N-замещенные 2-цианопирролидины

 

Изобретение относится к N-(N'-замешенный глицил)-2-цианопирролидину формулы I, где R обозначает: а) ₁R_1aN (CH₂)_m-, где R₁ обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой; R_1a обозначает водород или С₁-С₈ алкил, m равно 2,3, б) С₃-С₁₂ циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 С₁-С₃ гидроксиалкилом, в) R₂(CH₂)_n-, где либо R₂ обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга С₁-С₄ алкоксигруппой, галогеном или фенилтиогруппой, необязательно однозамещенной в фенильном кольце гидроксиметилом; или обозначает С₁-С₈ алкил, [3.1.1] бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный С₁-С₈ алкилом, пиридинильный или нафтильный фрагмент, или циклогексенил, или адамантил и n равно 1-3, либо R₂ обозначает феноксигруппу; и n равно 2; г) (R₃)₂CH(CH₂)₂-, где каждый R₃ независимо обозначает фенил; д) R₄(CH₂)_р-, где R₄ обозначает 2-оксопирролидинил или С₂-С₄ алкокси; и р равно 2-4, е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 С₁-С₃ гидроксиалкилом, ж) R₅, который обозначает инданил пиперидинильный фрагмент, необязательно замещенный бензилом, [2.2.1] - или [3.1.1] бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный С₁-С₈ алкилом, адамантил или С₁-С₈ алкил, необязательно одно- или многозамещенный независимо друг от друга гидроксигруппой, гидроксиметилом или фенилом, необязательно одно- или двузамещенным выбранным независимо друг от друга С₁-С₄ алкилом, С₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном, в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли. Соединение формулы I используют в фармацевтической композиции, которая ингибирует ДПП-IV, в частности для лечения сахарного диабета, не зависящего от инсулина, и состояний, обусловленных пониженной толерантностью к глюкозе (ПТГ). 2 c. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к N-замещенным 2-цианопирролидинам. В частности, оно относится к новым производным N-глицил-2-цианопирролидина.

Предпосылки создания изобретения Дипептидилпептидаза-IV (ДПП-IV) представляет собой сериновую протеазу, которая отщепляет N-концевые дипептиды от пептидной цепи, предпочтительно содержащей остаток пролина в предпоследнем положении. Хотя биологическая роль ДПП-IV в системах млекопитающих не выяснена до конца, существует мнение, что она играет важную роль в метаболизме нейропептидов, активации Т-клеток, прикреплении раковых клеток к эндотелию и в проникновении ВИЧ в лимфатические клетки. ДПП-IV ответственна за инактивацию глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1). В частности, ДПП-IV отщепляет аминоконцевой дипептид GLP-1, представляющий собой His-Ala, приводя к образованию антагониста рецептора GLP-1, и тем самым сокращает время физиологической реакции на GLP-1. Поскольку время, за которое ДПП-IV расщепляет половину субстрата, намного меньше времени полувыведения GLP-1 из кровотока, можно ожидать, что ингибирование ДПП-IV приведет к существенному увеличению биологической активности GLP-1 (в 5-10 раз). Поскольку GLP-1 является основным стимулятором секреции инсулина поджелудочной железой и оказывает непосредственные благоприятные воздействия на превращение глюкозы, по-видимому, ингибирование ДПП-IV представляет собой перспективный способ лечения сахарного диабета, не зависящего от инсулина (НЗИСД).

К настоящему времени описано большое количество ингибиторов ДПП-IV (например, ЕР 115639 А1, ЕР 172458, ЕР 0537802 А2). Однако все они имеют определенные ограничения, связанные с эффективностью, стабильностью или токсичностью. Поэтому существует необходимость в новых ингибиторах ДПП-IV, пригодных для лечения состояний, опосредованных ингибированием ДПП-IV, лишенных указанных выше ограничений.

Краткое изложение сущности изобретения Изобретение относится к новым N-(N'-замещенный глицил)-2-цианопирролидинам, эффективным в качестве ингибиторов ДПП-IV при лечении состояний, опосредуемых ДПП-IV. Оно также относится к соответствующим фармацевтическим композициям, к способу их получения, к способу ингибирования ДПП-IV, включающему введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества такой композиции, к соединениям, предназначенным для применения в качестве фармацевтического препарата, и к их применению в способе изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения состояния, опосредованного ДПП-IV.

