Способ ингибирования экспрессии гена в растительной ткани- мишени

 

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений. Способ ингибирования экспрессии гена в растительной ткани, из которой может быть выращено целое растение, заключается в трансформации клеток растения генной конструкцией, содержащей тканеспецифичный или специфичный промотор, функционирующий в ткани-мишени, и деструктивный ген, кодирующий белок, ингибирующий жизненно важную функцию клеток, например клеточное дыхание. Ингибирование клеточного дыхания приводит к гибели клеток, что обеспечивает получение мужских стерильных растений. Деструктивный ген выбирают из группы, состоящей из гена T-urfl3, генов, кодирующих α- и β-тубулин, и короткой смысловой конструкции с адениннуклеотидным транслокатором (ANT) внутренней митохондриальной мембраны. 6 з.п.ф-лы, 14 ил. 5 табл.

Изобретение относится к способу получения стерильных мужских растений путем использования гена, который экспрессируется в растениях и существенно ингибирует клеточную функцию, тем самым полностью нарушая экспрессию избранного признака растения.

Наша Международная Патентная Заявка N WO 90/08831 описывает и формулирует нарушение дыхания использованием различных деструктивных генов, которые мы относим также к так называемым "генам, инактивирующим опыление".

Способность таких инактивирующих генов функционировать данным образом варьирует и поэтому существует необходимость совершенствовать генные последовательности так, чтобы можно было осуществлять надлежащий отбор для конкретного использования.

Цель настоящего изобретения заключается в создании генов для применения в ингибировании генной экспрессии.

В соответствии с настоящим изобретением разработан способ ингибирования генной экспрессии в растительной ткани-мишени, включающий стабильную трансформацию вида растительной клетки, из которой можно регенерировать целое растение с помощью генного конструкта, несущего тканеспецифичный или специфичный для развития промотор, который действует в данных клетках данной растительной ткани-мишени, и деструктивный ген, кодирующий белок, который обладает способностью при экспрессии ингибировать дыхание в этих клетках этой указанной ткани-мишени, приводящий к гибели эти клетки, отличающийся тем, что этот указанный деструктивный ген выбран из группы, состоящей из гена T-urf13, генов, кодирующих α или β-тубулин, двух существенных генов клеточного цикла кукурузы с короткой смысловой косупрессией, cdc25 и активатора ориджина репликации (ROA) и короткого смыслового конструкта к адениннуклеотидному транслокатору (ANT) внутренней митохондриальной мембраны.

Негативная регуляция генной активности связана с короткой смысловой косупрессией, описанной в нашей Международной Патентной Заявке N WO 90/08299.

Эти гены α или β-тубулина действуют в качестве деструкторов путем дестабилизации построений микротрубочек в растительных клетках, подавляя тем самым важную функцию микротрубочек в указанной ткани-мишени, что приводит к гибели этих клеток.

Использование короткой смысловой косупрессии двух важных генов клеточного цикла кукурузы, cdc25 и активатора ориджина репликации (ROA) нарушает клеточное деление и создает тем самым дефект роста в соответствующем мишенированном органе или ткани.

Предпочтительным промотором является промотор, специфичный для пыльника и/или тапетума, или промотор, специфичный для цветочной пыльцы, так чтобы при экспрессии указанного деструктивного белка в этом регенерированном растении оно приобретало мужскую стерильность. Более предпочтительно, чтобы указанный пыльник- и/или тапетум-специфичный промотор был выделен с использованием кДНК-последовательностей, показанных на фигуре 1, или 2, или 3 прилагаемых чертежей, и применением методик, описанных в нашей Международной Патентной Заявке N WO 90/08826.

Плазмиды, содержащие эти ДНК-последовательности, показанные на фигурах 1, 2 и 3, были депонированы на основании условий Будапештского Соглашения и подробно описаны ниже.

Плазмида pMS10 в хозяйском штамме RR1 Escherichia coli, содержащая соответствующую генную последовательность, показана на фигуре 1 и депонирована в Национальной Коллекции Промышленных и Морских бактерий 9 января 1989 г. под каталожным номером NCIB 40090.

Плазмида pMS14 в хозяйском штамме DH5α Escherichia coli, содержащая соответствующую генную последовательность, показана на фигуре 2 и депонирована в Национальной Коллекции Промышленных и Морских бактерий 9 января 1989 г. под каталожным номером NCIB 40099.

