Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека

 

Изобретение относится к генетической инженерии и медицинской генетике. Создан новый молекулярно-генетический маркер 18-й хромосомы человека, специфичный для центромерного района, представляющий рекомбинантную плазмидную ДНК pYAI 960. ДНК содержит - PstI - PstI - фрагмент ДНК вектора pUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - PstI - PstI - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерного района 18-й хромосомы человека, размером 1400 пар нуклеотидов с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции EcoRI, генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать хромосомы 18 в интерфазных и метафазных клетках в пренатальной диагностике и клинической цитогенетике, а также уточнять диагноз (определять точки разрыва на аномальных хромосомах) у больных с хромосомной патологией.

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности, к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 18-й хромосомы человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 11, 13, 21 и X человека (Гиндилис и др., 1985, N 1203108; Юров и др., 1989, N 1494724; Юров и др., 1993, N 1792429; Юров и др., 1997, N 2087533; Соловьев и др. , 1997, N 2087534). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования остальных хромосом человека.

В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосоме 18 (С. Van Broeckhoven et al. "Report of the Chromosome 18 Workshop", 1998, Psychiat. Genet., 8, 97- 108; С. Van Broeckhoven et al. "Report of the Chromosome 18 Workshop", 1999, Amer. J. Hum. Genet. , 88, 263-270; Catalog "AneuVision" /for Detection of Trisomy 13,18,21 and Chromosome X and Y Aneusomies/, 1999, Vysis Inc. 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove, IL 60515-5400). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосомы 18 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосомы 18, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов данной хромосомы. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосомы 18. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерного района хромосомы 18 человека, которые позволили бы проводить маркирование и идентификацию центромерного района хромосомы 18 в интерфазных и метафазных клетках.

Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерного района хромосомы 18 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида pYAI 960 отличается от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосомы 18 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерного района хромосомы 18 человека данное техническое решение разработано впервые.

Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 18-й хромосомы человека, а именно, специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами: 1. Строго маркировал околоцентромерный район хромосомы 18 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами; 2. Эффективно маркировал центромерный район хромосомы 18 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например, клеток опухолей.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pUC 19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst-сайтам фрагмент ДНК человека pYAI 960 размером 1400 пар нуклеотидов, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 18-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 1400 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зонда, опытов по блотгибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.

Новый ДНК зонд отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 1400 пар нуклеотидов, имеющего 2 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRI и ограниченного PstI-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот ДНК зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 4, 8, 9, 20. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется только с центромерными районами хромосом 18 человека.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом.

Источником выделения маркерного фрагмента pYAI 960 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивида мужского пола) обрабатывают рестриктазой PstI до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в PstI-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²P) ДНК тотальной фракции АRI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при 37^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3 : 1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в 4 опытах не позднее 2-3 недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25·10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYAI 960 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96,6^o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10 % декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при 100^oC в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96,6^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х1000 или х1125.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAI 960 локализован в прицентромерном районе 18-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды pYAI 960 для идентификации хромосомы 18 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 M NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом - 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 минут при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4^oC. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 минут). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис-HCl (pH 8,0)5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, pH 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при 65^oC не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ HBO и 5 мМ EDTA (pH 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 ч.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека E. coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37^oC на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65^oC. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при 65^oC проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18^oC, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 x SSC (1 x SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81^oC в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1 М KCl + 20 мМ трис-HCl pH 7,1 при 0^oC. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50^o изопропилового или 70^o этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (pH 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при 0^o. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на 1 ч при 0^oC. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18^oC, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37^oC. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70^oC в течение 10 мин.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC 19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E. coli HB 101, выращивают на качалке при 37^oC до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 минут, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0^oC раствора 100 мМ CaCl₂ клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0^oC по крайней мере в течение 30 минут культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80^oC, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев.

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0^oC добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42^oC) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при 37^oC. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением необходимых антибиотиков, как правило ампициллина, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70^oC 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (pH 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²P- дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при 37^oC. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5 · 10⁸ имп/мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при 37^oC. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 M NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (pH 7,5), а затем 1,5 M NaCl с 1 М трис HCl (pH 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 х SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 137^oC. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при 80^oC в течение 1-2 ч.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68^oC в растворе 2 х SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промокают фильтровальной бумагой и помещают в 4- 5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6 х SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²P-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5 · 10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при 68^oC в течение 18-24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х SSC с 0,5% SDS при 68^oC в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 ч экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой PstI фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoRI и идентификации полосы 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа pYAI 960.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США) в пенициллиновых флаконах при температуре 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За 1 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при 37^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением H³ - тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл H³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы альфа pYAI 960. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25·10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYAI 960 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 H NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70^o и 96,6^o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при 100^oC. Гибридизацию проводят при 37^o в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при 37^oC, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70^o и 96,6^o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х1000 или х1125.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAI 960 локализуется только в прицентромерном районе 18-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентромерный район.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 18-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосома (один из ее гомологов) затронута перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 18-й хромосомы и ее форме.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYAI 960 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителей транслокации (переноса) 18-й хромосомы на конец короткого плеча 15-й хромосомы. Так, при цитогенетическом анализе пробанда и его матери были обнаружены дицентрические транслокации (15; 18). При этом мать фенотипически здорова, а у ребенка отмечались олигофрения и множество микроаномалий развития. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й хромосомы, установить кариотипы не составило труда, так как укорочение короткого плеча в 18 хромосоме и потеря хромосомного материала в ней легко распознается непосредственно под микроскопом. В результате исследования у пробанда обнаружена делеция (потеря хромосомного материала) короткого плеча хромосомы 18, т.е. 18p-синдром. У матери подтвердилось наличие сбалансированной транслокации, т. е. без потери хромосомного материала. Таким образом, с помощью молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й хромосомы гомологичный партнер, затронутый перестройкой, распознается легко при анализе под микроскопом.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й пары хромосом является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая X-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух X-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера pYAI 960, специфически маркирующего только 18-е хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pYAI 960 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 18-й пары хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления /кластеров/ зерен серебра (сигналов изотопной метки), соответствующих двум хромосомам 18.

Все процедуры по выделению образца pYAI 960 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в примерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются два скопления гранул метки /два кластера/, соответствующих гомологичным хромосомам 18-й пары. В разных ядрах расстояния между кластерами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.

Таким образом, клонированная последовательность ДНК pYAI 960 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 18-й хромосомы как на стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосом человека, так и в случаях перестроенных 18-х хромосом, а также на цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико- генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 18-й хромосомы человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосомам 18 и при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Формула изобретения

Рекомбинатная плазмидная ДНК pYAI 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека, содержащая - PstI - PstI - фрагмент ДНК вектора pUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - PstI - PstI - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерного района 18-й хромосомы человека, размером 1400 пар нуклеотидов с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции EcoRI, генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину.