Способ получения тетрадекапептида

 

Описывается новый способ получения тетрадекапептида общей формулы (I) H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH. Пентапептид формулы Z-Thr(But)-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH подвергают конденсации с нонапептидом формулы Arg-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut, после этого у полученного полупродукта удаляют защитные группы и получают конечный продукт. Технический результат - упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области химии пептидных соединений, а также к области фармацевтической промышленности, а именно к новому способу получения тетрадекапептида (HEP-I) формулы (I) H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH который может найти применение в медицине.

Пептид может найти применение, в частности, при лечении СПИДа и других аналогичных заболеваний. Препараты для лечения СПИДа не могут излечивать больных СПИДом после инфицирования. Основная проблема заключается в том, что вирус иммунодефицита человека быстро мутирует, приводя к изменению в белках, являющихся мишенью противовирусных препаратов.

Таким образом, создание нового способа получения перспективного лекарственного препарата имеет важное значение для практической медицины.

Известен способ получения тетрадекапептида (HEP-I) формулы (I) (Патент Российской Федерации, RU 2127599), который заключается в том, что его синтез осуществляют твердофазным методом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с C-концевой глутаминовой кислоты, связанной с полимерной матрицей, с использованием соответствующих N-трет.бутилоксикарбониламинокислот в присутствии конденсирующего агента с последующей обработкой полученного защищенного пептидилполимера деблокирующими агентами.

Недостатком данного метода является низкий выход целевого продукта, невозможность аналитического контроля в процессе многостадийного синтеза, а также невозможность существенного увеличения масштабов синтеза.

Описанный выше метод синтеза является единственным и, таким образом, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному способу.

Задачей изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Предлагаемый способ, решающий эту задачу, заключается в конденсации пентапептида формулы (II) Z-Thr(But)-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH с нонапептидом формулы (III) Arg-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut Полученный защищенный тетрадекапептид формулы (IV) Z-Thr(But)-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(But)-Thr(But)- Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut подвергают взаимодействию последовательно с а) трифторуксусной кислотой
б) водородом в присутствии палладиевого катализатора
и целевой продукт очищают и выделяют в чистом виде или в виде ацетатной соли.

Полупродукты могут быть получены различными путями.

Промежуточный защищенный пентапептид формулы (II), используемый в способе, может быть получен обычными методами пептидного синтеза, например постадийной конденсацией аминокислот с использованием активированных эфиров.

В данном случае пентапептид формулы (II) получают, исходя из аргинина в виде свободного основания последовательным присоединением к нему N_α-карбобензокси- N_ε -трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N_α -карбобензокси- N_ε -трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-карбобензокси- γ -трет-бутил-глутаминовой кислоты и N-карбобензокси-O-трет-бутил-треонина. Конденсации проводят с помощью активированных эфиров. Карбобензоксизащитные группы из защищенных промежуточных пептидов удаляют каталитическим гидрогенолизом. Промежуточный защищенный нонапептид формулы (III), используемый в способе, может быть получен обычными методами пептидного синтеза, например постадийной конденсацией аминокислот с использованием активированных эфиров.

В данном случае нонапептид формулы (III) получают следующим образом:
1. Конденсацией пентапептида формулы (V)
Z-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-OH
с трипептидом формулы (VI)
Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut
с помощью дициклогексилкарбодиимида получают защищенный октапептид формулы (VII)
Z-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut
2. Октапептид формулы (VII) подвергают каталитическому гидрогенолизу с получением октапептида формулы (VIII)
Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut
3. Октапептид формулы (VIII) конденсируют с карбобензоксиаргинином с помощью дициклогексилкарбодиимида, получая защищенный нонапептид формулы (IX)
Z-Arg-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut
4. С помощью каталитического гидрогенолиза защищенный нонапептид формулы (IX) превращают в нонапептид формулы (III).

В свою очередь, пентапептид формулы (V) и трипептид формулы (VI) получают последовательной конденсацией аминокислот по одной аминокислоте, начиная с C-конца, с помощью активированных эфиров защищенных аминокислот, удаляя N-защитные группы каталитическим гидрогенолизом.

Конечный продукт получают следующим образом.

Полученный защищенный пентапептид формулы (II) конденсируют с нонапептидом формулы (III) с помощью дициклогексилкарбодиимида, получая с высоким выходом (больше 90%) защищенный тетрадекапептид формулы (IV). Защитные группы трет. бутильного типа с защищенного тетрадекапептида удаляют трифторуксусной кислотой, после чего с помощью каталитического гидрогенолиза удаляют карбобензокси-защитные группы.