Плазмида pMS18 в хозяйском штамме RR1 Escherichia coli, содержащая соответствующую генную последовательность, показана на фигуре 3 и депонирована в Национальной Коллекции Промышленных и Морских бактерий 9 января 1989 г. под каталожным номером NCIB 40100.

Выделение и описание этих генных последовательностей данного изобретения полностью приведено в WO 93/01294.

Могут быть также использованы другие промоторы, например, такой как тапетум-специфичный промотор MFS14.

В настоящем изобретении создали также растение, обладающее стабильно инкорпорированным в его геном путем трансформации генного конструкта, несущего генный конструкт, несущий тканеспецифический или специфичный к росту промотор, который действует в указанных клетках указанном мишенированной растительной ткани, и деструктивный ген, кодирующий белок, который обладает способностью при экспрессии ингибировать такую важную клеточную функцию, как дыхание, построение микротрубочек или клеточное деление в данных клетках этой указанной мишенированной ткани, что приводит к гибели данных клеток.

В настоящем изобретении создали также растение, прежде всего однодольное растение и, в частности, растение кукурузы, обладающее стабильно инкорпорированным в рамках его генома генным конструктом, несущим тканеспецифичный промотор, который действует в данных клетках указанной данной мишенированной ткани, и деструктивный ген, кодирующий белок, который обладает способностью ингибировать такую важную клеточную функцию, как дыхание или микротрубочки в данных указанных клетках данной указанной мишенированной ткани, что приводит к гибели этих клеток, отличающийся тем, что этот указанный деструктивный ген выбрали из гена T-urf13, короткого смыслового конструкта соответствующего адениннуклеотид-транслокатора, генов, кодирующих α или β-тубулин и существенных генов клеточного цикла с короткой смысловой негативной регуляцией (down-regulation), cdc25 и ROA.

Эти генные конструкты могут быть использованы в качестве средств, ингибирующих клеточный рост организмов, начиная от простейших одноклеточных и заканчивая сложными многоклеточными организмами, такими как растения и животные. В результате такого использования ткане- или клеточно-специфичных промоторов отдельные клетки или ткань в рамках моногоклеточных организмов могут быть мишенированы и уничтожены. Одним из конкретных применений, предполагаемым этим изобретением, заключается в разрушении клеток, существенных для развития мужского цветка, что приводит к мужской стерильности.

Поэтому, в настоящем изобретении разработали способ предотвращения или ингибирования роста и развития растительных клеток, основанный на генных конструктах, которые ингибируют важную клеточную функцию, такую как дыхание или микротрубочки. Данный способ обладает широкой применимостью для ряда сельскохозяйственных культур, когда необходимо ингибировать отдельные клетки или ткань.

Особенно интересным представляется подавление мужской фертильности у кукурузы для получения гибридов F1 in situ. Идея подавлять митохондриальную функцию в виде механизма мужской стерильности возникла из предшествующего изучения цитоплазматической T-типа мужской стерильности у кукурузы (cms-T), в котором показана связь между этим фенотипом мужской стерильности и митохондриальной дисфункцией. Хотя непосредственная причинно-следственная связь между митохондриальной дисфункцией и cms-T теперь установлена, основная часть доказательства предполагает, что важным является полноценное функционирование митохондрий, особенно в тапетальных клетках. Это особенно важно в течение микроспорогенеза, поскольку данные метаболические требования, возложенные на тапетальные клетки, дает 40-кратное увеличение числа митохондрий.

Так, мы создали ряд негативных мутаций, которые действуют на митохондрий, подавляя функцию дыхания. При специфической экспрессии этих мутаций в ткани пыльника кукурузы получали фенотип мужской стерильности.

Мы также использовали экспрессию генов α или β-тубулина для разрушения клеточной функции. В течение нормальной жизни клетки экспрессия генов тубулина согласованно регулируется с помощью их эндогенных промоторов и хорошо гармонирует с потребностями клеток в этих белках, которые полимеризуются и составляются в микротрубочки в течение роста и развития данного растения. При экспрессии генов тубулина в нерегулируемых условиях с использованием нетубулиновых промоторов в отдельной ткани или стадии развития равновесие между свободными мономерами тубулина и полимеризованным тубулином в микротрубочках нарушается, что приводит к нестабильности комплекса микротрубочек и нарушению клеточной функции. При экспрессии в тапетальных или других клетках пыльника это последнее действие будет вызывать стерильность растений.

