Способ селективной амплификации, олигонуклеотид и набор для селективной амплификации

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации рестрикционных фрагментов ДНК. Из исходной ДНК получают рестрикционные фрагменты и лигируют их с двунитевым синтетическим адаптером. ПЦР-Амплификацию фрагментов рестрикции осуществляют с помощью праймеров длиной 10-50 нуклеотидов. Праймеры включают постоянные последовательности с нуклеотидами, комплементарными части адаптерной последовательности и части последовательности сайта рестрикции, и на 3'-конце 1-10 случайно выбранных нуклеотидов. Изобретение позволяет амплифицировать рестрикционные фрагменты ДНК с неопределенными 5'- и 3'-концами и идентифицировать их. 3 с. и 35 з.п. ф-лы, 18 ил.

Изобретение касается применений ДНК-фингерпринтинга и использования ДНК-маркеров в ряде различных областей, включая (не ограничиваясь) селекцию растений и животных, идентификацию сортов или культиваров, диагностическую медицину, диагностику заболеваний животных и растений, идентификацию генетически наследуемых заболеваний людей, анализ семейного родства, судебный анализ и микробное типирование.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к методам ДНК-фингерпринтинга и определения специфических ДНК-маркеров в геномах в диапазоне от микроорганизмов до высших растений, животных и людей. Изобретение также касается синтетических ДНК-молекул и продуктов на их основе, которые используются в методах предлагаемого изобретения в различных областях применения.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 2.1. ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг или ДНК-типирование, а также другие методы анализа генотипирования, профиля и идентификации ДНК касаются охарактеризования любых аналогий, либо одного или более отличительных признаков в организации генетического материала или генома индивидуума, сорта или породы, либо целого вида. Общее правило состоит в том, что чем ближе генетическое родство, тем выше идентичность или более подходящее сходство геномов, и следовательно, тем реже встречаются в геноме отличительные признаки. Эти сходные или отличительные признаки могут быть выявлены анализом ДНК организма после расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции. Эндонуклеазы рестрикции представляют собой ферменты, которые распознают короткие последовательности нуклеотидов, обычно длиной от 4 до 8 пар оснований, и расщепляют две нити ДНК, тем самым продуцируя фрагменты ДНК дискретной длины. Из-за своей высокой степени специфичности последовательностей эндонуклеазы рестрикции расщепляют молекулы ДНК весьма специфичным образом. В результате этого получается репродуцируемый набор ДНК-фрагментов. ДНК-фрагменты можно фракционировать в соответствии с их длиной на пористых матрицах или гелях с получением типичных характеров исчерченности, что составляет ДНК-фингерпринт организации генетического материала организма.

2.2. ДНК-полиморфизмы При сравнении фингерпринтов видов, сортов или пород, имеющих очень высокую степень родства, ДНК-фингерпринты могут быть идентичными или весьма сходными. Когда различия наблюдаются в пределах по-иному идентичных ДНК-фингерпринтов, такие различия называются ДНК-полиморфизмами: это новые ДНК-фрагменты, которые появляются в фингерпринте. В этом положении ДНК называют полиморфной, и новый ДНК-фрагмент может быть использован в качестве ДНК-маркера. ДНК-полиморфизмы, обнаруженные в ДНК-фингерпринтах, полученных расщеплением ферментами рестрикции, могут возникнуть в результате любой из числа следующих альтераций в ДНК-последовательности: мутаций, упраздняющих сайт-мишень рестрикционной эндонуклеазы, мутаций, создающих новые сайт-мишени, инсерций, делеций или инверсий между двумя сайтами рестрикции. Такие ДНК-полиморфизмы обычно упоминаются как RFLP, то есть Полиморфизмы (Длин) Рестрикционных Фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Эти мутационные изменения ведут себя как bona fide (добросовестные) генетические маркеры, когда они унаследованы менделевским образом. Следовательно, ДНК-полиморфизмы могут быть использованы в качестве генетических маркеров во многом таким же образом, что и другие генетические маркеры: в анализе родства, в генетических исследованиях по наследованию признаков, при идентификации индивидуумов.

