Способ получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, фармацевтической промышленности, в частности к способам получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, используемого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией. Препарат применяют для иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией и для лечения больных, не чувствительных к антибиотикам, или больных стафилококковой инфекцией, у которых антибиотики вызывают аллергические реакции. Способ включает перевод токсина в анаформу посредством обработки формальдегидом, очистку анатоксина путем обработки сухим хлоридом натрия, осаждение трихлоруксусной кислотой, сепарацию, растворение осадка в 0,9%-ном растворе хлорида, обрабатывают этиловым спиртом, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия до содержания 12 ЕС в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%. Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ дает возможность получить стафилококковый анатоксин, очищенный от балластных веществ, не реактогенный, не вызывающий аллергических реакций. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, фармацевтической промышленности, в частности, к способам получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, используемого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией.

Известен способ получения анатоксина стафилококкового нативного, включающего выращивание микробной массы в термостате, сепарацию микробной массы, получение токсина и перевод его в анаформу с последующей стерилизующей фильтрацией (1).

Однако этот препарат не очищен от балластных белков и имеет в конечном продукте процент формальдегида, превышающий норму (0,006-0,007%), что вызывает аллергические реакции; и он недостаточно иммуногенен.

Целью предлагаемого изобретения является получение анатоксина стафилококкового, очищенного от балластных белков, не реактогенного, с содержанием формальдегида не более 0,003%, не вызывающего аллергических реакций, высокоиммуногенного.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что микробную массу выращивают, сепарируют, переводят в анаформу путем добавления формальдегида, обрабатывают сухим химически чистым натрием хлорида, осаждают, сепарируют, центрифугируют и доводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида до нужной концентрации (12±2) единиц связывания (ЕС) в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%.

Пример 1. Микробную массу культуры стафилококка (производственный штамм Staphylococc 0-15) выращивают в термостате и на шутель-аппарате, что сокращает период выращивания биомассы на 5 суток, сепарируют; полученный токсин переводят в анаформу путем добавления формальдегида.

Обезвреженный анатоксин подвергают очистке. В бутыли с анатоксином добавляют сухого химически чистого натрия хлорида и после того, как соль растворится, бутыли помещают на (22±2) ч в холодную камеру, затем осаждают 1 н. трихлоруксусной кислотой и сепарируют. Осадок с поверхности сепаратора тщательно смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида, получая приблизительно 1/30 первоначального объема анатоксина. Концентрат помещают в холодную камеру при 0^oC на 20 ч.

В охлажденный концентрат стафилококкового анатоксина при тщательном перемешивании добавляют 2,5 объема этилового спирта, охлажденного до -20^oC. Образовавшийся после добавления спирта осадок отделяют на центрифугах при 2,5 - 3 тысячах оборотах в минуту. Вновь полученный осадок растворяют в охлажденном до 0^oC стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида, сливают в бутыль и добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида до объема концентрата, полученного после первого осаждения, доводят 15%-ным едким натром (NaOH) pH до 6,7±0,2 и оставляют во фриго при (7±3)^oC на 20 ч.

Центрифугирование растворенного осадка проводят для лучшей очистки надосадочной жидкости с целью более свободной фильтрации через свечи. Надосадочную жидкость собирают в бутыль. Полученный концентрированный стафилококковый анатоксин подают на стерилизующую фильтрацию через свечи Ф-5.

Концентрированный очищенный стафилококковый анатоксин (АСО), содержащий не менее 30 ЕС (единиц связывания) в 1 мл разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до содержания в 1 мл (12±2) ЕС. Остаточный формальдегид не более 0,003%. Полученный препарат применяется для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией, для лечения больных стафилококковой инфекцией, не чувствительных к антибиотикам или больных, у которых антибиотики вызывают аллергические реакции.

Пример 2. Препарат вводят 67 добровольцам в возрасте 22-54 лет подкожно в область нижнего угла лопатки в объеме 0,5 мл 3-кратно с интервалом между I и II инъекциями 5 дней, между II и III инъекциями - 20 дней.

На введение препарата местные реакции отмечены у 12 человек в виде незначительной гиперемии и малоболезненного уплотнения в месте введения анатоксина.

У 6 человек из этих 12 имели место слабые общие реакции: легкое недомогание, субфебрильная температура. Все указанные симптомы исчезали в течение 24-36 ч после введения препарата. У остальных 55 человек никаких неприятных ощущений, связанных с введением анатоксина, не отмечено.