Мы также предлагаем использовать короткую смысловую негативную регуляцию важных генов клеточного цикла, например cdc25 и ROA. При экспрессии в тапетальных или других клетках это последнее действие будет вызывать стерильность растений.

Метод, используемый для трансформации растительных клеток, не особенно подходит для данного изобретения, но можно использовать любой метод, подходящий для мишенированного растения. Трансгенные растения получали путем регенерации из трансформированных клеток. В литературе известно много методик по трансформации, приведем некоторые из них, такие как агроинфекция, использующая Agrobacterium tumefaciens или ее Ti-плазмиду, электропорация, микроинъекция растительных клеток и протопластов, трансформация микропулей и трансформация пыльцевой трубки. Для более подробных сведений об этих известных методах отсылаем к соответствующей литературной ссылке.

Опишем теперь создание и тестирование этих генных конструктов в качестве деструкторов митохондриальной функции в таком одноклеточном организме как дрожжи. Опишем также механизм, с помощью которого эти генные конструкты могут быть использованы для ингибирования клеточного роста и дифференциации в трансформированных растениях. Цель этих операций заключается в использовании дрожжей в качестве модельной системы для идентификации и оптимизации генных конструктов для экспрессии белков, которые нарушают митохондриальную функцию. Затем с помощью выбранных конструктов растительные клетки будут трансформированы и из этих клеток будут регенерированы целые растения.

Прилагаемые чертежи представляют собой следующее: фигура 1 показывает соответствующую ДНК-последовательность кДНК, специфичную для пыльника, введенную с помощью плазмиды pMS10; фигура 2 показывает соответствующую ДНК-последовательность кДНК, специфичную для тапетума, введенную с помощью плазмиды pMS14; фигура 3 показывает соответствующую ДНК-последовательность кДНК, специфичную для пыльника, внесенную с помощью плазмиды pMS18; фигура 4 показывает соответствующую последовательность гена T-urf13 (SEQ ID NO 1) с соответствующими подчеркнутыми праймерами Turf-1 (SEQ ID NO 2) и Turf-2R (SEQ ID NO 3); фигура 5 показывает ДНК, кодирующую соответствующую область из 59 аминокислот гена ATP-2 из Nicotinia plumbaginifolia ((SEQ ID NOS 4 и 5) с представленными праймерами PREB-IB (SEQ ID NO 6) и PREB-R (SEQ ID NO 7); фигура 6 показывает соответствующий сайт расщепления pre-β-последовательности; фигура 7 представляет собой карту вектора pCaMV₁N; фигура 8 представляет собой карту вектора RMS17; фигура 9 представляет собой карту вектора pIE109;
фигура 10 показывает последовательность промотора MFS14 (SEQ ID NO 8) с нижеследующими характеристиками:
позиция 2198 CCT"A"CAA-начало транскрипции (консенсус CCT"A"CAA)
позиция 2167 ATCCATT (возможный мотив TATA-бокса)
позиция 2141 (возможный мотив CAAT-бокса)
позиция 2233 CAC"A"CAG-начала cdna
позиция 2295 GCAACAATGGCG-начало трансляции (консенсус TAAACAATGGCT);
фигура 11 представляет собой карту вектора RMS11;
фигура 12 представляет собой карту вектора pMANT3;
фигура 13 иллюстрирует соответствующие конструкции векторов для трансформированной линии клеток кукурузы;
фигура 14 представляет собой диаграмму, показывающую изменчивость количества трансформантов, полученных в разных экспериментах.

Далее настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1
Конструирование вектора RMS17, трансформирующего кукурузу
Мы применили соответствующую PCR для амплификации гена T-urf13 из кукурузы cms-T (линия RW33:TMS) и соответствующую митохондриальную мишенную последовательность, pre-β, из Nicotiana plumbaginifolia. Образцы ДНК из растительного материала получали с использованием метода, описанного у Edwards с соавт. (Nucleic Acid Research 1991, 19, 1349).

