Дерматансульфат или его соль, противотромбозные средства, способ предупреждения или лечения тромбозов, способ предупреждения или лечения синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции, способ лечения инфаркта миокарда

 

Описывается дерматансульфат или его соль, имеющий характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше при определении вискозиметром Уббелоне с применением в качестве растворителя 0,2 М раствора хлорида натрия при температуре 30 ± 0,1^oС, при этом указанный дерматансульфат содержит 0,15% или менее гепарина или гепаран сульфата при определении способом, включающим обработку ферментами расщепления гепарина или гепаран сульфата и жидкостную хроматографию высокого разрешения, 0,07% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора Х в присутствии антитромбина III с применением гепарина, выделенного из коровьих кишок в качестве стандартного вещества, или 0,05% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора II в присутствии антитромбина III при использовании в качестве стандартного вещества гепарина, выделенного из коровьих кишок. Дерматансульфаты или их соли относятся к противотромбозным средствам, которые препятствуют распространению тромбов и стимулируют их лизис. Описываются также противотромбозные средства, способ предупреждения или лечения синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции и способ лечения инфаркта миокарда. 6 с. и 12 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 ил.

Настоящее изобретение относится к противотромбозным средствам, которые препятствуют распространению тромбов и стимулируют их лизис.

Тромбоз является заболеванием, вызываемым коагуляцией крови в живых кровеносных сосудах вследствие нарушений равновесия между тромбоцитами, коагуляцией и фибринолитической системой, которая в своей основе должна поддерживать текучесть крови в кровеносных сосудах. Тромбы в коронарных артериях вызывают инфаркт миокарда, а тромбы в венах в нижних конечностях и т. д. вызывают глубокий флеботромбоз. Аномальная активация коагуляционной системы вследствие тяжелых инфекционных заболеваний или опухолей приводит к тромбам во всех капиллярах и в результате - к синдрому рассеянной интраваскулярной коагуляции /далее называемой DIC/. DIC, вызванный тяжелым инфекционным заболеванием, часто осложняется нарушениями во многих органах и весьма неблагоприятным прогнозом. Разработаны различные контрмеры с целью лечения тромбоза, который демонстрирует исключительно разнообразные симптомы в зависимости от места его появления. Для лечения инфаркта миокарда и глубокого тромбоза вен применяют урокиназу - тканевый активатор плазминогена /далее обозначаемый здесь t-PA/, или гепарин, и так далее, и гепарин применяют также при DIC. Однако недостатком урокиназы является низкая аффинность к фибрину, a t-PA является дорогостоящим и имеет очень короткое время полувыведения. Кроме того, чрескожная транслюминальная коронарная реканализация и реперфузионная терапия посредством прямого периферического внутривенного введения t-PA имеют склонность вызывать рецидив тромбоза. Проблемой гепарина является то, что для закрепления нужного действия с целью усиления лечебного эффекта требуется определенная или повышенная концентрация антитромбина III. Кроме того, эти лекарственные препараты вызывают серьезные побочные действия - кровотечения. Поэтому, чтобы справиться с этими трудностями, разрабатывают синтетические препараты. Однако достаточного решения вопроса с побочным действием не получено, и остается нерешенной такая проблема, как чрезвычайно короткий полупериод выведения.

Сообщается, что дерматансульфаты усиливают антикоагуляционную активность через кофактор II гепарина, но сообщается об их фибринолитической активности, ускорении выведения t-PA/Abbadini, M. et al, Blood 1987, 70, 1858-1860/, в то время как сообщается, что дерматансульфаты не влияют на количество t-PA или фибринолитическую активность /Tripodi, A. et al., Thromb. Res., 1991, 62, 663-672/, и точное действие на фибринолитическую систему остается неясным.

Дерматансульфаты, которые используют в различных разработках в экспериментах и в качестве медицинских препаратов, получают из свиных или коровьих кишок или кожи /Fareed, J. et al., Recent Advance in Blood Coagulation, 1993, 6, 169-187/. Известно, что дерматансульфаты из других источников не имеют активности.

Авторы настоящего изобретения исследовали влияние дерматансульфатов на фибринолитическую систему и обнаружили, что тромболитическая активность усиливается в их присутствии при сравнении с активностью в их отсутствии. Кроме того, изобретатели обнаружили, что накапливаемая антитромбозная активность дерматансульфатов, введенных в живой организм, включающая как антикоагуляционную, так и фибринолитическую активность, является особенно значительной в случае определенных дерматансульфатов, имеющих характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше, определенных дерматансульфатов, получаемых из петушиных гребней, определенных дерматансульфатов, имеющих в своих составляющих дисахаридах 2-7% ΔDi-ΔS, или в случае определенных дерматансульфатов, имеющих среднюю молекулярную массу 25000-100000 дальтон, определяемую способом, описанным далее, и, кроме того, и особенно - в случае дерматансульфатов с очень низким содержанием гепарина или гепаран сульфата среди вышеупомянутых дерматансульфатов. Настоящее изобретение осуществлено с учетом упомянутых выше находок.

Настоящее изобретение относится к противотромбозным средствам, содержащим в качестве эффективного ингредиента дерматансульфаты, или к комбинированному использованию дерматансульфатов с тканевым плазминогенным активатором /t-PA/.

Дерматансульфаты имеют основную структуру повторяющегося дисахарида, состоящего из N-ацетил-D-галактозамин-4-сульфата и L-идуроновой кислоты с небольшим количеством D-глюкороновой кислоты, и имеют различное содержание серной кислоты и D-глюкороновой кислоты и различные места присоединения серной кислоты и т.д., в зависимости от источника - вида животного и органов и т.д.

Дерматансульфаты могут быть получены главным образом из сырья, происходящего от млекопитающих или других животных, такого как коровья или свиная слизистая кишок или кожа или куриные гребни, Авторы настоящего изобретения нашли, что активация плазминогена одно- или двухцепным t-PA может быть усилена в присутствии дерматансульфатов, полученных из такого сырья, или их фармакологически приемлемых солей, по сравнению со случаем их отсутствия. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что специфические дерматансульфаты настоящего изобретения, имеющие характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или более, предпочтительно 0,9-2,0 (100 мл/г), получаемые из куриных гребней, с 2-7% ΔDi-OS, предпочтительно с 3-6%, в своем составляющем дисахариде, и со средней молекулярной массой 25000-100000, предпочтительно 30000-60000, дальтон, определяемой гель-фильтрацией, описанной в Biochem. Bicphys. Acta, 1117, 60-70 (1992), в особенности те из них, которые имеют низкое содержание гепарина или гепаран cульфата, или их фармакологичеcки приемлемые соли, введенные в живой организм, могут сохраняться более длительное время в крови, чем другие дерматансульфаты, и обнаруживают фармакологическое действие, проявляющееся во всесторонней противотромбозной активности не только с фибринолитическим действием, но также и c антикоагулирующим действием, и это является основой настоящего изобретения.