Благодаря использованию легкодоступного, получаемого с высоким выходом пентапептида формулы (II), а также использованию нонапептида формулы (III) в предлагаемом способе удается получить целевой продукт с более высоким выходом по сравнению с синтезом из любых других полупродуктов.

Пример.

Сокращения:
ДМФА - диметилформамид
КДИ - дициклогексилкарбодиимид
HOBT - N-гидроксибензотриазол
Общая методика удаления карбобензокси-группы каталитическим гидрированием:
Защищенный пептид растворяют в метаноле из расчета 15-50 мл растворителя на 1 г пептида, добавляют 0,1 г 10-% палладиевого катализатора на угле и пропускают при перемешивании слабый ток водорода до исчезновения исходного продукта. Контроль осуществляется методом тонкослойной хроматографии. Раствор фильтруют для удаления катализатора и упаривают.

Тонкослойная хроматография.

Проводится на стеклянных пластинках Merck-Kieselgel в системах:
этилацетат-гексан 1:1 (система 1)
Хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 60:45:7:13 (система 2)
н-Бутанол-уксусная кислота-вода 3:1:1 (система 3)
Z-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut (а)
Растворяют 47.7 г (100 ммоль) Z-Lys(Boc)-OSu в 150 мл ДМФА, добавляют 28,5 г (110 ммоль) H-Glu(But)-OBut. Через 4 часа проверяют с помощью TLC (система 1) отсутствие активированного эфира, разбавляют реакционную смесь 400 мл этилацетата, промывают 200 мл 10-% уксусной кислоты, 100 мл воды, 200 мл 3-% карбоната натрия, упаривают. Полученное масло (71.2 г) используют без дальнейшей очистки. Выход количественный. R_f 0.43 (1).

Z-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut (б)
Гидрируют 71.2 г неочищенного (а) в 700 мл метанола, фильтруют, упаривают, остаток H-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut растворяют в 200 мл ДМФА и добавляют 45,6 г (105 ммоль) Z-Glu(But)-OSu. Через два часа добавляют 3 мл Me₂N(CH₂)₃NH₂ для удаления избытка активированного эфира. Через 30 мин разбавляют реакционную смесь 500 мл этилацетата, промывают смесью 300 мл воды и 150 мл насыщенного раствора NaCl, 200 мл 2-% серной кислоты, 100 мл воды, 200 мл 3-% карбоната натрия, упаривают. R_f 0.90 (1).

HCl•H-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut (в)
Растворяют весь защищенный трипептид (б) в 500 мл метанола, гидрируют над палладиевым катализатором, раствор фильтруют и добавляют при перемешивании 10-% раствор хлористого водорода в диоксане до pH 4 (контроль с помощью индикаторной бумаги). Раствор упаривают в вакууме, остаток высушивают в вакууме масляного насоса с охлаждаемой ловушкой. Сухой аморфный остаток весит 83.0 г (выход количественный в расчете на Z-Lys(Boc)-OSu). R_f 0.38 (1).

Z-Glu(But)-Arg-OH (г)
Растворяют 56.4 г (130 ммоль) Z-Glu(But)-OSu в 150 мл ДМФА, добавляют 21,8 г (140 ммоль) аргинина и перемешивают при 30-35^o в течение суток. Прозрачный вязкий раствор разбавляют 500 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и прмывают эфиром. Выход 62,1 г. 97%. (126 ммоль). R_f 0.58 (2).

Z-Val-Glu(But)-Arg-OH (д)
Растворяют 62,1 г (г) в 600 метанола, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 200 мл ДМФА и добавляют 150 ммоль (52,2 г) Z-Val-OSu. Через 6 часов добавляют к реакционной смеси 400 мл эфира и 400 мл воды и выдерживают сутки при 0^o. Выпавший осадок промывают водой, эфиром и высушивают на воздухе. Выход 61,5 г. 87%. (104 ммоль). R_f 0.61 (2).

Z-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-OH(e)
Растворяют 56,4 г (95,2 ммоль) защищенного трипептида (г) в 500 мл метанола, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 150 мл ДМФА и добавляют 44,6 г (95 ммоль) Z-Thr(But)-ONB.