Полноразмерный ген T-urf13 амплифицировали в PCR, использующей праймеры turf-1 (5'ATCGGATCCATGATCACTACTTTCTTAAACCTTCCT-3', SEQ ID NO 2) и turf-2R (5'TAGTCTAGATCACGGTACTTGTACGCTATCGGT-3', SEQ ID NO 3), созданных из информационной последовательности, разработанной Dewey с соавт. (1986, Cell, 44, 429-449). Условия PCR были следующими - 35 циклов денатурации при 94^oC в течение 0,8 мин, отжиг при 65^oC в течение 1 мин и удлинение при 72^oC в течение 2,5 минут. Для содействия последующему клонированию создали такие PCR-праймеры, чтобы они интродуцировали уникальные сайты рестрикции BamHI и XbaI соответственно на 5' и 3' концах данного гена. Соответствующая позиция этих праймеров относительно последовательности гена T-urf13 представлена на фигуре 4.

Аналогичную область из 59 аминокислот гена ATP2 из Nicotiana plumbaginifolia, которая кодирует функциональную митохондриальную мишенированную последовательность pre-β, амплифицировали в PCR с использованием соответствующих праймеров PREB-IB
(5'ATCGGTACCGCCATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCGCCT-3', SEQ ID NO 6) и PREB-R (5'ATCGGATCCCGCTGCGGAGGTAGCGTA-3', SEQ ID NO 7), созданных с использованием информационной последовательности, разработанной Boutry с соавт. (1987, Nature, 328, 341). Условия данной PCR были такими же, какие описаны выше, за тем исключением, что температура отжига была снижена до 60^oC. Для содействия последующему клонированию создали такие PREB-IB и PREB-2R, чтобы они интродуцировали уникальные сайты рестрикции Kpnl и BamRI соответственно на 5' и 3' концах амплифицированного фрагмента. Соответствующая позиция этих праймеров относительно данного гена ATP представлена на фигуре 5.

После амплификации этот pre-B-PCR-фрагмент обрабатывали с помощью Kpnl и BamHI, чтобы получить липкие концы и клонировать в соответствующие сайты вектора pUC18 для создания плазмиды pPB1. Затем продукт PCR TURF-13 обрабатывали с помощью BamhI и Xbal и клонировали в соответствующие сайты в pPB1, чтобы создать плазмиду pPB2. В pPB2 pre-β-последовательность слита в рамке с T-urf13-геном так, чтобы после экспрессии в растительной клетке полноразмерный продукт был бы транспортирован в митохондрию. Расщепление pre-β-последовательности в предсказанном сайте между остатками 55-56 будет высвобождать белок T-urf13, который содержит на своем NH₂-конце дополнительные 4 остатка из pre-β-последовательности (фигура 6).

Этот слитой ген pre-β/T-urf13 в pBB2 удаляли путем обработки с помощью ферментов KpnI и SalI, затупляли концы и клонировали в плазмиде pCRMVI₁N (фигура 7), которую обрабатывали с помощью BamHI и затупляли концы, чтобы получить pPB3. Эта стадия клонирования помещает данный слитый ген pre-β/T-urf13 под транскрипционный контроль промотора 35S CAMV. Наличие в этом конструкте интрона Adhl повышает уровни экспрессии в клетках кукурузы (Mascarenhas с соавт., 1990. Plant Mol. Biol., 15, 913-920), а присутствие nos 3'-последовательности создает дополнительный polyA-сайт. Чтобы получить соответствующий конечный вектор, RMS17 (фигура 8), селекционную кассету PAT из p1E109 (фигура 9), которую селектируют in vitro в трансформированных клетках кукурузы на биалафосе, интродуцировали в качестве EcoRI-фрагмента в уникальный EcoRI-сайт pPB3.