Подробное описание изобретения Изобретение относится к N-(N'-замещенный глицил)-2-цианопирролидинам, кратко называемым в настоящем описании "соединения по изобретению", и в частности к соединениям формулы I: где R обозначает: а) R₁R_1a(CH₂)_m-, где R₁ обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга С₁-С₄ алкилом, С₁-₄ алкоксигруппой, галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой, или обозначает фенил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга С₁-С₄ алкилом, С₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном, R_1a обозначает водород или С₁-С₈ алкил и
m равно 2 или 3,
б) С₃-С₁₂циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 С₁-С₃ гидроксиалкилом,
в) R₂(CH₂)_n-, где
R₂ обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга С₁-С₄ алкилом, С₁-С₄ алкоксигруппой, галогеном или фенилтиогруппой, необязательно однозамещенной в фенильном кольце гидроксиметилом, или обозначает С₁-С₈ алкил, [3.1.1]бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный С₁-С₈ алкилом, пиридинильный или нафтильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга C₁-С₄ алкилом, С₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном, циклогексен или адамантил и
n равно 1-3 или
R₂ обозначает феноксигруппу, необязательно одно- или независимо двузамещенную С₁-С₄ алкилом, С₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном, и
n равно 2 или 3,
г) (R₃)₂СН(СН₂)₂-, где
R₃ в каждом случае независимо обозначает фенил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга ₁-С₄ алкилом, C₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном,
д) R₄(CH₂)_p-, где
R₄ обозначает 2-оксопирролидинил или С₂-С₄ алкокси и
р равно 2-4,
е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃ гидроксиалкилом,
ж) R₅, который обозначает инданил, пирролидинильный или пиперидинильный фрагмент, необязательно замещенный бензилом; [2.2.1]- или [3.1.1]бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный С₁-С₈ алкилом, адамантил или С₁-С₈ алкил, необязательно одно- или многозамещенный выбранными независимо друг от друга гидроксигруппой, гидроксиметилом или фенилом, необязательно одно- или двузамещенным выбранными независимо друг от друга C₁-С₄ алкилом, C₁-С₄ алкоксигруппой или галогеном,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Соединения формулы I могут существовать в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли. Соли могут быть получены известным способом из свободной формы, и наоборот. Кислотно-аддитивные соли могут, например, представлять собой соли фармацевтически приемлемых органических или неорганических кислот. Хотя предпочтительными кислотно-аддитивными солями являются гидрохлориды, также могут применяться соли метансульфоновой, серной, фосфорной, лимонной, молочной и уксусной кислоты.

Соединения по изобретению могут существовать в форме оптически активных изомеров или диастереоизомеров и могут быть разделены и выделены общепринятыми методами, такими, как хроматография.

Понятия "алкил" или "алкокси" обозначают радикалы, имеющие прямую или разветвленную цепь; примерами последних являются изопропил и третбутил.

R предпочтительно имеет значения, указанные выше в п.п. а), б) или д). R₁ предпочтительно обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно замещенный, как это указано выше. R_1a предпочтительно обозначает водород. R₂ предпочтительно обозначает фенил, необязательно замещенный, как это указано выше. R₃ предпочтительно обозначает незамещенный фенил. R₄ предпочтительно обозначает алкокси. R₅ предпочтительно обозначает необязательно незамещенный алкил, как это указано выше. m предпочтительно равно 2. n предпочтительно равно 1 или 2, наиболее предпочтительно 2. р предпочтительно равно 2 или 3, наиболее предпочтительно 3.

Пиридинил предпочтительно обозначает пиридин-2-ил, более предпочтительно он является незамещенным или однозамещенным, предпочтительно в положении 5. Пиримидинил предпочтительно обозначает пиримидин-2-ил. Предпочтительно он является незамещенным или однозамещенным, предпочтительно в положении 4. Предпочтительными заместителями для пиридинила и пиримидинила являются галоген, циано- и нитрогруппа, наиболее предпочтительным заместителем является хлор.

При наличии заместителей фенил предпочтительно является однозамещенным, при этом он предпочтительно замещен галогеном, более предпочтительно хлором, или метоксигруппой. Предпочтительно он замещен в положении 2, 4 и/или 5, наиболее предпочтительно в положении 4.

С₃-С₁₂циклоалкил предпочтительно обозначает циклопентил или циклогексил. При наличии заместителей он предпочтительно замещен гидроксиметилом. С₁-С₄ алкокси предпочтительно имеет 1 или 2 атома углерода, наиболее предпочтительно обозначает метокси. С₂-С₄ алкокси предпочтительно имеет 3 атома углерода, наиболее предпочтительно обозначает изопропокси. Галоген обозначает фтор, хлор, бром или йод, предпочтительно фтор, хлор или бром, наиболее предпочтительно хлор. С₁-С₈ алкил предпочтительно имеет от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4 или от 3 до 5 атомов углерода, наиболее предпочтительно 2 или 3 атома углерода, или обозначает метил. С₁-С₄ алкил предпочтительно обозначает метил или этил, наиболее предпочтительно метил. C₁-С₃ гидроксиалкил предпочтительно обозначает гидроксиметил.