Фармакологически приемлемые соли дерматансульфатов включают такие соли, как соли натрия, калия, лития и кальция, но обычно вводят натриевые соли. Тканевые плазминогенные активаторы /t-PA/, применяемые для настоящего изобретения, включают как эндогенные, так и экзогенные, одно- и двухцепные, и природные и ген-рекомбинантные продукты. Кроме того, t-PA-аналоги с частично неполным аминокислотным составом или имеющие избыток аминокислот также могут использоваться до тех пор, пока они обнаруживают свойства активирования плазминогена /см. EP-A-112122].

Дерматансульфаты или их фармакологически приемлемые соли, далее называемые DC, обнаруживают в достаточной степени свою фармакологическую активность при однократном и единственном, или редком, или повторяющемся введении. Дерматансульфаты могут вводиться посредством внутривенных, внутриартериальных или внутрикоронарно-артериальных инъекций и могут применяться подкожно или внутримышечно. DC и t-PA могут вводиться одновременно одними и теми же путями или могут вводиться отдельно.

Когда ожидается, что при вышеупомянутом внутрикоронарно-артериальном или внутривенном введении концентрация в крови DC и t-PA превысит эффективную концентрацию, тогда могут быть приняты иные, чем вышеупомянутые, способы введения - внутримышечное или подкожное введение.

Фармацевтические препараты дерматансульфатов могут быть подходящим образом приготовлены с обычными фармацевтически приемлемыми адъювантами, такими как стабилизаторы, эмульгаторы, регуляторы осмотического давления, pH-коррегирующие средства и так далее.

DC вводятся однократно при дозах 50-3000 мг/день для взрослого пациента и могут вводиться одновременно с 10000-500000 М.Е. /международные единицы/ t-PA. Эти эффективные ингредиенты могут использоваться однократно или дробно - в виде двух или нескольких частей в день с подходящими интервалами. Кроме того, DC могут вводиться внутривенно в течение нескольких дней подряд.

Как упоминалось выше, DC или их фармакологически приемлемые соли могут применяться для активирования фибринолитической активности в качестве пригодного тромболитического ускорителя. Особенно заметное действие обнаруживают специфические DC настоящего изобретения, имеющие характеристическую вязкость 0,8-2,0 (100 мл/г), получаемые из куриных гребней, имеющие степень ΔDi-OS 2-7% в своем составляющем дисахариде или имеющие среднюю молекулярную массу 25000-100000, определяемую способом, описанным далее, и особенно те из них, которые имеют низкое содержание гепарина или гепаран сульфата, или их фармакологически приемлемые соли. В то же время DC, имеющие характеристическую вязкость свыше 2,0 на 100 мл/г, или среднюю молекулярную массу свыше 100000, в высококонцентрированных растворах показывают повышенную вязкость и не рекомендуются вследствие нарушения скорости тока крови. Кроме того, одновременное введение описанных выше DC или их фармакологически приемлемых солей и t-PA заметно увеличивает тромболитическую активность и может снизить дозу t-PA для лечения или предупреждения тромбоза как подходящего тромболитического средства.

В частности, упомянутые выше специфические DC или их фармакологически приемлемые соли настоящего изобретения при введении в живой организм сохраняют эффективную концентрацию в крови в течение более длительного периода, чем другие DC или их фармакологически приемлемые соли, и предупреждают распространение и ингибируют образование тромбов или стимулируют тромболиз. Таким образом, они отлично действуют против синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции /DIC/, множественного повреждения органов, связанного с многочисленными тромбами, и глубокого тромбоза вен и т.п. Такие результаты могут наблюдаться не только в случае вышеупомянутых заболеваний, но также и при всех типах тромбов, что служит основанием для применения при лечении и предупреждении образования тромбов в артериях, капиллярах и венах. Кроме того, специфические DC или их фармакологически приемлемые соли настоящего изобретения могут применяться для предупреждения образования сгустков крови при искусственном кровообращении, таком как гемодиализ для пациентов, страдающих от почечных заболеваний.

Гепарин /далее обозначаемый Геп/ или гепаран сульфат /далее обозначаемый ГС/, присутствующие как примеси в DC, могут быть удалены, чтобы получить DC, свободный от Геп или ГС /далее обозначаемый DS-H(-)/. Интраваскулярная, подкожная или внутримышечная инъекция получающегося в результате DS-H(-) снижает возможность побочных реакций, таких как кровотечение. В частности, введение DS-H(-) пациентам с тенденцией к кровотечениям вследствие пониженного содержания тромбоцитов и факторов коагуляции снижает возникновение побочных реакций, таких как кровотечение, и является особенно безопасным.

Краткое описание рисунков На фиг. 1 показано изменение в крови у крыс концентрации дерматансульфатов натрия, полученных из петушиных гребней /см. ссылочный пример 1, RCDS/ и из тонких кишок коровы /см. ссылочный пример 2, BIDS/ /см. пример 1/.

Обозначения на фиг. 1 соответствуют: · - введению BIDS, o - введению RCDS, - введению BIDS-H(-). □ - введению RCDS-H(-), и x показывает точку пересечения ·, o, и □.

Фиг. 2 демонстрирует степень стимулирования BIDS активации плазминогена одноцепным тканевым плазминогенным активатором /sc -tPA/.

Фиг. 3 показывает степень стимулирования BIDS активации плазминогена двухцепным тканевым плазминогенным активатором /tc-tPA/.

Фиг. 4 показывает степень стимулирования RCDS активации плазминогена sc-tPA.

Фиг. 5 показывает степень стимулирования RCDS активации плазминогена tc-tPA.

Фиг. 6 показывает стимулирующее действие лизиса BIDS на сгусток плазмы человека.

Настоящее изобретение будет пояснено, с практической точки зрения, следующими далее ссылочными примерами и примерами.

Ссылочный пример 1 1/ Получение DC из куриных гребней Один килограмм куриных гребней измельчают, кипятят в горячей воде и вываривают при 50^oC в течение 12 час с 5 г проназы /Kaken Pharmacentical Co. , Ltd., торговая марка/. Вываренную смесь фильтруют через диатомовую землю, доводят pH фильтрата до 5,8-6,3 и вываривают при 50^oC в течение 3 часов с 1000 TRU гиалуронидазы, полученной из микроорганизмов Streptomyces/Seikagaku Corp. / В вываренную смесь добавляют NaCl до концентрации 0,65 М, и выливают ее в колонку с анионообменной смолой /колонка 3 х 20 см, Diaio ^RTMHPA-10, Mitsubishi Kasei Corp./, уравновешенную 0,5 М раствором NaCl. Колонку последовательно промывают 0,5 л 0,65 М NaCl и 0,3 л 1,1 М NaCl и затем элюируют 1,8 М раствором NaCl. Элюированные фракции собирают и упаривают при пониженном давлении. Объединенные сконденсированные фракции подвергают диализу в течение ночи против дистиллированной воды. Диализат упаривают до 10 мл и смешивают с 5 M NaOH, чтобы получить 0,5 М раствор NaOH. Щелочной раствор выдерживают при 37^oC в течение 90 минут, охлаждают и нейтрализуют ледяной уксусной кислотой. Нейтрализованный раствор смешивают с 2-кратным объемом этанола. Образовавшийся осадок последовательно промывают 70% этанолом, чистым этанолом и эфиром и сушат над пентоксидом фосфора при пониженном давлении.