Пример 2
Трансформация BMS-клеток кукурузы с помощью RMS17
Целью этого эксперимента было показать, что экспрессия генного конструкта preβ/TURF-13 в культивируемых BMS-клетках кукурузы приводит к снижению клеточной жизнеспособности, как установлено в результате измерения трансгенного каллуса после трансформации. Этот вектор RMS17 (фигура 8) интродуцировали в культивируемые BMS-клетки с использованием следующей методики трансформации, опосредованной волокном карбида кремния:
Получение нитевидных монокристаллов карбида кремния
Высушенные нитевидные монокристаллы всегда находились под рукой в испаряемой камере, чтобы предотвратить вдыхание и повреждение легких. Эти нитевидные монокристаллы могут быть канцерогенными, поскольку они обладают свойствами, подобными асбесту. Нитевидные монокристаллы Silar SC-9 были разработаны Advanced Composite Material Corporation Greer, South Carolina, США. Стерильные суспензии нитевидных монокристаллов готовили заблаговременно следующим образом. Примерно 50 мг нитевидных монокристаллов помещали в предварительно взвешенную 1,5 мл пробирку Эппендорфа, которую закрывали колпачком и вновь взвешивали для определения веса нитей. Колпачок пробирки прокалывали иглой шприца и покрывали двойным слоем алюминиевой фольги. Эту пробирку автоклавировали (121^oC, 103,4 kPa, 15 psi) в течение 20 минут и высушивали. Свежие суспензии нитевидных монокристаллов получали для каждого эксперимента, поскольку сообщалось, что уровень трансформации ДНК при использовании свежих суспензий был выше, чем при использовании старых суспензий. 5% (вес/объем) суспензию нитевидных кристаллов готовили с использованием деионизированной воды. Непосредственно перед употреблением ее встряхивали несколько секунд, чтобы суспендировать эти нитевидные монокристаллы.

Трансформация ДНК в клетках
Все операции осуществляли в вентилируемом ламинарном боксе в асептических условиях. Соответствующей ДНК трансформировали соответствующие клетки, используя следующую методику. Конкретные модификации этого метода приведены в данном тексте.

Суспензии клеток и нитевидных монокристаллов раскапывали, используя срезанные наконечники в пипетке Gilson. 100 мкл свежей BMS-среды (смотрите приложение 1) отмеряли в стерильную пробирку Эппендорфа. Туда же добавляли 40 мкл 5% (в/о) суспензии нитевидных монокристаллов и 25 мкл (1 мг/мл) плазмидной ДНК, и все это встряхивали с максимальной скоростью в течение 60 секунд, используя настольный аппарат для встряхивания и перемешивания (Vortex Genie 2 Scientific industries. Inc). Сразу же после встряхивания добавляли 500 мкл соответствующей клеточной суспензии, т.е. 250 мкл осажденных клеток. Эту пробирку Эппендорфа закрывали колпачком и встряхивали с максимальной скоростью в течение 60 секунд в вертикальном положении. Эту же процедуру применяли при трансформации других линий клеток.

В этот эксперимент включили три контроля. Двумя позитивными контрольными векторами были pPG3, которые содержали только селекционную кассету PAT, и RMS15, который идентичен RMS17, за тем исключением, что ген T-urf13 замещен на митохондриальный неприсоединенный белковый ген, UCP, который не влияет на культивирование BMS-клеток. Данная pre-β-мишенирозанная последовательность присутствует в обоих конструктах. Негативный контроль, который полностью должен предотвращать образование трансгенного каллуса, создавали с помощью RMS13, который идентичен RMS17, за тем исключением, что слитой ген preβ/T-urf13 заменяли на цитотоксический ген рибонуклеазы, барназу.

Средние значения трансгенного каллуса, образованные в этом эксперименте, показаны в таблице 1.

Эти данные свидетельствуют, что относительно этих двух позитивных контролей, pPG3 и RMS15, экспрессия слитого гена preВ/T-urf13 приводит к существенному снижению (p<5% или больше) образующегося трансгенного каллуса. Это дает основание предполагать, что мишенированный по митохондриям белок T-urf13 обладает повреждающим действием на эти клетки, преимущественно связанным с ухудшением митохондриальной функции. Экспрессия цитотоксической рибонуклеазы, барназы, полностью отменяет образование трансформированного каллуса.

Пример 3
Конструирование вектора RMS11, трансформирующего кукурузу
RMS11 представляет собой трансформирующий вектор, в котором экспрессия слитого гена pre-β/T-urf13 находится под контролем промотора тапетума кукурузы, MFS14. Эта последовательность промотора MFS14 и нетранслируемая лидерная область от позиции -2198 до +97 показана на фигуре 10. Экспрессия белка T-urf13, получаемая таким путем в этих клетках, образующих пыльник, ограничена и не распространяется на целое растение.