[3.1.1] бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно замещенный, как это указано выше, предпочтительно обозначает бицикло[3.1.1]гепт-2-ил, необязательно замещенный в положении 6 метилом, или бицикло[3.1.1] гепт-3-ил, необязательно тризамещенный одной метильной группой в положении 2 и двумя метильными группами в положении 6. [2.2.1]бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно замещенный, как это указано выше, предпочтительно обозначает бицикло[2.2.1]гепт-2-ил.

Нафтил предпочтительно обозначает 1-нафтил. Циклогексен предпочтительно обозначает циклогекс-1-ен-1-ил. Адамантил предпочтительно обозначает 1- или 2-адамантил.

Пирролидинильный или пиперидинильный фрагмент, необязательно замещенный, как это указано выше, предпочтительно обозначает пирролидин-3-ил или пиперидин-4-ил. При наличии заместителей он предпочтительно является N замещенным.

Предпочтительная группа соединений по изобретению включает соединения формулы I, где R обозначает R' (соединения Iа), причем R' обозначает:
- R₁'NH(CH₂)₂-, где R₁' обозначает пиридинил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой, или обозначает незамещенный пиримидинил,
- С₃-С₇циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃ гидроксиалкилом,
- R₄'(СН₂)₃-, где R₄' обозначает С₂-С₄ алкокси, или
- R₅, где R₅ имеет указанные выше значения,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Более предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения формулы I, где R обозначает R'' (соединения Ib), причем R'' обозначает:
- R₁''NH(CH₂)₂-, где R₁'' обозначает пиридинил, одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой,
- С₄-С₆циклоалкил, однозамещенный в положении 1 С₁-С₃ гидроксиалкилом,
- R₄'(СН₂)₃-, где R₄' имеет указанные выше значения, или
- R₅', где R₅' обозначает [2.2.1]- или [3.1.1]бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный C₁-С₈ алкилом, или обозначает адамантил,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Еще более предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения формулы I, где R обозначает R''' (соединения Iс), причем R''' обозначает:
- R₁''NH(CH₂)₂-, где R₁'' имеет указанные выше значения,
- С₄-С₆циклоалкил, однозамещенный в положении 1 гидроксиметилом,
- R₄'(CH₂)₃-, где R₄' имеет указанные выше значения, или
- R₅'', где R₅'' обозначает адамантил,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Еще одна группа соединений по изобретению включает соединения Iр, где R обозначает R^p, который обозначает:
а) R₁ ^pNH(CH₂)₂-, где R₁ ^p обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой,
б) С₃-С₇циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃ гидроксиалкилом,
в) R₂ ^p(CH₂)₂-, где R₂ ^p обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном или C₁-С₃ алкоксигруппой,
г) (R₃ ^p)₂CH(CH₂)₂-, где каждый R₃ ^p независимо обозначает фенил, необязательно однозамещенный галогеном или С₁-С₃ алкоксигруппой,
д) R₄(CH₂)₃-, где R₄ имеет указанные выше значения, или
е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 С₁-С₃ гидроксиалкилом,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Еще одна группа соединений по изобретению включает соединения Is, где R обозначает R^s, который обозначает:
а) R₁ ^sR_1a ^s(CH₂)_ms-, где R₁ ^s обозначает пиридинил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга хлором, трифторметилом, циано- или нитрогруппой, пиримидинил, необязательно однозамещенный хлором или трифторметилом, или обозначает фенил,
R_1a ^s обозначает водород или метил и
ms равно 2 или 3,
б) С₃-С₁₂циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 гидроксиметилом,
в) R₂ ^s(CH₂)_ns-, либо
R₂ ^s обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, алкоксигруппой, имеющей 1 или 2 атома углерода, или обозначает фенилтиогруппу, однозамещенную в фенильном кольце гидроксиметилом, С₁-С₆ алкил, 6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ил, пиридинил, нафтил, циклогексен, или адамантил, и ns равно 1-3, либо
R₂ ^s обозначает фенокси, а ns равно 2,
г) (3,3-дифенил) пропил,
д) R₄ ^s(CH₂)_ps, где R₄ ^s обозначает 2-оксопирролидин-1-ил или изопропокси и ps равно 2 или 3,
е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 гидроксиметилом,
ж) R₅ ^s, где R₅ ^s обозначает инданил, пирролидинильный или пиперидинильный фрагмент, необязательно N-замещенный бензилом, бицикло [2.2.1] гепт-2-ил, 2,6,6-триметилбицикло[3.1.1] гепт-3-ил, адамантил или С₁-С₈ алкил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга гидроксигруппой, гидроксиметилом или фенилом,
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Соединения по изобретению могут быть получены способом, включающим сочетание реакционноспособного (2-цианпирролидино) карбонилметиленового соединения с соответствующим замещенным амином, в частности, для получения соединений формулы I он включает взаимодействие соединения формулы II

где Х обозначает реакционноспособную группу,
с соединением формулы III
NH₂R III
где R имеет указанные выше значения, и выделение образовавшегося соединения формулы I в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

Х предпочтительно обозначает галоген, такой, как бром, хлор или йод.