Оставляют 5 г высушенного осадка стоять в 125 мл воды в течение ночи, и небольшое количество нерастворившегося осадка удаляют центрифугированием при 10^oC при 10000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант разбавляют 125 мл 10% водного раствора ацетата натрия, смешивают с этанолом на ледяной бане до получения конечной концентрации 45% и оставляют стоять при 4^oC в течение 20 часов. Осадки от центрифугирования последовательно промывают 90% этанолом, чистым этанолом и эфиром и сушат над пентоксидом фосфора при пониженном давлении, получают чистую натриевую соль DC /далее называемую RCDS/.

Выделение и очистку дерматансульфатов из куриных гребней можно выполнить не только описанным выше способом, но также способами, описанными в рассмотренных опубликованных заявках на патент Японии NN 9042 (1985) и 21241 (1986).

2/ Удаление из DC гепарина /Геп/ и гепаран сульфата /Гс/ Небольшое количество Геп и ГС, содержащихся в DC в качестве примесей, можно удалить одним из описанных далее способов.

1/ Метод ионообменной хроматографии Пятьдесят грамм RCDS, полученного по предшествующему способу /1/, помещают в колонку 4,5 х 27 см с анионообменной смолой Diaio ^RTMHPAII /Mitsubishi Kasei Corp./, предварительно уравновешенную 1,1 М NaCl, промывают 8 л 1,1 М раствора NaCl и элюируют 8 л 1,5 М раствора NaCl. Объединенные элюаты конденсируют на роторном испарителе, диализуют и осаждают посредством добавления этанола до 42%, или лиофилизуют, и получают стандартный RCDS/RCDS-H(-)/, свободный от Hep и HS.

2/ Способ расщепления азотистой кислотой Отщепление осуществляют по методу Шивли /Shively/ и Конрада /Biochemistry 15, 3932-3942, 1976/. Для этого смесь 400 мл 0,124 г/мл моногидрата нитрита бария и 400 мл IN H₂SO₄, приготовленную при -10^oC, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2 минут и получают 500 мл супернатанта. Смешивают 500 мл 0,1 мг/мл RCDS и 500 мл супернатанта и оставляют стоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют раствором Na₂CO₃. После конденсации осуществляют те же процедуры, что и в примере 1, и получают стандартный RCDS /RCDS-H(-)/, свободный от Hep и HS.

Ссылочный пример 2 Получение DC из слизистой тонких кишок коровы Десять килограммов коровьих тонких кишок рубят на куски с последующим удалением фекалий и жира и затем отделяют мукозу. Мукозу смешивают с NaOH, доводят объем до 3 л 2,5 N раствором NaOH и экстрагируют при 37^oC в течение 2 часов. Экстракт нейтрализуют, фильтруют через диатомовую землю, диализуют и центрифугируют, получают супернатант. Супернатант смешивают с равным количеством этанола и 5 г ацетата натрия, и получают осадок. Собранный осадок растворяют в 0,65 М растворе NaCl, и затем, подобно тому, как поступают в ссылочном примере 1, выливают в колонку с анионообменной смолой. Колонку последовательно прорывают 0,65 М и 1,1 М растворами NaCl и элюируют 1,5 М раствором NaCl. Объединенную фракцию элюатов диализуют против дистиллированной воды, и диализат смешивают с ацетатом кальция и уксусной кислотой до конечных концентраций 5% и 0,5 М соответственно. К раствору добавляют этанол, и собирают фракцию, осевшую при 15-30 об.%. Собранный осадок переводят в форму натриевой соли ионообменной смолой, промывают и сушат таким же способом, что и в ссылочном примере 1, и получают натриевую соль DC /называемую далее BIDS/.

Геп и ГС удаляют из BIDS таким же способом, как в ссылочном примере 1/2 /2/, и получают BIDS-H(-).

Осуществляют сравнение характеристик дерматансульфатов с характеристиками дерматансульфатов, полученных из мукозы кишок свиньи /Celsus Lab. Inc., распространяемых Cosmobio Co., Ltd./ и из свиной кожи /Seikagaku Corp./.

Ссылочный пример 3
Сравнение физико-химических свойств различных дерматансульфатов различного происхождения
1/ Определение средней молекулярной массы
Среднюю молекулярную массу DC определяют в соответствии со способом Arai et al. /Biochem. Biophys. Acta, 1117. 60-70, 1992/. Т.е. применяют гель-фильтрацию с жидкостной хроматографией высокого разрешения /ЖХВР/, используя в качестве стандартного образца гликозаминогликаны с известной молекулярной массой, и определяют молекулярную массу, исходя из их соответственно элюированных фракций. Готовят ряд колонок TSK_гельG4000PWX_L, G3000PWX_L и G2500PWZ_L /TOSOH Corp./ с внутренним диаметром 7,8 мм и длиной 300 мм, соответственно, элюируют 0,2 М раствором NaCl при скорости истечения 0,6 мл/мин, и проводят детектирование с дифференциальным рефрактометром.

2/ Анализ состава дисахаридов
Определение места частицы серной кислоты в DS осуществляют в соответствии с New Biochemical Experiments 3 Saccaride II, pp, 49-62 (1991) /публ. Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd./. Для этого DS переваривают с хондроитиназой ABC, и полученный дисахарид, имеющий ненасыщенную связь /ненасыщенный дисахарид/, анализируют ЖХВР и сравнивают с анализом вышеупомянутого ненасыщенного дисахарида, обработанной хондро-6-сульфатазой. Условия переваривания с хондроитиназой ABC, десульфирования с хондро-6-сульфатазой и анализа ЖХВР приводятся ниже.

а/ Переваривание с хондроитиназой ABC
В соответствии с методикой Yoshida /Anal. Biochem., 77, 327-332 (1989)/, в 20 мкл 10 мг/мл водного раствора DC добавляют 20 мкл 0,4 М трис-HCl-буфера /pH 8,0/, 20 мкл 0,4 M раствора ацетата натрия, 20 мкл 0,1% коровьего сывороточного альбумина и 120 мкл воды, затем добавляют 20 мкл 5 E/мл хондроитиназы ABC и инкубируют при 37^oC в течение 2 часов.

b/ Переваривание с хондро-6-сульфатазой
В 100 мкл упомянутого выше продукта переваривания с хондроитиназой ABC добавляют 20 мкл 5 E/мл хондро-6-сульфатазы, растворенной в 20 мМ трис-уксуснокислотном буфере /pH 7,0/, и инкубируют при 37^oC в течение 2 часов.

