамма в лабораторных условиях, полевых и пилотных экспериментах.

В табл. 1 приведены результаты сравнительного тестирования деградирующей способности штамма Arthrobacter sp. МИП-89 и препарата Деворойл на модели почвы в лабораторных условиях. В качестве модели был использован образец загрязненной почвы Павелецкого предприятия по обеспечению нефтепродуктами. Контролем служил загрязненный углеводородами образец почвы с того же участка без внесения каких бы то ни было дополнительных микроорганизмов.

В табл. 2 представлены результаты полевых тестов биодеградирующей способности штамма МИП-89 на природном объекте (река Черная), загрязненном углеводородами (УВ) в результате аварийных разливов нефти.

В табл. 3 представлены результаты тестирования штамма МИП-89 в сравнении с отечественным препаратом в пилотных экспериментах, которые были поставлены на застарелом нефтяном загрязнении.

Таким образом полученные результаты свидетельствуют в том, что с помощью штамма Arthrobacter sp. МИП-89 может быть достигнута интенсивная деградация при высоком содержании ее в объекте загрязненного субстрата и он может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.

Формула изобретения

Штамм Arthrobacter sp. МИП-89 ВКПМ Ас-1576 для разложения нефти и нефтепродуктов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 22-2001

(73) Патентообладатель:
Автономная некоммерческая организация "Научно-техническое объединение "ИТИН" (RU)

Договор № 12623 зарегистрирован 15.06.2001

Извещение опубликовано: 10.08.2001