Для конструирования RMS11 фрагмент KpnI - SalI из pPB2, содержащего слитый ген pre-β/T-urf13, затупляли концы и игировали по тупым концам BamHI-сайта плазмиды pSC9, чтобы получить pPB4. В pPB4 этот слитый ген pre-β/T-urf13 расположен теперь между фрагментом промотора MFS14 с координатами от -152 до +97 и nos 3'-последовательностью полиаденилирования. Эту укомплектованную кассету удаляли из pPB4 обработкой с помощью SacI и EcoRI и клонировали в соответствующие сайты pSC7 для получения плазмиды pB5. pSC7, содержащая область промотора MFS14 от -153 до -5800, так чтобы интродуцировать фрагмент SacI - EcoRI, из pPB4, восстанавливает в полном объеме 5,8 т.п.н. MFS14-промотор.

RMS11 (фигура 11) была укомплектована путем интродуцирования селективной in vitro кассеты PAT из p1E109 в уникальный EcoRI-сайт pPB5.

Пример 4
Трансформация клеток кукурузы с помощью RMS11 путем бомбардировки частицами для создания стабильно трансформированных мужских стерильных растений
Трансформирующий вектор кукурузы, RMS11, применяли для трансформации регенерируемых клеточных культур кукурузы путем бомбардировки частицами.

Культивируемый материал
Рыхлый эмбриональный каллус типа II, инициировали из неполовозрелых зиготических зародышей, вырезанных из оранжерейных или из коллекционных выращенных растений A188 на 10-12 день после опыления пыльцой от природного B73. Используемая среда для инициации и выращивания каллуса создана на основе среды N 6, модифицированной Armstrong и Green. В частности, среда содержала 6 мМ L-пролина, 2% (в/о) сахарозы, 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и 3% (в/о) Gelrite (Trade mark, Caroline Biological Supply) при pH 6,0. Каллус выращивали в течение 4-4 недель перед инициацией культивирования суспензии. Суспензионные культуры инициировали в базовой жидкой MS-среде, содержащей 100 мг/л миоинозита, 2 мг/л 2,4-D, 2 мг/л 1-нафтилуксусной кислоты (NAA), 6 мМ пролина, 200 мг/л гидролизата казеина (Difco Laboratories), 35% (в/о) сахарозы и 5% (о/о) кокосовой воды (Difco Laboratories) при pH 6,0. Клеточные суспензии выдерживали в этой среде в 125 мл склянках Эрленмейера при 28^oC в темноте на круговой качалке при 125 об/мин. Суспензию субкультивировали каждые 3,5 дня путем добавления 3 мл объема осажденных клеток в 10 мл культуральной среды, доведенной до 20 мл свежей культуральной средой. Эти суспензионные культуры имели обычно возраст от 6 месяцев до 1 года ко времени бомбардировки. Для некоторых трансформаций использовали суспензионные культуры, оживленные после криоконсервации.

Бомбардировка микропулями
Клеточные суспензии процеживали через 1,0 мм, а затем - 0,5 мм сито. Сконцентрированные до объема 0,2 мл эти клетки, которые пропускали через сита, суспендировали затем в 5 мл суспензионной среды и равномерно распределяли на диске фильтровальной бумаги Whatman N 4 путем вакуумной фильтрации, используя 4,7 см держатель для микроанализа. На вольфрамовые частицы осаждали сверхспирализованную плазмидную ДНК и бомбардировали, применяя аппарат DuPont PDS-1000 Biolistics (Trade Mark) фактически так, как написано в инструкции изготовителей. Пластинки-мишени бомбардировали однократно.

Отбор трансформантов и регенерация растений
После бомбардировки каждый фильтровальный диск (с клетками) переносили в базовую N6-среду, содержащую 100 мг/л миоинозита, 2 мг/л 2,4-D, 3% (в/о) сахарозы и 0,3% (в/о) Gelrite при pH 6,0. Для селекции с использованием NPTII-гена эту среду дополняли 200 мг/л сульфата канамицина. Эти фильтровальные диски переносили в свежую среду, содержащую данный селективный агент, через семь, а затем вновь через 14 дней. Полученную суспензию делили на две равные аликвоты и каждую равномерно распределяли по отвержденной пластинчатой 20 мл среде, содержащей данный селективный агент и 3% (в/о) Gelrite в 100 x 20 мм чашках Петри. Спустя 2-5 недель, быстрорастущий, предположительно трансформированный каллус удаляли и переносили на поверхность свежей селекционной среды. Растения регенерировали в результате перенесения ткани в базовую MS-среду, содержащую 1 г/л миоинозита, 1 мг/л NAA, 6% (в/о) сахарозы и 3% (в/о) Gelrite при pH 6,0. Через 2-3 недели эту ткань переносили в MS-среду, содержащую 0,25 мг/л NAA и 3% (в/о) сахарозы, и помещали на свет, где наблюдали прорастание зародышей. Затем растения росли на MS-среде половинной концентрации, содержащей 500 мг/л миоинозита, 3% (в/о) сахарозы и 0,3% Gelrite при pH 6,0, приблизительно в течение 1-2 недель до переноса в теплицу.