с/ Анализ ЖХВР
Пятьдесят микролитров раствора, переваренного с хондроитиназой ABC или переваренного затем с хондро-6-сульфатазой, анализируют на аппаратуре для ЖХВР /Hitachi Ltd. /. Используют ионообменную колонку /УМС-Pack PA-120S5, внутренний диаметр 2,6 мм, длина 250 мм/, и определяют поглощение при 232 нм. Элюирование выполняют при скорости потока 1,5 мл/мин с градиентом концентрации 800 мМ гидрофосфата натрия от 0% до 100% в течение 60 минут. Идентифицируют пики элюированных ненасыщенных дисахаридов, содержащих сернокислотные остатки в различных местах.

3/ Определение характеристической вязкости
Определение характеристической вязкости осуществляют в соответствии с Japanese Pharmacopoeia XII на автоматическом вискозиметре /Rigosha Co., Ltd. , типа VMC-052/. В качестве растворителя используют 0,2 М раствор NaCl и для определения используют также время истечения в вискозиметре Уббелоде. Определение вязкости проводят при 30±0.1%^oC и для вычисления характеристической вязкости используют три последовательных результата времени истечения с разницей в пределах 0,1 с. Время истечения округляют до 0,01 с и вычисление величин характеристикой вязкости осуществляют с помощью следующего уравнения:
η_red = (t_s/t_o-1)C,
в котором t_s = время истечения раствора, t_o = время истечения растворителя и C = концентрация образца (%, в/в). Значения уменьшенной вязкости η_red = (t_s/t_o-1)C откладывают по вертикальной оси против концентрации на горизонтальной оси и характеристическую вязкость получают из величины отрезков вертикальной оси, отсекаемых при экстраполяции полученных прямых линий до концентрации "0".

4/ Результаты
Результаты экспериментов (1)-(3) суммируют в табл. 1. Средняя молекулярная масса Dc, полученных из куриных гребней, составляет 38000 дальтон при характеристической вязкости 1,21. В противоположность этому три других DC имеют совершенно отличающиеся физико-химические свойства и показывают среднюю молекулярную массу 14000-16000 и характеристическую вязкость 0,44-0,68, что свидетельствует о заметном различии между DC, полученными из куриных гребней, и DC, полученными из других источников. Средняя молекулярная масса DC, полученных из коровьих и свиных тонких кишок, составляет 16000 и 18500 соответственно по способу настоящего изобретения, как видно из табл. 1, хотя есть сообщения, что она составляет 25000 /Thromb Res, 71, 417-422, 1993/ и 35700 /Blood, 74, 1577-1582, 1989/ соответственно.

Аббревиатуры для выражения состава дисахарида даются в табл. 2.

Настоящее изобретение будет объяснено подробнее посредством следующих далее ссылочного примера 4 и примеров.

Ссылочный пример 4
Определение Геп или ГС в DC
1/ Метод
Определение Геп или ГС в DC осуществляют с помощью следующих трех способов.

a/ Способ ферментативного переваривания
Перечисленные далее три фермента переваривают только Геп или ГС, но не переваривают DC /New Biochemical Experiments, 3, Saccharide II, pp. 244-249, 1991, публ. Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd/, и эти свойства используют для определения. Так, 500 мкг DC, полученных в ссылочных примерах 1 или 2, три фермента - 20 мЕ гепаритиназы 1, 20 мЕ гепаритиназы II и 50 мЕ гепаритиназы IV растворяют в 10 мкл 20 мМ трис-HCl-буфера, добавляют 10 мМ CaCl₂ (рН 7,0) и инкубируют при 37^oC в течение 2 часов. Реакционные смеси анализируют ЖХВР при тех же условиях, которые использовались для определения средней молекулярной массы, чтобы обнаружить и определить образовавшиеся ненасыщенные дисахариды на дифференциальном рефрактометре.

b/ Определение активности ингибирования фактора активного типа X Hep или HS за счет активации действенности антитромбина III
Геп или ГС обладают ингибирующей активностью против фактора активного типа X /Xa/ которая далее обозначается анти- Xa-активностъ/ - одного из факторов коагуляции, за счет активации антитромбина III, в то время как DC не обладают такой активностью /Tollfsen, в "Heparin", pp. 257-273, Eds.: David A. Lane and Ulf Lindahl. Edward Arnold, London, 1989/. Пользуясь этим свойством, определяют анти-Xa-активность, применяя различные концентрации Геп, чтобы обнаружить интервал с дозовой зависимостью соотношения между ингибирующей активностью и дозами Геп. Находят минимальную дозу Геп для максимального ингибирования, при которой степень ингибирования считают 100%, и степень ингибирования только с одним антитромбином III в отсутствие Hep принимают за 0%. Строят график соотношения, чтобы начертить калибровочную кривую. Осуществляют подобные определения для образцов DC настоящего изобретения, и количество Геп или ГС определяют путем сравнения полученной анти-Xa-активности с калибровочной кривой.

Практически осуществляют следующую процедуру. Смешивают при 4^oC 0,3 мл 50 мМ трис-HCl /pH 8,0/, 150 мМ Na₂Cl, 10 мМ CaCl₂ (буфер) 0,1 мл 1 E/мл антитромбина III /коровий, Sigma/ и 0,1 мл Hep /0,03-2 мкг/мл, коровьи кишки, Syntex/ или 0,1 мл образцов DS /50-100 мкг/мл/, полученных в виде, свободном от Геп или ГС, как описано выше, и смесь затем инкубируют при 37^oC в течение 2 минут. Затем к смеси добавляют 0,1 мл Xa /7,1 nkat /мл коровий, Chromogenic AB Co. , Ltd., дистрибьютер Seikagaku Corp./, и смесь инкубируют при 37^oC. Через 5 минут к смеси добавляют 0,1 мл 100 мкМ синтетического субстрата /Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA, код 3094V, Peptide Research Inst./, которую инкубируют при 37^oC в течение 3 минут, и реакцию обрывают путем добавления 0,3 мл 30% уксусной кислоты. И, наконец, к смеси добавляют 1 мл раствора, содержащего 7 объемов 50 мМ вышеупомянутого буфера и 3 объема 30% уксусной кислоты, чтобы получить образец для определения. Определение осуществляют на флюорофотометре /Japan Spectroscopic Co. , Ltd., FP-777/ при длине волны возбуждения 350 нм и длине волны флюоресценции 444 нм.