Способ по изобретению может быть осуществлен обычным образом.

Соединение формулы II предпочтительно подвергают взаимодействию по крайней мере с 3 эквивалентами первичного амина формулы III. Взаимодействие целесообразно проводить в присутствии инертного органического растворителя, предпочтительно циклического простого эфира, такого, как тетрагидрофуран. Температура предпочтительно находится в диапазоне приблизительно от 0^oС до приблизительно 35^oС, предпочтительно приблизительно от 0^oС до приблизительно 25^oС.

Соединения по изобретению могут быть выделены из реакционной смеси и очищены общепринятыми методами, например, хроматографией.

Исходные продукты также могут быть получены общепринятым способом.

Соединения формулы II могут, например, быть получены согласно следующей двухстадийной реакционной схеме, представленной в конце описания.

Стадия 1 включает взаимодействие пирролидина формулы IV с небольшим молярным избытком галогенацетилгалогенида, такого, как бромацетилбромид или хлорацетилхлорид, и триэтиламина и каталитическим количеством диметиламинопиридина (ДМАП). Взаимодействие целесообразно проводить в присутствии инертного органического растворителя, предпочтительно хлорированного алифатического углеводорода, такого, как метиленхлорид, при температуре приблизительно от 0^oС до приблизительно 25^oС, предпочтительно при температуре в диапазоне приблизительно от 0^oС до приблизительно 15^oС.

Стадия 2 включает дегидратацию соединения формулы V, полученного на стадии 1, с помощью по крайней мере 2 эквивалентов трифторуксусного ангидрида (ТФУА). Дегидратацию предпочтительно проводят в присутствии инертного органического растворителя, такого, как тетрагидрофуран, или хлорированного алифатического углеводорода, такого, как метиленхлорид, при температуре приблизительно от 0^oС до приблизительно 25^oС, предпочтительно приблизительно от 0^oС до приблизительно 15^oС.

Если получение исходного продукта не конкретно представлено в настоящем описании, соединение, используемое в качестве исходного продукта, является известным или может быть получено из известных соединений известным способом либо по аналогии с известными способами или аналогично способам, описанным в примерах.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах. Все температуры указаны в градусах Цельсия.

Пример 1: 1-[2-[(5-хлорпиридин-2-ил)амино] этиламино] ацетил-2-циан-(S)- пирролидин
В колбу объемом 500 мл добавляют 16,6 г 2-[(5-хлорпиридин-2-ил)амино] этиламина и 100 мл тетрагидрофурана и смесь охлаждают в ледяной бане. К охлажденной смеси добавляют 7,0 г (2-цианпирролидино)карбонилметилен-(S)-бромида, растворенного в 30 мл тетрагидрофурана. Образовавшуюся смесь перемешивают в течение 2 ч при 0^oС, растворитель удаляют на роторном испарителе и смесь разделяют между этилацетатом и водой. Затем продукт экстрагируют этилацетатным слоем, после чего водный слой дважды промывают этилацетатом. Объединенные органические слои последовательно промывают водой и соляным раствором, сушат над сульфатом натрия и концентрируют, получая требуемое соединение в форме свободного основания в виде неочищенного продукта. Затем неочищенный продукт очищают на силикагеле, используя в качестве элюента смесь 5%-ного метанола в метиленхлориде и получая указанное в заголовке соединение в форме свободного основания в виде масла светло-коричневого цвета.

После растворения свободного основания в 30 мл безводного тетрагидрофурана раствор барботируют газообразным хлористым водородом в течение 5 с. Образовавшийся беловатый осадок фильтруют, промывают безводным тетрагидрофураном и растворитель удаляют с помощью откачки в глубоком вакууме, получая указанное в заголовке соединение в форме кислотно-аддитивной соли, дигидрохлорида (беловатое твердое вещество, t_пл 265-267^oС, ЯМР: см. * внизу приведенной ниже таблицы).

Исходный продукт получают следующим способом.

а) В 200 мл метиленхлорида растворяют 22,37 г (S)-2-карбамоилпирролидина, 30,1 мл триэтиламина и 30,0 мг диметиламинопиридина (ДМАП) и затем полученный раствор в течение 60 мин по каплям добавляют в присутствии сушильной трубки с сульфатом кальция к охлажденному на льду раствору, содержащему 18,8 мл бромацетилбромида в 192 мл метиленхлорида. Образовавшийся раствор перемешивают в течение 2 ч при температуре смеси лед-вода в присутствии сушильной трубки с сульфатом кальция, а затем сливают на 3,5 л этилацетата. Образовавшийся осадок фильтруют, промывают этилацетатом и фильтрат концентрируют, получая (2-карбамоилпирролидино)карбонилметилен-(S)-бромид (твердое липкое вещество желтого цвета).