После переноса в теплицу растения в рамках каждого независимо трансформированного клона тестировали на наличие генного конструкта MFS14/pre-B/T-urf13 с применением PCR. ДНК экстрагировали из небольших образцов листьев, применяя методику, описанную у Edwards с соавт. (1991, Nucleic Acids Research, 19, 1349), и использовали в этой PCR с помощью соответствующих праймеров, 14-SA (5'-AGACGCTGAGCTCAAGGACGTGA-3' SEQ ID NO 9) и turf-2R (смотрите пример 1, касающийся последовательности этого праймера).

Оценивали способность к цветению этих растений в рамках каждого независимо трансформированного клона в условиях теплицы, применяя визуальную шкалу, созданную для CMS-линий и описанную в таблице 2. Растения с оценкой 4 и ниже являются функционально стерильными. Отмеченные стерильностью растения, собранные по каждому из PCR-независимых клонов, показаны в таблице 3 и сравнены с линией кукурузы, которую получили путем бомбардировки с помощью RMS11, но которая является PCR-негативной по генному конструкту MFS14/pre-B/T-urf13.

Стерильные растения подвергали обратному опылению пыльцой фертильных, нетрансгенных BE70-растений. Потомство от семян, полученных от одного из этих опылений (клон YK23, растение 5 x BE70), вырастили в теплице в зацветшее растение. Наличие генного конструкта MFS14/pre-B/T-urf13, определенного с помощью PCR и PAT-теста (последним определяли, действительно ли селективный маркер присутствует в трансформационном процессе), и подсчет фертильных растений представлены в таблице 4. Растения, которые оказались PCR-негативные, удаляли из тепличного посева до цветения. Растения 1 и 2, обладающие неубедительным PCR-тестом, держали до цветения. Растение 12 сохраняли в качестве контроля. Как видно в таблице 4, 6 из выращенных растений оказались стерильными и эта стерильность коррелировала с наличием трансгена, как установлено либо с помощью PCR, либо PAT-тестированием. Это согласуется с наличием единственного трансгенного локуса, наделяющего стерильностью.

Пример 5
Конструирование вектора pRMS-23, трансформирующего кукурузу
Мы проверили, действительно ли экспрессия короткосмыслового конструкта из адениннуклеотидного транслокаторного (ANT) гена кукурузы будет приводить к дефекту в росте данных клеток кукурузы. Выделили фрагмент кукурузного ANT, используя метод PCR и праймеры, созданные из последовательности указанного кукурузного гена, опубликованные у Bathgate с соавт. (1989, Eur. J. Biochem. , 83, 303-310).

Этот фрагмент этого ANT амплифицировали методом PCR, используя праймеры MANT-1(5'-ATGCCCGGGCTTGCAATGTCTGTTAGCGGTGGCATCA-3', SEQ ID NO 11). Условия PCR были - 35 циклов денатурации при 94^oC в течение 0,8 мин, отжиг при 65^oC в течение 1 мин и удлинение при 72^oC в течение 2,5 минут. Чтобы содействовать последующему клонированию, создали PCR-праймеры так, чтобы они интродуцировали уникальные SmaI-рестрикционные сайты по 5' и 3' концам данного гена. Эта последовательность кукурузного гена ANT была опубликована в Eur. J. Biochem. (1989) 183, 303-310. Эта праймерная последовательность MANT-1 находится в начале кодирующей последовательности данного гена, а праймерная последовательность MANT-2R находится вблизи окончания этого гена.