2.3. Методики ДНК-фингерпринтинга В отношении почти всех живых организмов за исключением вирусов рестрикционные перевары полной геномной ДНК организмов приводят к созданию такого большого количества полос, что невозможно подсчитать отдельные полосы. Поэтому все методы ДНК-фингерпринтинга основаны на том принципе, что только небольшая часть ДНК-фрагментов поддается визуализации с тем, чтобы можно было создать простой характер исчерченности, составляющий ДНК-фингерпринт.

Наиболее широко используемый метод предусматривает переваривание ДНК организма рестрикционными эндонуклеазами, фракционирование рестрикционных фрагментов гель-электрофорезом, перенос и привязывание фракционированных ДНК-фрагментов на мембрану и гибридизацию мембран со специфическим ДНК-фрагментом ("зондом"). ДНК-фрагмент образует молекулы двунитевой ДНК с ДНК-фрагментом (или фрагментами) на мембране, который (которые) имеет (имеют) комплементарные нуклеотидные последовательности. Когда зонд помечен визуализируемым маркером, можно визуализировать ДНК-фрагмент, к которому присоединен зонд. Эту методику обычно называют "гибридизацией по Саузерну". Когда наблюдаются различия в размерах соответствующих рестрикционных фрагментов, к которым зонд присоединяется в близкородственных молекулах геномной ДНК, эти различия называют ДНК-полиморфизмами, более конкретно полиморфизмами длин рестрикционных фрагментов. Различия в длине рестрикционных фрагментов соответствуют разным аллельным формам генетического локуса, узнаваемого ДНК-зондом. Хотя метод гибридизации по Саузерну для ДНК-фингерпринтинга используется повсеместно, он представляет собой трудоемкий процесс и требует много времени.

Кроме того, метод имеет низкое разрешение и поэтому может быть использован лишь для подсчета единичных локусов или нескольких локусов, самое большее в единичной реакции.

2.4. Полимеразно-цепьевая реакция Методика полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) представляет собой метод, предназначенный для синтезирования in vitro специфических ДНК-фрагментов. Методика основана на использовании специфических олигонуклеотидов, которые присоединяются к уникальным последовательностям на молекуле ДНК и термостабильной ДНК-полимеразе. Олигонуклеотиды построены таким образом, чтобы они могли ренатурироваться с противоположными нитями ДНК и служить в качестве праймеров в реакции синтеза ДНК таким образом, чтобы каждый направлял синтез новых ДНК-нитей. Отсюда в одном раунде синтеза между праймерами образуется полная копия ДНК-молекулы так, что ДНК удваивается между праймерами. Каждый раунд ДНК-синтеза приводит к удваиванию количества ДНК, что приводит к амплификации ДНК, содержащейся между двумя праймерами. Следовательно, методика ПЦР позволяет синтезировать точный ДНК-сегмент, используя небольшое количество "субстрактной ДНК".

3. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ В предлагаемом изобретений использован новый способ амплификации с помощью метода ПЦР рестрикционных фрагментов, полученных после расщепления ДНК организма по крайней мере одним рестрикционным ферментом. В этом новом применении метода ПЦР используемые олигонуклеатиды не направлены против известной ДНК последовательности, а сконструированы так, чтобы они распознавали концы рестрикционных фрагментов. Для этой цели необходимо модифицировать концы рестрикционных фрагментов путем добавления к концам олигонуклеотидных линкеров (или адаптеров). Причиной этого является то, что концы рестрикционных фрагментов имеют только несколько нуклеотидов, то есть от 2 до 8 нуклеотидов, что слишком мало для использовании при построении праймеров для ПЦР-амплификации.

Предлагаемое изобретение основано на использовании нового применения методики полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) для амплификации одного или более рестрикционных фрагментов из комплексных смесей ДНК-фрагментов, полученных перевариванием молекул геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Одно конкретное преимущество предлагаемого технического решения заключается в осуществлении амплификации рестрикционных фрагментов ДНК в ситуациях, когда не определена нуклеотидная последовательность 5'- и 3'-концов рестрикционных фрагментов. В таких случаях нельзя определить обычные последовательность-специфичные праймеры, гибридизирующиеся к каждой нити рестрикционного фрагмента, подлежащей амплификации, и поэтому нельзя использовать методы, известные в данной области техники, с целью амплификации.