б) 50,0 г бромсодержащего соединения, полученного выше на стадии а), растворяют в 300 мл метиленхлорида и раствор охлаждают в бане с ледяной водой в присутствии сушильной трубки с сульфатом кальция. Затем охлажденный раствор в течение 2 мин сливают на 60,2 мл трифторуксусного ангидрида, образовавшийся раствор перемешивают в течение 4 ч при температуре смеси лед-вода в присутствии сушильной трубки с сульфатом кальция и распределяют между метиленхлоридом и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Продукт экстрагируют метиленхлоридным слоем и водный слой дважды промывают метиленхлоридом. Объединенные органические слои последовательно промывают водой и соляным раствором и затем сушат над сульфатом натрия. Раствор фильтруют и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя и откачки в глубоком вакууме, получая (2-цианопирролидино)карбонилметилен-(S)-бромид (твердое вещество темно-желтого цвета).

Представленные ниже в таблице соединения формулы I по изобретению получают аналогичным способом путем взаимодействия соответствующего соединения формулы II с соответствующим соединением формулы III (в приведенной ниже таблице, если указана только форма кислотно-аддитивной соли соединения по изобретению, соединение получают из свободного основания без ее выделения).

Соединения по изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, кратко называемые ниже в настоящем описании "агентами по изобретению", в частности соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, обладают фармакологической активностью. Поэтому они могут применяться в качестве фармацевтических препаратов.

В частности, они ингибируют ДПП-IV. Эта активность может быть продемонстрирована с помощью анализа ДПП-IV с использованием клеток линии Сасо-2, в котором измеряют способность тестируемых соединений ингибировать активность ДПП-IV из экстрактов клеток карциномы ободочной кишки. Линия клеток Сасо-2 карциномы ободочной кишки человека может быть получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС НВТ 37). Дифференцировку клеток для индукции экспрессии ДПП-IV осуществляют согласно Reisher и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5757-5761. Экстракт клеток получают из клеток, солюбилизированных в буфере, включающем 10 мМ Трис-HCl, 0,15 М NaCl, 0,04 t.i. u. (трипсинингибирующие единицы) апротинина, 0,5%-ный неионогенный детергент Р40, рН 8,0, который центрифугируют при 35000xg в течение 30 мин при 4^oC для удаления клеточного дебриса. Анализ проводят путем добавления в лунки титрационного микропланшета 20 мкг солюбилизированного протеина Сасо-2, разбавленного до конечного объема 125 мкл в буфере для анализа (25 мМ Трис-НСl рН 7,4, 140 мМ NaCl, 10 мМ КСl, 1% бычьего сывороточного альбумина). Реакцию инициируют путем добавления 25 мкл 1 мМ субстрата (Н-аланин-пролин-пНА, где пНА обозначает пара-нитроанилин). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего добавляют 19 мкл 25%-ной ледяной уксусной кислоты для прекращения реакции. Тестируемые соединения, как правило, добавляют порциями объемом 30 мкл и объем буфера для анализа доводят до 95 мкл. Стандартную кривую для свободного пара-нитроанилина получают с использованием 0-500 мкМ растворов свободного пНА в буфере для анализа. Полученная зависимость является линейной, и ее используют для интерполяции поглощения субстрата (каталитическая активность в нмолях разложенного субстрата/мин). Конечную точку определяют путем измерения абсорбции при 405 нм с помощью ридера для титрационного микропланшета типа Molecular Devices UV Max. Активность тестируемых соединений в качестве ингибиторов ДПП-IV, выраженную в виде IC₅₀, вычисляют на основе зависимостей доза-ответ, полученных по 8 точкам, с использованием четырехпараметрической логарифмической функции.

В вышеописанном анализе для агентов по изобретению получают значения IC₅₀ приблизительно от 10 нМ до приблизительно 900 нМ, например, 22 нМ для агента из примера 3.