Через 6 часов раствор разбавляют 500 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Выход 62,6 г. 87%. (83,5 ммоль). R_f 0.69 (2).

Z-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-OH (ж)
Растворяют 62,6 г (83,5 ммоль) защищенного тетрапептида (е) в смеси 700 мл метанола и 100 мл воды, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 150 мл ДМФА и добавляют 36,9 г (85 ммоль) Z-Glu(But)-OSu. Через 6 часов раствор разбавляют 500 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Выход 70,6 г. 90%. (75,6 ммоль). R_f 0.45 (2).

Z-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)- Glu(But)-OBut•HCl (з)
В смеси 300 мл ДМФА и 300 мл ДМСО растворяют 70,6 г (ж) (75,6 ммоль), 57 г (III) (80,4 ммоль), 20,2 г HOBT (150 ммоль), отгоняют в вакууме несколько миллилитров растворителя для удаления воды, охлаждают льдом и добавляют при перемешивании 21 г (100 ммоль) КДИ.

Через 3 часа добавляют 3 мл N-метилморфолина и оставляют на ночь при комнатной температуре. Вязкую реакционную массу смешивают с 600 мл хлороформа и 400 мл н-бутанола, нагревают до 50^o, добавляют 400 мл воды и фильтруют в теплом виде. Органический слой промывают 800 мл воды, нагретой до 50^o, упаривают до состояния текучего геля и добавляют 1,5 л гексана. Полученный осадок отфильтровывают, промывают смесью этилацетат-гексан 1:3, высушивают на воздухе. Выход 114,7 г. 93%. (70,5 ммоль). R_f 0.71 (3).

Z-Arg-Glu(But)-Thr(But)-Val-Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)- Glu(But)-OBut•2HClO₄ (и)
Растворяют при нагревании 31,7 г (19,5 ммоль) (з) в 700 мл метанола, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 120 мл ДМФА при 35-40^o. Отдельно растворяют 7,4 г (24 ммоль) Z-Arg-OH, 24 ммоль (2,7 мл) 72-% хлорной кислоты и 6,5 г (48 ммоль) HOBT в 50 мл ДМФА и отгоняют в вакууме несколько миллилитров растворителя для удаления воды. Добавляют раствор октапептида, охлаждают льдом и добавляют при перемешивании 6,3 г (30 ммоль) КДИ. Через 2 ч добавляют 2,2 мл N-метилморфолина и еще 2,6 г КДИ. Через сутки реакционную смесь разбавляют 700 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают дважды смесью 250 мл воды и 2 мл 8М хлорной кислоты, затем смесью 200 мл воды и 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, упаривают, растирают остаток со смесью 400 мл этилацетата и 400 мл гексана, отфильтровывают и промывают тем же растворителем. Выход 28,4 г. 81%. (15,8 ммоль). R_f 0.56 (3).

Z-Lys(Boc)-Arg-OH (к)
Растворяют 23.3 г (48.8 ммоль) Z-Lys(Boc)-OSu в 70 мл ДМФА, добавляют 8.1 г (52 ммоль) аргинина и перемешивают при 30-35^o в течение суток. Прозрачный вязкий раствор разбавляют 400 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Выход 25.2 г. 96%. (47 ммоль). R_f 0.50 (2).

Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH (л)
Растворяют 25.2 r (47 ммоль) (к) в 300 мл метанола, гидрируют, упаривают остаток растворяют в 150 мл ДМФА и добавляют 24.8 г (52 ммоль) Z-Lys(Boc)-OSu. Через 6 часов раствор разбавляют 500 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и прoмывают эфиром. Выход 32.3 г (42.2 ммоль). R_f 0.72 (2).

Z-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH (м)
Растворяют 32.3 г (42.2 ммоль) трипептида (л) в 600 метанола, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 100 мл ДМФА и добавляют 46 ммоль (20) Z-Glu(But)-OSu. Через 6 часов добавляют к реакционной смеси 400 мл эфира и 400 мл воды и выдерживают сутки при 0^o. Выпавший осадок промывают водой, эфиром и высушивают на воздухе. Выход 27 г. 49%. (28,4 ммоль). R_f 0.77 (2).