Изучение иммунологической эффективности АСО, выраженной в Международных единицах (ME) проводят путем титрования антитоксина в сыворотках привитых методом торможения гемолиза (2).

Исследования проводят в следующие сроки: 1 - до начала иммунизации (исходный титр), II - через 20 дней после 2-ой инъекции препарата. III - через 2 месяца после окончания иммунизации. Исходные титры антитоксина у добровольцев были следующие: 0,25 ME - у 18 человек, 0,5 ME - у 22 человек, 1,0 ME - у 16 человек, 2,0 ME - у 9 человек, 4,0 ME - у 2 человек.

Кратность изменения титров антитоксина по отношению к исходным у добровольцев в процессе иммунизации представлена в таблице.

Представленные данные показывают, что после 2-ой прививки уровень антитоксина увеличился у 41 человека (61%), причем у 28 добровольцев (42%) он вырос значительно (в 8-32 раза).

Через 2 месяца после окончания иммунизации титры антитоксина увеличились по сравнению с исходными у 64 человек (96%), из числа которых у 40 человек (60%) имело место выраженное нарастание уровня антител (в 8 и более раз).

Анатоксин стафилококковый очищенный жидкий продемонстрировал высокую иммуногенность, отсутствие реактогенности и аллергических реакций, которые имели место в анатоксине стафилококковом нативном.

5. Пример 3. 165 женщинам с острыми и подострыми заболеваниями внутренних гениталий и 150 женщинам с часто рецидивирующими хроническими заболеваниями проводят комплексное лечение с использованием АСО.

Соответствующее распределение в контрольной группе составляет 420 и 260 пациенток. Введение женщинам АСО начинают с первых дней поступления в стационар при подостром течении или по стихании острых явлений.

Препарат вводят под кожу паховой складки бедра (зоны Захарьина-Геда) один раз в 3 дня в следующих нарастающих дозах: 0,1-0,3-0,5-0,7-0,9-1,2-1,5-1,7-2,0 мл.

Под влиянием проводимой иммунотерапии у большинства пациенток уже после третьей инъекции АСО улучшалось общее состояние, после четвертой-пятой нормализовалась температура, исчезали очаговые реакции, воспалительные опухоли придатков и инфильтраты значительно уменьшались в размерах, контуры их отграничивались, матка становилась подвижной.

Полученный эффект позволяет сократить пребывание женщин в стационаре и ограничить число инъекций АСО в клинике до 3-4. Последующие инъекции препарата осуществляют в амбулаторных условиях.

Применение АСО в обеих группах обследованных дает 100%-ный клинический эффект, причем у подавляющего большинства больных (82,7-97,6%) наступает выздоровление. В контрольных группах - у 5,2-11,3% больных эффекта не наблюдалось, а количество выздоровевших составило лишь 45,8 - 61,3%. Применение АСО позволяет сократить среднюю длительность пребывания больных в стационаре в 1,5-1,8 раза.

При оценке отдаленных результатов терапии показано, что в течение 48 месяцев по окончании лечения число рецидивов заболевания в группах больных, получавших АСО, было в 10 раз меньше, чем в группах больных, подвергнутых обычной противовоспалительной терапии.

Таким образом, анатоксин стафилококковый очищенный жидкий является высоко иммуногенным препаратом, не вызывающим аллергических реакций при лечении больных стафилококковой инфекцией.

Список литературы 1. Г. В. Выгодчиков "Стафилококковые инфекции". Государственное издательство медицинской литературы, Москва, 1963 г.

2. "Методические указания по лабораторной диагностике стафилококковых инфекций", Москва, 1963 г.

Формула изобретения

Способ получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, включающий выращивание микробной массы, сепарацию, перевод в анаформу путем добавления формальдегида, отличающийся тем, что анатоксин подвергают очистке путем обработки сухим химически чистым натрием хлорида, осаждают трихлоруксусной кислотой, сепарируют, осадок смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида, помещают при 0^oC на 20 ч в охлажденный концентрат, добавляют этиловый спирт при -20^oC, образовавшийся осадок центрифугируют и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия и доводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия до нужной концентрации (12 ± 2) ЕС в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PD4A - Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (RU)

Адрес для переписки:123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Извещение опубликовано: 10.02.2010        БИ: 04/2010