Ингибирование ДПП-IV также может быть продемонстрировано путем измерения воздействий тестируемых соединений на активность ДПП-IV в плазме человека и крысы с использованием модифицированной версии анализа, описанного Kubota и др. в Clin. Exp. Immunol. 89 (1992) 192-197. В целом этот анализ состоит в том, что 5 мкл плазмы добавляют в 96-луночные плоскодонные титрационные микропланшеты (фирмы Falcon), а затем добавляют 5 мкл 80 мМ MgCl₂ в буфере для инкубации (25 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 1% БСА с чистотой для РИА (радиоиммунный анализ), рН 7,8). После 5 мин инкубации при комнатной температуре реакцию инициируют путем добавления 10 мкл буфера для инкубации, содержащего 0,1 мМ субстрат (Н-глицин-пролин-АМК, где АМК обозначает 7-амино-4-метилкумарин). Планшеты покрывают алюминиевой фольгой (или содержат в темноте) и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. После проведения реакции в течение 20 мин измеряют флуоресценцию с использованием флуориметра типа CytoFluor 2350 (возбуждение при 380 нм, эмиссия при 460 нм, устанавливают уровень чувствительности 4). Тестируемые соединения, как правило, добавляют порциями объемом 2 мкл и объем буфера для анализа доводят до 13 мкл. Зависимость флуоресценция-концентрация свободного АМК получают с использованием 0-50 мкМ растворов АМК в буфере для анализа. Полученная зависимость является линейной, и ее используют для интерполяции поглощения субстрата (каталитическая активность в нмолях разложенного субстрата/мин). Как и в предыдущем анализе, активность тестируемых соединений в качестве ингибиторов ДПП-IV, выраженную в виде IС₅₀, вычисляют на основе зависимостей доза-ответ, построенных по 8 точкам, с использованием четырехпараметрической логарифмической функции.

В вышеописанном анализе получают значения IC₅₀ в плазме человека приблизительно от 7 нМ до приблизительно 2000 нМ, а в плазме крысы - приблизительно от 3 нМ до приблизительно 400 нМ, например, для агента из примера 3 получают значения 7 нМ в плазме человека и 6 нМ в плазме крысы соответственно.

Агенты по изобретению благодаря способности ингибировать ДПП-IV могут применяться при лечении состояний, опосредованных ДПП-IV. Следует ожидать, что соединения, приведенные в настоящем описании, пригодны для лечения сахарного диабета, не зависящего от инсулина, артрита, ожирения и остеопороза, такого, как остеопороз, зависящий от кальцитонина. Агенты по изобретению улучшают начальный инсулиновый ответ на введение глюкозы оральным путем и, следовательно, наиболее пригодны для лечения сахарного диабета, не зависящего от инсулина, и других состояний, обусловленных пониженной толерантностью к глюкозе (ПТГ).

Способность агентов по изобретению улучшать начальный инсулиновый ответ на введение глюкозы оральным путем может быть оценена, например, на устойчивых к инсулину крысах в соответствии со следующим методом.

Самцов крыс линии Sprague-Dawley, находившихся на диете с высоким содержанием жира (насыщенный жир = 57% калорий) в течение 2-3 недель, в день опыта обездвиживают приблизительно на 2 ч, разделяют на группы по 8-10 особей и вводят оральным путем 10 мкмолей/кг тестируемых соединений в карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ). Болюс глюкозы 1 г/кг, предназначенный для орального введения, вводят через 30 мин после тестируемого соединения непосредственно в желудок опытных животных. Образцы крови, взятые в различные моменты времени с помощью катетеров, постоянно введенных в яремную вену, анализируют на наличие глюкозы в плазме, оценивают иммуннореактивные концентрации инсулина (ИРИ) и активность ДПП-IV в плазме. Уровни инсулина в плазме оценивают с помощью радиоиммуноанализа (РИА) для двух антител с использованием специфического крысиного антитела к инсулину, поставляемого фирмой Linco Research (St. Louis, МО, США). РИА имеет нижний предел чувствительности 0,5 микроединиц/мл при вариациях в пределах одного опыта и между опытами менее 5%. Результаты выражают в виде % увеличения среднего значения по сравнению с таковым для контрольных животных.

Было установлено, что после орального введения каждое из тестированных соединений усиливает начальный инсулиновый ответ, что приводит к улучшению толерантности к глюкозе устойчивых к инсулину опытных животных. Были получены следующие результаты, приведенные в табл.2.

Точная доза агентов по изобретению, которую следует применять для лечения состояний, опосредуемых ингибированием ДПП-IV, зависит от нескольких факторов, в том числе от хозяина, природы и серьезности состояния, подлежащего лечению, метода введения и конкретно применяемого соединения. Однако в целом состояния, опосредуемые ингибированием ДПП-IV, можно эффективно лечить, если агент по изобретению вводят энтерально, например, орально, или парентерально, например, внутривенно, предпочтительно орально, в суточной дозе приблизительно от 0,002 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 0,02 мг/кг до приблизительно 2,5 мг/кг веса тела или, для большинства более крупных приматов, в суточной дозе приблизительно от 0,1 мг до приблизительно 250 мг, предпочтительно приблизительно от 1 мг до приблизительно 100 мг. Обычная стандартная доза для орального введения составляет приблизительно от 0,01 мг/кг до приблизительно 0,75 мг/кг и применяется от одного до трех раз в день. Как правило, сначала вводят небольшую дозу, а затем дозу постепенно повышают до тех пор, пока не определяют оптимальную дозу для хозяина, подлежащего лечению. Верхний предел определяется дозой, вызывающей побочные действия, и он может быть оценен с помощью опытов на хозяине, подлежащем лечению.