Заранее утверждается, что анти-Xa-активность самого антитромбина III почти незаметна в отсутствии Геп или ГС в условиях настоящего определения. Степень ингибирования вычисляют по следующему уравнению:
Степень ингибирования
A - величина, определенная для образца, содержащего Геп или ГС;
B - величина, полученная в присутствии буфера вместо антитромбина III, Геп или DC и Xa в вышеупомянутой процедуре;
C - величина, полученная в присутствии буфера вместо антитромбина III в вышеупомянутой процедуре.

c/ Определение активности ингибирования фактора активного типа II Геп или ГС через активирующее действие на антитромбин III
Геп или ГС обладает ингибирующей активностью против фактора коагуляции активного типа II/IIa/ - одного из факторов коагуляции - за счет активации антитромбина III, т. е. действием на антитромбин /далее называемым анти-IIa-действием/, в то время как DC не обладает такой активностью /Tollfsen, "Heparin", pp. 257-273, Eds.: David A. Lane and Ulf Lindahl, Edward Arnold, London, 1989/. Анти-IIa-активность определяют при различной концентрации Геп, используя упомянутое выше свойство для определения интервала, зависимого от дозы соотношения между ингибирующей активностью и дозами Геп. Находят минимальную дозу Геп для максимального ингибирования, которую принимают 100%, и степень ингибирования одним только антитромбином III в отсутствии Геп принимают за 0%. Строят график соотношения, чтобы иметь калибровочную кривую. Подобные определения осуществляют для образца DC настоящего изобретения, и количество Геп или ГС определяют путем сравнения полученной анти-IIa-активности и калибровочной кривой.

На практике осуществляют следующую процедуру. Смешивают при 4^oC 0,35 мл 20 мм трис-HCl /pH 7,4/, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂ буфера 0,1% сывороточного коровьего альбумина буфер и 0,1 мл антитромбина III /1E/ мл, коровий, Sigma/, и Hep /0,3-20 мкг/мл, коровьи кишки, Syntex/ или DC /50-100 мкг/мл/, полученных в свободной от Геп или ГС форме, как описано ранее, и затем смесь инкубируют при 37^oC в течение 2 минут. Затем к смеси добавляют 0,05 мл IIa /50 мЕ/мл, коровий, Boehringer/, и смесь инкубируют при 37^oC. Через 5 минут к смеси добавляют 0,1 мл 70 мкМ синтетического субстрата из Boc-Val-Pro-Arg-MCA /код 3093V, Peptide Research Inst./ и инкубируют при 37^oC в течение 3 минут. Реакцию обрывают путем добавления к смеси 0,3 мл 30% уксусной кислоты. И, наконец, к смеси добавляют 1 мл раствора, содержащего 7 объемов вышеупомянутого буфера и 3 объема 30% ледяной уксусной кислоты, и получают образец для определения. Определение осуществляют с помощью флуорофотометра /Japan Spectroscopic Co., Ltd., FP-777/ при длине волны возбуждения 350 нм и длине волны флуоресценции 444 нм. Заранее принимается, что анти-IIa-активность самого антитромбина III принимается совсем незначительной в отсутствии Геп и ГС в условиях настоящего определения. Степень ингибирования вычисляют по следующему уравнению:
Степень ингибирования
A - величина, определенная для образца, содержащего Hep или DS;
B - величина, полученная в присутствии буфера вместо антитромбина III, Геп или DC, и IIa в вышеупомянутой процедуре;
C - величина, полученная в присутствии буфера вместо антитромбина III в вышеупомянутой процедуре.

2/ Результаты
Результаты, полученные тремя вышеупомянутыми способами, приводятся в табл. 3,
Пример 1
Различия в продолжительности сохранения концентрации в крови RCDS, BIDS, RCDS-H(-) и BIDS-H(-) после введения исследуют на крысах.

1/ Материалы и способ
Используют самцов крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc./ в возрасте 6,5-7,5 недель. В качестве испытуемых образцов используют RCDS, BIDS, RCDS-H(-) и BIDS-H(-). Крысам дают наркоз эфиром, и вводят в хвостовую вену 10 мг/кг каждого испытуемого образца. Кровь отбирают из нижних /inferior/ полых вен через 5 и 120 минут после введения под эфирным наркозом в пробирки, содержащие 1 объем 3,2% лимонной кислоты на 9 объемов крови. Отделяют плазму центрифугированием, и определяют количество DC в плазме в соответствии с "New Biochemical Experiments", 3, Saccharides II, pp. 175-179. Т.е. плазму обессоливают через колонку PD -10^RTM /Pharmacia, Biochemicals, Inc./, лиофилизуют, переваривают с хондротиназой ABC, подвергают ультрафильтрации через мембрану, отсекающую молекулярную массу 5000, и полученный в результате фильтрат анализируют ЖХВР.

2/ Результаты
Результаты выражают в виде относительного остаточного коэффициента (%) DC по отношению к его количеству при времени 0 /ноль/, как показано на фиг. 1. Остаточные коэффициенты RCDS и RCDS-H-(-) примерно в два раза выше, чем у BIDS и BIDS-H(-), через 5 минут после введения. RCDS и RCDS-H(-) показывают остаточные коэффициенты порядка 10% через 120 минут после введения, в то время как BIDS едва обнаруживается. RCDS-H(-) показывает несколько более высокий остаточный коэффициент, чем RCDS, через 5 и 120 минут после введения.

Пример 2
Исследуют противотромбозное действие DS на модели тромбоза в нижней полой вене у крыс.

1/ Материалы
Используют самцов крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc./ в возрасте 6,5-7,5 недель. В качестве DC используют RCDS и BIDS.

2/ Метод
Получение экспериментальной модели тромбоза
Модель тромбоза у крыс получают в соответствии со способом Reyers et al. [Thromb. Res., 18, 669-674 (1980)]. Для этого крысам производят лапаротомию под наркозом нембутала^RTM /Dynabott-Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd./, и лигируют чуть ниже ответвления левой ренальной вены нижней полой вены хирургической шелковой нитью /N 7, диаметр 0,48-0,56 мм, Shinei Co., Ltd/. В хвостовую вену вводят испытуемые образцы RCDS и BIDS при дозах 1,3 и 10 мг/кг за 1 минуту до лигирования. Контрольной группе дают физиологический раствор. Крысам производят лапаротомию через 3 часа после лигирования, и иссекают вену, чтобы полностью извлечь тромб. Тромбы оставляют стоять в течение ночи при 37^oC, и замеряют их сухой вес. Полученные данные анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 3А. Относительный сухой вес тромбов у обеих групп с DC, которым введен 1 мг/кг, к весу тромбов в контрольной группе показывает степень ингибирования 60%. Однако вес тромбов в группе с RCDS снижается до 2,4% и 0,0% при дозах 3 и 10 мг/кг или более соответственно при сравнении с весом тромбов у контрольной группы, в то время как вес тромбов в группе с BIDS снижается только до 34,1% и 2,4% соответственно при сравнении с контрольной группой, что указывает на полезность RCDS.