Z-Thr(But)-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH (н)
Растворяют 27 г (28,4 ммоль) защищенного тетрапептида (м) в 500 мл метанола, гидрируют, упаривают, остаток растворяют в 150 мл ДМФА и добавляют 15 (32 ммоль) Z-Thr(But)-ONB. Через 6 часов раствор разбавляют 500 мл н-бутанола, добавляют 300 мл воды и 100 мл насыщенного раствора NaCl. Органическую фазу промывают 200 мл воды, упаривают, остаток растирают с 400 мл эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Выход 30,3 г (27,3 ммоль). R_f 0.80 (2).

Z-Thr(But)-Glu(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(But)-Thr(But)-Val- Glu(But)-Arg-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut•3HClO₄ (о)
Растворяют при нагревании 28,4 г (15,8 ммоль) защищенного нонапептида (и) в 800 мл метанола, гидрируют, остаток растворяют в 400 мл ДМФА, добавляют 17,7 г (16 ммоль) пентапептида (н), 16 ммоль 72-% хлорной кислоты (1,8 мл), 4.7 г (35 ммоль) HOBT и отгоняют несколько миллилитров растворителя для удаления воды. При охлаждении льдом и перемешивании добавляют 5,25 г (25 ммоль) КДИ, затем через 2 часа 1 мл N-метилморфолина. Перемешивают сутки при комнатной температуре, упаривают до 1/3 объема в вакууме масляного насоса, смешивают остаток с 300 мл гексана, 300 мл этилацетата и 500 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой и смесью этилацетат-гексан, высушивают на воздухе. Выход 42,3 г. 93%. R_f 0.51 (3).

H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH• nAcOH (п)
Весь защищенный тетрадекапептид (о) растворяют в 300 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 час при 25^o, упаривают, остаток растирают с 500 мл эфира, отфильтровывают, промывают эфиром и растворяют в 500 мл воды. Водный раствор фильтруют, экстрагируют неполярные примеси с помощью 200 мл н-бутанола. Органическую фазу отбрасывают, а водную смешивают с 200 мл метанола, добавляют 2 г 10% палладиевого катализатора на угле, нагревают до 40^o и добавляют порциями 30 мл насыщенного раствора формиата аммония в течение 3 часов. Раствор перемешивают при комнатной температуре 20 часов, фильтруют и наносят на колонку, содержащую 1 л SP-сефадекса в 0.2М пиридинацетатном буферном растворе. Разделение проводят в градиенте 0,2М - 1,3М пиридинацетатного буфера; фракции, содержащие продукт, упаривают, дважды упаривают с водой и лиофилизуют из водного раствора. Дополнительная очистка производится путем препаративной хроматографии высокого давления на носителе с обращенной фазой. Выход продукта чистотой 95-97% 13,2 г. (44%).

Аминокислотный анализ: треонин 1.9 (2), валин 1.0 (1), лизин 3.1 (3), аргинин 2.9 (3), глутаминовая кислота 5.2 (5).

[α]_D-27° (c = 0.5 в 95% уксусной кислоте). Продукт охарактеризован также масс-спектром и спектром ядерного магнитного резонанса.

Время удерживания на ВЭЖХ ≅ 8.5 мин.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) проводится на хроматографе Gilson (Франция) в следующих условиях:
- колонка ODS размером 250 х 4.6 мм, заполненная сорбентом с обращенной фазой с размером частиц 5 мкм;
- подвижная фаза A: 0.2% раствор кислоты трифторуксусной в 0.1 М растворе натрия хлорида;
- подвижная фаза B: ацетонитрил;
- градиентный режим: от 35 до 45% фазы B в течение 10 мин;
- скорость потока 1.0 мл/мин;
- детектирование при длине волны 220 нм;
- чувствительность 0.1 ОЕ.

Тонкослойная хроматография проводится на пластинках Merck-Kieselgel-60 в системах:
(1) Хлороформ-этилацетат-уксусная кислота 8:26:0.2
(2) Хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 75:15:5:2
(3) Хлороформ-метанол 9:1.

Формула изобретения

1. Способ получения тетрадекапептида треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат формулы
H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH
отличающийся тем, что пентапептид формулы
Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-OH
подвергают конденсации с нонапептидом формулы
Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX,
полученный защищенный тетрадекапептид формулы
Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX,
где X, Y, Z - водород или защитные группы,
подвергают взаимодействию с трифторуксусной кислотой, гидрируют в присутствии катализатора и выделяют конечный продукт.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой третбутильную группу (But), Y - третбутилоксикарбонильную группу (Boc), а Z - бензилоксикарбонил.