Агенты по изобретению могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с одним или несколькими другими общепринятыми фармацевтическими адъювантами и их можно вводить энтерально, например, орально, в форме таблеток, капсул, каплеток и т.д., или парентерально, например, внутривенно, в форме стерильных растворов или суспензий для инъекции. Композиции для энтерального или парентерального введения могут быть получены общепринятыми методами.

Агенты по изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции для энтерального или парентерального введения, содержащие активное вещество в количестве, эффективном для лечения состояний, опосредованных ДПП-IV, и такие композиции могут представлять собой стандартную дозируемую форму и могут включать фармацевтически приемлемый носитель.

Те агенты по изобретению, которые представляют собой, например, соединения формулы I, могут вводиться в форме чистого (S)-энантиомера (например, с чистотой ≥ 98%, предпочтительно с чистотой ≥ 99%) или вместе с другим энантиомером, например, в форме рацемической смеси. Вышеуказанные диапазоны доз указаны для соединений формулы I (без учета количества R-энантиомера).

Таким образом, объектом изобретения также является агент по изобретению, в частности соединение формулы I, как оно определено выше, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, предназначенный для применения в качестве фармацевтического препарата. Кроме того, объектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая агент по изобретению, в частности соединение формулы I, как оно определено выше, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли вместе по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, объектом изобретения является применение агента по изобретению, в частности соединения формулы I, как оно определено выше, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли для получения лекарственного средства для ингибирования ДПП-IV или лечения состояний, опосредованных ДПП-IV, способом, включающим смешение агента по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, в изобретении предлагается способ ингибирования ДПП-IV или лечения состояний, опосредованных ДПП-IV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению, в частности соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли.

Агенты из примеров 1, 3, 5, 8 и 12 являются предпочтительными агентами по изобретению, прежде всего агенты из примеров 1, 3, 5 и 12, предпочтительно в форме такой кислотно-аддитивной соли, как гидрохлорид, наиболее предпочтительным является агент из примера 3, а именно 1-[2-[(5-цианпиридин-2-ил) амино]этиламино] ацетил-2-циан-(S)- пирролидин, предпочтительно в форме кислотно-аддитивной соли, такой, как дигидрохлорид. Было установлено, что в форме гидрохлорида они имеют значения IC₅₀ по результатам анализа ДПП-IV с использованием линии клеток Сасо-2, равные соответственно 36, 22, 26, 8 и 279 нМ, а по результатам анализа с использованием вышеописанного модифицированного метода Kubota значения IС₅₀ для ДПП-IV в плазме человека и крысы соответственно составляют 27 и 22 нМ (пример 1), 7 и 6 нМ (пример 3), 37 и 18 нМ (пример 5), 12 и 11 нМ (пример 8), 95 и 38 нМ (пример 12). Следовательно, для вышеуказанных целей соединения из примеров 1, 3, 5, 8 и 12 могут вводиться крупным млекопитающим, например, человеку, с использованием таких же методов введения и примерно таких же доз, которые обычно применяются в случае использования метформина.

Пример фармацевтической композиции
Таблетки, каждая из которых содержит 50 мг активного ингредиента, например, 1-[2-[(5-хлорпиридин-2-ил)амино]этиламино]-2-циано-(S)-пирролидин, могут быть приготовлены следующим образом.

Состав (для 10000 таблеток), г:
Активный ингредиент - 500,0
Лактоза - 500,0
Картофельный крахмал - 352,0
Желатин - 8,0
Тальк - 60,0
Стеарат магния - 10,0
Диоксид кремния (высокодисперсный) - 20,0
Этанол - q.s. (достаточное количество)
Активный ингредиент смешивают с лактозой и 292 г картофельного крахмала, полученную смесь увлажняют спиртовым раствором желатина и гранулируют с помощью сита. После сушки добавляют оставшийся картофельный крахмал, тальк, стеарат магния и высокодисперсный диоксид кремния, смесь прессуют с получением таблеток весом 145,0 мг каждая при содержании активного ингредиента 50,0 мг. При необходимости на полученные таблетки могут быть нанесены разделительные надсечки для более точного регулирования дозы.