Контрольная группа содержит 14 крыс, группы с DC содержат по 6 крыс, соответственно, и вычисляют средние величины.

Пример 3
Действие DC на образование тромбов и тромболиз исследуют на модели тромбоза в нижней полой вене у крыс.

1/ Материалы
Используют самцов крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc/ в возрасте 6,5-7,5 недель. В качестве DC используют RCDS и BIDS.

2/ Способ
1/ Получение экспериментальной модели тромбоза
Модель тромбоза получают путем лигирования нижней полой вены по способу, подобному способу в примере 2. Испытуемые образцы вводят в хвостовую вену при дозах 3, 10 и 30 мг/кг соответственно в виде 0,5 мл/кг. Контрольной группе вводят физиологический раствор. Крысам в контрольной группе через 6 часов после лигирования и в испытуемой группе через 2 часа после введения /8 часов после лигирования/ производят лапаротомию под эфирным наркозом, и отбирают кровь. Затем вены иссекают, тромбы полностью удаляют, и оставляют их стоять в течение ночи при 37^oC, чтобы определить их сухой вес. Полученные данные анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

2/ Получение эуглобулиновой фракции
В пластиковую пробирку помещают 0,5 мл плазмы, и добавляют к ней 9,5 мл глубоко охлажденного 0,01N ацетатного буфера /pH 4,85/, все оставляют в холодильнике на 1 час, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, и получают эуглобулиновую фракцию. Осадки смешивают с 0,5 мл трис-HCl-буфера /pH 7,4/ и получают прозрачный раствор.

3/ Определение фибринолитической активности
В отверстие опытного фибрин-планшета помещают 10 мкл эуглобулиновой фракции, оставляют в инкубаторе при 37^oC в течение 18 часов, и измеряют фибринолитическую область /квадрат диаметра/. Фибринолитическая область пропорциональна силе активности плазмина. Полученные данные по фибринолизу анализируют по способу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 4.

В табл. 4 "контроль, 6 час" относится к группе с лапаротомией под наркозом через 6 часов после лигирования вены, с последующим отбором крови и полным извлечением тромба. "Контроль, 8 час" относится к группе, которой вводили физиологический раствор через 6 часов после лигирования вены с последующим отбором крови и полным извлечением тромба спустя еще 2 часа.

1/ Влияние на образование тромбов и на тромболиз
Тромбы наблюдают во всех группах, но среди групп обнаруживают заметные различия, как показано в табл. 4. Группы, которые вводят как RCDS, так и BIDS, показывают зависящее от дозы снижение веса тромбов и по сравнению с группой "контроль, 8 час". Кроме того, группы, которым вводят 30 мг/кг BIDS и 10 мг/кг или более RCDS, демонстрируют меньший вес тромбов, чем в группе "Контроль, 6 час", что указывает не только на ингибирование тромбообразования, но также на тромболитическое действие. Другими словами, RCDS оказывает более сильное ингибирующее действие на тромбообразование и тромболитическое действие при меньших дозах, чем это наблюдается в группе с BIDS.

2/ Влияние на фибринолитическую систему
RCDS и BIDS вводят при дозах 3, 10 и 30 мг/кг соответственно и определяют активность плазмина в плазме через 2 часа /8 час после лигирования вены/. Результаты приводятся в табл. 4. Активность плазмина в группе, получившей 10 мг/кг RCDS, и в группе, получившей 30 мг/кг или более BIDS, оказывается существенно выше, чем в контрольной группе. Эти результаты указывают на превосходное действие RCDS.

Вес тромбов выражают в виде отношения, в %, к "Контроль, 8 час", вес в которой принимают за 100%. В группе "Контроль, 8 час" находится 16 крыс, а в других группах содержится по 8-9 крыс, соответственно, и для них вычисляют средние величины.

Пример 4
Сравнительные испытания противотромбозного действия на модели DIC, индуцированного эндотоксином, у крыс
1/ Материалы
Используют крыс Sprague-Dawley /SD/ /Charles River Japan, Inc./, самцов в возрасте 5,5-6,5 недель. Крысам дают наркоз посредством интраперитонеальной инъекции нембутала^RTM, и надрезают левое бедро. Движением назад вставляют полиэтиленовую канюлю /PE-10, Imamura Co., Ltd./ со стороны разреза в вентральную вену на расстоянии от него 4 см, и закрепляют ее. После выхода из наркоза непрерывно инфузируют эндотоксин /Escherichia coli 055:B5; Difco Co. , Ltd/ инфузионным насосом /модель 22M, HARVARD/ через шприц при скорости 3,75 мг/кг/ч в течение 4 часов. Испытуемый образец - RCDS-H(-) или BIDS-H(-)- вводят одновременно с эндотоксином, и непрерывно инфузируют с помощью канюли, присоединенной к правой вене. Контрольная группа получает физиологический раствор в объеме, эквивалентном объему испытуемого образца, и вводят его в течение 4 часов.

2/ Отдельные пункты испытаний
После введения эндотоксина отбирают кровь и удаляют почки, и проводят определения по перечисленным ниже пунктам.

1/ Количество тромбоцитов. Тромбоциты считают с помощью автоматического гемоцитометра /Cellac MEK-4500; Nippon Denko Co, Ltd /.

2/ Фибриноген. Выделяют плазму, и проводят определение с набором для определения фибриногена /Sunassay Fibrinogen^RTM, производство NITTO BOSEKI Co., Ltd, дистрибьютер Sanko Junyaku Co, Ltd/.

3/ Продукты распада фибриногена и фибрина /FDP/. Выделяют сыворотку, и определяют FDP с латексным реагентом для определения FDP/FDPL^RTM-тест, Teikoku Hormone Mfg. Co. Ltd./.

4/ Степень отложения ренального гломерулярного фибрина /% GFD/. Почки фиксируют 10% нейтральным буферным раствором формалина, заливают парафином, делают срез и окрашивают гематоксилином с фосфорновольфрамовой кислотой. Ренальные клубочки наблюдают под микроскопом по всему полю наблюдения образцов почек, и подсчитывают число отложений фибрина, и выражают его в виде процентного соотношения. Полученные результаты анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

3/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 5. Количество тромбоцитов, фибриноген и FDP составляют 75·10⁴ мкл, 216 мг/дл и 2,5 мкг/мл или менее соответственно, и не обнаруживается % GFD в случае обычной группы. Однако у крыс с индуцированной эндотоксином DIC обнаруживаются аномальные соответствующие коэффициенты 14·10⁴ мкл, 35 мг/дл, 34,3 мкг/мл и 61% соответственно.

Группа, которой вводят DS-(H)(-), показывает улучшения по всем этим параметрам, и группа с RCDS-H(-) показывает по всем параметрам результаты, лучшие, чем в случае BIDS-H(-). В частности, % GFD, который обусловлен ренальными клубочками, остается на уровне 16,1%, в случае BIDS-H(-), в то время как в группе с RCDS-H(-) наблюдается заметное улучшение - падение до 1%, что указывает на пригодность RCDS-H(-).