После PCR, в которой получили фрагмент ДНК ожидаемого размера 1050 т.п. н. , эту ДНК обрабатывали с помощью Smal и субклонировали в этот Smal-саит pUC18, чтобы получить pMANT1. Затем сигнальную nos 3'-последовательность полиаденилирования интродуцировали 3'-концом с геном ANT в виде SacI-EcoRI-фрагмента в соответствующие сайты в pMANT1, чтобы получить pMANT2. Фрагмент Hindlll-BamHI, несущий 35S-промотор CaMV и интрон ADH 1 из pCaMVI₁N (фигура 5), интродуцировали в корреспондирующие сайты pMANT2, чтобы получить pMANT3. pRMS-23 (фигура 12) укомплектовали путем интродуцирования селективной in vitro кассеты PAT из pIE109 (фигура 7) в уникальный EcoRI-сайт pMANT3.

Пример 6
Трансформация клеток кукурузы BMS с помощью pRMS-23
Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы показать, что экспрессия pRMS-23 в культивируемых клетках кукурузы BMS приводит к снижению клеточной жизнеспособности, которую измерили путем образования трансгенного каллуса после трансформации в двух различных экспериментах. Векторные ДНК интродуцировали в культивируемые клетки BMS, используя методику трансформирования волокном карбида кремния, которая описана в примере 2.

После трансформации с помощью pRMS23 определяли в среднем количество образованного каллуса относительно позитивного контроля pPG3, который содержал только in vitro селективную кассету (таблица 5). Эти данные свидетельствуют, что экспрессия короткого смыслового адениннуклеотидного транслокаторного гена приводит к существенному уменьшению образующегося трансгенного каллуса.

Пример 7
Конструирование трансформирующих векторов кукурузы, pTBR и pTBS
Мы проверили, может ли нерегулируемая экспрессия генов α-тубулина быть причиной нарушения роста клеток кукурузы. Были получены два конструкта, содержащие кодирующую последовательность из кДНКs α-тубулина, выделенных из двух биотипов Eleusine indica. pTBR (фигура 13), содержащий кДНК α-тубулина из устойчивого к динитроанилину биотипа Eleusine indica, клонировали в виде затупленного фрагмента Hinf в затупленный BamHI-сайт pCAMYI₁N (фигура 7). pTBS (фигура 13), содержащий кДНК α-тубулина из чувствительного к динитроанилину биотипа, клонировали в точности так, как описано для pTBR.

Пример 8
Трансформация клеток кукурузы BMS с помощью pTBR и pTBS
Цель этого эксперимента заключалась в том, чтобы показать, что экспрессия pTBR и pTBS в культивируемых клетках кукурузы BMS приводит к снижению жизнеспособности клеток, что измерили после трансформации по образованию трансгенного каллуса. Векторные ДНК интродуцировали в культивируемые BMS-клетки методом трансформации с использованием волокна карбида кремния, как описано в примере 2.

После трансформации с помощью pTBR и pTBS определяли средние значения образованного трансгенного каллуса относительно позитивного контроля pPG3, который содержит лишь полученную in vitro селективную кассету (фигура 14). Эти данные свидетельствуют, что нерегулируемая экспрессия гена α-тубулина из любого биотипа Eleusine indica приводит к существенному уменьшению получаемого трансгенного каллуса.

Формула изобретения

1. Способ ингибирования экспрессии гена в растительной ткани-мишени, который включает стабильную трансформацию типа растительной клетки, из которой может быть регенерировано целое растение с помощью генной конструкции, несущей тканеспецифичный или специфичный для развития промотор, который действует в клетках растительной ткани-мишени, и деструктивный ген, кодирующий белок, который при экспрессии обладает способностью ингибировать жизненно важную клеточную функцию, приводя к гибели клеток, причем указанный деструктивный ген выбирают из группы, состоящей из гена Т-urf13, генов, кодирующих α- или β-тубулин, и короткой смысловой конструкции с адениннуклеотидным транслокатором (АNТ) внутренней митохондриальной мембраны.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный промотор является тканеспецифичным промотором.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что растительная ткань-мишень взята из однодольного растения.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что растение представляет собой растение кукурузы.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что промотор представляет собой промотор, специфичный для пыльника и/или тапетума.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что промотор может быть выделен с использованием последовательностей кДНК любой фиг.1 - 3.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что промотор представляет собой промотор гена MFS14 (SEQ ID NO 8).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28