Формула изобретения

1. N-(N'-замещенный глицил)-2-цианопирролидин формулы I

где R обозначает: а) R₁R_1aN(CH₂)_m-, где R₁ обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой; R_1a обозначает водород или С₁-С₈алкил и m = 2 или 3, б) С₃-С₁₂циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃ гидроксиалкилом, в) R₂(CH₂)_n-, где либо R₂ обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга С₁-С₄алкоксигруппой, галогеном или фенилтиогруппой, необязательно однозамещенной в фенильном кольце гидроксиметилом; или обозначает C₁-С₈алкил, [3.1.1] бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный С₁-С₈алкилом, пиридинильный или нафтильный фрагмент, или циклогексенил, или адамантил и n = 1-3, либо R₂ обозначает феноксигруппу; и n = 2; г) (R₃)₂CH(CH₂)₂-, где каждый R₃ независимо обозначает фенил; д) R₄(CH₂)_p-, где R₄ обозначает 2-оксопирролидинил или С₂-С₄алкокси; и р = 2-4, е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃гидроксиалкилом, ж) R₅, который обозначает инданил, пиперидинильный фрагмент, необязательно замещенный бензилом, [2.2.1] - или [3.1.1] бициклический карбоциклический фрагмент, необязательно одно- или многозамещенный C₁-С₈алкилом, адамантил или C₁-С₈алкил, необязательно одно- или многозамещенный выбранными независимо друг от друга гидроксигруппой, гидроксиметилом или фенилом, необязательно одно- или двузамещенным выбранными независимо друг от друга С₁-С₄алкилом, С₁-С₄алкоксигруппой или галогеном;
в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

2. Соединение по п. 1 (соединение Iр), где R обозначает R^p, который обозначает а) R₁ ^pNH(CH₂)₂-, где R₁ ^p обозначает пиридинильный или пиримидинильный фрагмент, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, трифторметилом, циано- или нитрогруппой, б) С₃-С₇циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃гидроксиалкилом, в) R₂ ^p(СН²)₂-, где R₂ ^p обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном или C₁-С₃алкоксигруппой, г) (R₃ ^p)₂CH(CH₂)₂-, где каждый R₃ ^p независимо обозначает фенил, д) R₄(CH₂)₃-, где R₄ имеет указанные выше значения, или е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 C₁-С₃гидроксиалкилом, в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

3. Соединение по п. 1 (соединение Is), где R обозначает R^s, который обозначает а) R₁ ^sR_1a ^s(CH₂)_ms-, где R₁ ^s обозначает пиридинил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга хлором, трифторметилом, циано- или нитрогруппой, пиримидинил, необязательно однозамещенный хлором или трифторметилом, или фенил; R_1a ^s обозначает водород или метил; и ms = 2 или 3, б) С₃-С₁₂циклоалкил, необязательно однозамещенный в положении 1 гидроксиметилом, в) R₂ ^s(CH₂)_ns-, где либо R₂ ^s обозначает фенил, необязательно одно-, дву- или тризамещенный выбранными независимо друг от друга галогеном, алкоксигруппой, имеющей 1 или 2 атома углерода, или фенилтиогруппой, однозамещенной в фенильном кольце гидроксиметилом; С₁-С₆алкил; 6,6-диметилбицикло[3.1.1] гепт-2-ил; пиридинил; нафтил; циклогексенил; или адамантил, a ns = 1-3, либо R₂ ^s обозначает фенокси, а ns = 2, г) (3,3-дифенил)пропил, д) R₄ ^s(CH₂)_ps-, где R₄ ^s обозначает 2-оксопирролидин-1-ил или изопропокси и ps = 2 или 3, е) изопропил, необязательно однозамещенный в положении 1 гидроксиметилом, ж) R₅ ^s, который обозначает инданил, пиперидинильный фрагмент, необязательно N-замещенный бензилом; бицикло[2.2.1] гепт-2-ил, 2,6,6-триметилбицикло[3.1.1] гепт-3-ил, адамантил или С₁-С₈алкил, необязательно одно- или двузамещенный выбранными независимо друг от друга гидроксигруппой, гидроксиметилом или фенилом, в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

4. Соединение по п. 1, где R обозначает 2-[(5-цианпиридин-2-ил)амино] этил, а именно, 1-[2[(5-цианпиридин-2-ил)амино] этиламино] ацетил-2-циан-(S)-пирролидин, в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли, особенно предпочтительно в форме дигидрохлорида.

5. Соединение по п. 1, являющееся соединением формулы I, где R обозначает либо 2-[(5-хлорпиридин-2-ил)амино] этил, либо (1-гидроксиметил)циклопент-1-ил, либо 2-[(5-нитропиридин-2-ил)амино] этил, либо 3-(изопропокси)пропил, либо 1- или 2-адамантил, в свободной форме или в форме кислотно-аддитивной соли.

6. Фармацевтическая композиция для ингибирования ДПП-IV и для лечения состояний, опосредуемых ДПП-IV, в частности, для лечения сахарного диабета, не зависящего от инсулина, и состояний, обусловленных пониженной толерантностью к глюкозе (ПТГ), включающая фармацевтически эффективное количество соединения по пп. 1-5 в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли вместе по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11