Эксперимент осуществляют на 19 крысах в нормальной группе, 20 крысах в контрольной группе, и на 7 крысах в каждой из групп, которым вводят DS, и вычисляют средние значения.

Пример 5
Стимулирующее действие DS на активацию Glu-плазминогена /обычный плазминоген, далее упоминается как плазминоген/ t-PA
1/ Метод
Смешивают 50 микролитров образца каждой концентрации DS /BIDS, RCDS/ или хондроитинсульфата /контрольная группа/, 25 мкл 1,6 мкМ плазминогена и 25 мкл 20 нМ одно- или двухцепного t-PA, и 100 мкл 0,6 мМ синтетического субстрата S-2251 /H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нитроанилид·2HCl/, и определяют поглощение при 405 нм каждые 2 минуты с помощью титрационного микропланшета с автоматическим считыванием. Реакцию осуществляют при 37^oC в буфере, состоящем из 50 мМ трис-HCl и твин^RTM-80.

Начальную степень активации плазминогена вычисляют следующим образом. Отношение наклона графиков зависимости A₄₀₅-поглощение при 405 нм - от времени к квадрату времени (ΔA₄₀₅/Δt²) делят на 40000 /Chibber, B.A.K., et al., Biochemistry, 1985, pp. 3429-3434/. Степень стимуляции вычисляют из соотношения с результатами, полученными в отсутствие DS или хондроитинсульфата, когда начальная степень составляет 1 /единицу/.

2/ Результаты
Результаты для BIDS приводятся на фиг. 2 и 3, DC, в зависимости от дозы, стимулирует активацию плазминогена в 1,5-4,5 раза в случае одноцепного t-PA /Sc-PA/, и в 1,5-3,5 раза в случае двухцепного t-PA /tc-tPA/, как показано на этих рисунках. В то же время контрольная группа с хондроитинсульфатом показывает более слабую, по сравнению с группой с DC, степень стимуляции - максимум 2,5 раза в присутствии одноцепного t-PA и максимум 1,5 раза в присутствии двухцепного t-PA. На фиг. 4 и 5 приводятся результаты для RCDS, RCDS также стимулирует активацию плазминогена в 2,0-4,5 раза в присутствии одноцепного t-PA (sc-tPA) и в 2,0-4,0 раза в присутствии двухцепного t-PA (tc-tPA) соответственно.

Пример 6
1/ Материалы и метод
Исследуют влияние DC на фибринолитическую систему крысы.

Самцов крыс Wistar в возрасте 9-11 недель подвергают наркозу с сомнопентилом^RTM /Kyoritsu Shoji Co. , Ltd./, и вводят им подкожно в спину 40 мг/кг DS/BIDS/. Через 1, 6, 12 и 24 часа отбирают кровь шприцем, содержащим лимонную кислоту. Готовят из плазмы эуглобулиновую фракцию таким же способом, как описано в примере 3, и фибринолитическую активность оценивают по чашечному тесту определения лизиса фибрина (по методу с фибрин-планшетом). Полученные данные анализируют статистически по методу Newman-Keuls.

Определяют количество DS в плазме и эуглобулиновой фракции /"New Biochemical Experiments", 3, Saccharide II pp. 175-179/. В контрольной группе используют физиологический раствор. Эти эксперименты выполняют в заранее установленное время, принимая во внимание циркадный ритм активности коагулирования и фибринолиза у крыс.

2/ Результаты
Полученные результаты приводятся в табл. 6 и 7.

DS показывает фибринолитическую активность до 12 часов после введения, как показано в табл. 6. Около 70-80% DS в плазме находятся в эуглобулиновой фракции, и проявляют фибринолитическую активность, как показано в табл. 7. RCDS также дает подобные результаты.

Как в контрольной группе, так и в группах с DS присутствует по 4-5 крыс, и вычисляют средние значения величин.

Как в контрольной группе, так и в группах с DS присутствует по 4-5 крыс, и вычисляют средние значения величин.

Пример 7
Исследуют стимулирующее действие DS на лизис сгустка плазмы человека.

1/ Метод
В 96-ячеечный планшет для микротитрования помещают по 40 мкл DS каждой из разных концентраций /BIDS/ /граничные концентрации 50,0-200 мкг/мл/, 20 мкл одноцепного t-PA /конечная концентрация 166,7 E/, 40 мкл тромбина /конечная концентрация 20 E/мл/ и 100 мкл плазмы человека и перемешивают. Сразу после приготовления определяют поглощение при 340 нм, и затем определяют поглощение каждые 10 минут, чтобы получить минимальное поглощение /мин/. Фибринолитическую активность выражают как отношение DS-PLTI/2//минуты/, полученное делением на 2 суммы максимального поглощения /макс/ и мин в присутствии DC к Cont-PLTI/2 контрольной группы.

2/ Результаты
Результаты приводятся в табл. 6. DC, в зависимости от дозы, стимулирует фибринолитическую активность сгустка плазмы, как показано на фиг. 6, RCDS дает подобные результаты.

Пример 8
Проверка токсичности дерматансульфатов при однократном внутривенном введении мышам
1/ Материалы и методы
Используют мышей Crj: CD-1 обоих полов /Charles River Japan, Inc./ в возрасте пяти недель. Готовят изотонические растворы RCDS-H(-) и BiDS-H(-) со стерильной дистиллированной водой и стерильным физиологическим раствором, и мышам в хвостовую вену, соответственно, однократно вводят 2000 мг/кг стеклянным шприцем. Животных наблюдают на предмет обнаружения признаков отравления в течение 14 дней.

2/ Результаты
Ни в одной из групп, которые получали DC, не наблюдают смертельных исходов даже при такой высокой дозе как 2000 мг/кг, как показано в табл. 8. Считается доказанным, что летальная доза в условиях настоящих испытаний превышает 2000 мг/кг.

Пример 9
Фармацевтические препараты
1/ В стерильном физиологическом растворе или в стерильной дистиллированной воде растворяют 500-5000 мг стерилизованной натриевой соли DS[RCDS или RCDS-H(-)] из петушиных гребней, полученных в соответствии со ссылочным примером 1, и получают изотонические растворы, объемы которых доводят до 100 мл. Растворы разливают в 10-мл ампулы, и получают препараты для интраваскулярной, подкожной или внутримышечной инъекции.

2/ Упаковывают раздельно 250 мг натриевой соли DC [RCDS или RCDS-H(-)], полученных из куриных гребней в соответствии со ссылочным примером 1, и 1.000.000 ME t-PA, и получают препараты для инъекций, из которых готовят раствор непосредственно перед использованием. Такие препараты для инъекций применяют для интра-коронарноартериальной или внутривенной инъекции.

Промышленное применение
Дерматансульфаты или их фармацевтически приемлемые соли стимулируют фибринолитическую активность и могут применяться для тромболитических стимуляторов.

Кроме того, совместное применение дерматансульфатов, в том числе их натриевых солей, с тканевыми плазминогенными активаторами /t-PA/ заметно увеличивает тромболитическое действие и может снизить дозу t-PA.

Кроме того, специфические дерматансульфаты настоящего изобретения, т.е. дерматансульфаты, имеющие характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше, полученные из петушиных гребней, содержащие 2-7% ΔDi-OS в своем составляющем дисахариде, имеющие среднюю молекулярную массу 25000-100000 дальтон, определяемую гель-фильтрацией в соответствии со способом в Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70 (1992), или упомянутые выше специфические дерматансульфаты, содержащие очень небольшое количество гепарина или гепаран сульфата, или их фармацевтически приемлемые соли, сохраняют свою эффективную концентрацию в крови в течение длительного времени и предупреждают развитие тромбоза, ингибируют развитие тромбов и т.д.

Следовательно, противотромбозные средства настоящего изобретения также пригодны для лечения и предупреждения инфаркта миокарда, синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции /DIC/, нарушений во многих органах, сопровождающих множественный тромбоз, глубокого тромбоза вен и т.д. Кроме того, эти средства могут быть показаны для предупреждения свертывания крови при искусственном кровообращении, таком как при гемодиализе для пациентов, страдающих от почечной недостаточности, и т.д. Кроме того, DC обладают меньшим побочным действием, таким как кровотечение и т.п., по сравнению с побочным действием гепарина. DS-H(-), подменный удалением Геп и ГС из DC, обладает повышенной безопасностью одновременно с гораздо меньшими побочными реакциями, такими как кровотечение и т.п. Таким образом, полученный в результате продукт может быть предпочтительно показан пациентам с тенденцией к кровотечениям или с риском по тромбоцитам и факторам коагуляции.

Формула изобретения

1. Дерматансульфат или его соль, имеющий характеристическую вязкость 0,8(100 мл/г) или выше при определении вискозиметром Уббелоде с применение в качестве растворителя 0,2 M раствора хлорида натрия при температуре 30 ± 0,1^oС при этом указанный дерматансульфат содержит 0,15% или менее гепарина или гепаран сульфата при определении способом, включающим обработку ферментами расщепления гепарина или гепаран сульфата и жидкостную хроматографию высокого разрешения, 0,07% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора X в присутствии антитромбина III с применением гепарина, выделенного из коровьих кишок в качестве стандартного вещества, или 0,05% или менее гепарина или гепаран сульфата, определяемого по ингибирующему действию активного фактора II в присутствии антитромбина III при использовании в качестве стандартного вещества гепарина, выделенного из коровьих кишок.

2. Дерматансульфат или его соль по п.1, отличающийся тем, что характеристическая вязкость находится в пределах 0,9 - 2,0 (100 мл/г).

3. Дерматансульфат или его соль по п.1 или 2, отличающийся тем, что дерматансульфат выделен из курьих гребней.

4. Дерматансульфат или его соль по п.1, отличающийся тем, что дерматансульфат или его соль содержит 2-7% (2-ацетамидо-2-деокси-3-0-4-деокси-α-трео-гекс- L-4-эндопиранозилуроновой кислоты)-D-галактозы (ΔDi-OS) в составляющих дисахаридах при определении методом, включающим ферментативное расщепление и жидкостную хроматографию высокого разрешения.

5. Дерматансульфат или его соль по п.1, отличающийся тем, что дерматансульфат имеет среднюю молекулярную массу 25000 - 100000 дальтон при определении методом гель-фильтрации.

6. Противотромбозное средство, содержащее в качестве активного ингредиента дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемым адъювантом, отличающееся тем, что в качестве активного ингредиента содержит дерматансульфат или его соль по любому из предшествующих пунктов в эффективного количестве.

7. Способ предупреждения или лечения различных тромбозов, отличающийся тем, что включает введение фармацевтических композиций, содержащих дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым адъювантом, пациентам с вероятным или развивающимся тромбозом, по любому из пп.1 - 5.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что объектами введения являются пациенты с возможным или развивающимся тромбозом или пациенты с тромбозом вследствие склонности к кровотечениям, вызванной пониженным количеством тромбоцитов или пониженными факторами коагуляции.

9. Способ предупреждения или лечения синдрома рассеянной интраваскулярной коагуляции, отличающийся тем, что включает введение фармацевтической лекарственной формы, содержащей дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль, совместно с фармацевтически приемлемым адъювантом, пациентам с вероятным или развивающимся синдромом рассеянной интраваскулярной коагуляции или пациентам с синдромом рассеянной интраваскулярной коагуляции, где используют дерматансульфат или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1 - 5.

10. Противотромбозные средства, содержащие эффективные количества тканевого плазминогенного активатора (t-PA) и дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль в сочетании с фармацевтически приемлемым адъювантом.

11. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль выделяют из куриных гребней.

12. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль содержит 2 - 7% ΔDi-OS в составляющих дисахаридах при определении по методу, включающему ферментативное расщепление и жидкостную хроматографию высокого разрешения.

13. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль имеют среднюю молекулярную массу 25000 - 100000 дальтон при определении методом гель-фильтрации.

14. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль имеют характеристическую вязкость 0,8 (100 мл/г) или выше при определении вискозиметром Уббелоде с применением в качестве растворителя 0,2 M раствора хлорида натрия и при температуре 30 ± 0,1^oС .

15. Противотромбозные средства по п.10, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль имеют характеристическую вязкость 0,9 - 2,0 (100 мг/г).

16. Противотромбозные средства по одному из пп.10 - 15, отличающиеся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль содержит 0,15% или менее гепарина или гепаран сульфата - при определении по методу, включающему обработку ферментами расщепления гепарина или гепаран сульфата и жидкостной хроматографией высокого разрешения 0,07% или менее гепарина или гепаран сульфата - при определении по ингибирующему действию активного фактора X в присутствии антитромбина III с применением в качестве стандартного вещества гепарина из коровьих кишок, или 0,05% или менее гепарина или гепаран сульфата - при определении по ингибирующему действию активного фактора II в присутствии антитромбина III с применением в качестве стандартного вещества гепарина из коровьих кишок.

17. Способ лечения инфаркта миокарда, отличающийся тем, что пациентам с инфарктом миокарда вводят фармацевтическую лекарственную форму, включающую тканевый плазминогенный активатор (t-PA) и дерматансульфат или его фармакологически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым адъювантом.

18. Способ лечения по п.17. отличающийся тем, что дерматансульфат или его фармакологически приемлемая соль представляет собой дерматансульфат по любому из пп.1 - 5.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15