Метод предлагаемого технического решения может быть использован, например, двумя различными способами, приводящими к двум различным типам применений: (1) Методам ДНК-фингерпринтинга геномов путем произвольного отбора субпопуляций одного или более рестрикционных фрагментов, подлежащих амплификации с помощью методики ПЦР. Изобретение также охватывает синтетические олигонуклеотиды для использования в указанных методах, и некоторыми применениями указанных методов могут быть судебное типирование, микробная идентификация, сортовая идентификация, родословный (педигри) анализ и скрининг ДНК-маркеров, связанных с генетическими признаками; (2) Методам идентификации одного или более предварительно отобраных ДНК-фрагментов, которые могут быть полиморфными, с помощью ПЦР-амплификации. Изобретение также охватывает специфические синтетические олигонуклеотиды для использования в указанных методах, и некоторыми применениями указанных методов могут быть скрининг генетически наследуемых заболеваний у людей, контроль за наследованием агрономических признаков при селекции растений и животных, а также обнаружение возбудителей заражения при заболеваниях.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1 представляет собой графическое изображение общего метода ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов, полученных перевариванием молекул геномной ДНК рестрикционным ферментом.

Фиг. 2 изображает лигирование адаптеров к разным концам рестрикционных фрагментов: одноуровневым концам и ступенчатым концам.

Фиг. 3 изображает ПЦР-амплификацию меченых рестрикционных фрагментов. Блочные участки изображают адаптеры, которые лигируют к рестрикционному фрагменту, и праймеры, которые используют при ПЦР-амплификации. Стрелки указывают направление синтеза ДНК.

Фиг. 4 представляет собой графическое изображение ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов.

Фиг. 5 показывает общую картину селективных праймеров, используемых при ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов. Селективность праймеров проиллюстрирована на двух примерах, где имеют место соответственно совершенная совместимость и полная несовместимость между селективной последовательностью оснований и той же последовательностью матричной ДНК рестрикционных фрагментов.

Фиг. 6 показывает принцип селективной ПЦР-амплификации с использованием ПЦР-праймера, который отбирает молекулы матричной ДНК, имеющие тринуклеотидную последовательность, смежную с последовательностью адаптера.

Фиг. 7 изображает селективную ПЦР-амплификацию меченых рестрикционных фрагментов.

Фиг. 8 показывает принцип фрагмент-специфической амплификации с использованием комбинации двух ПЦР-праймеров, каждый из которых содержит шесть селективных пар. Каждый праймер образует двунитевую структуру в каждой нити рестрикционного фрагмента, тем самым образуя праймерно-матричный комплекс, из которого может быть инициирован синтез ДНК (представлен стрелками).

Фиг.9 изображает общие элементы последовательности, которые распознаются методом селективной амплификации рестрикционных фрагментов, включающие две нуклеотидные последовательности, которые узнаны, и дистанцию, разделяющую две последовательности.

Фиг. 10 изображает типы вариантов нуклеотидных последовательностей, которые обнаруживают в методе идентификации полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов.

Фиг. 11 показывает 1,0% агарозный гель с анализом результатов амплификации ДНК томатов, рестрицированной с помощью PstI при использовании праймеров повышенной селективности.

Фиг. 12 показывает 1,0% агарозный гель с анализом результатов специфической амплификации трех разных фрагментов PstI ДНК томатов с использованием фрагмент-специфических праймеров.

Фиг.13 показывает 2,5% полиакриламидный/1,0% агарозный гель с ДНК-фингерпринтами, полученными селективной амплификацией рестрикционных фрагментов (SRFA) двух линий томатов.

Фиг. 14 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами четырех линий томатов с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/MseI.

Фиг. 15 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами десяти линий Lactuca с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/MseI.

Фиг. 16 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами двух линий кукурузы с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/TagI и EcoRI/TagI.

Фиг. 17 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами с 26 штаммов Xanthomonas campestris с использованием SRFA с комбинацией ферментов ApaI/TagI.

Фиг. 18 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами различных индивидуумов четырех домашних животных: цыпленка, свиньи, коровы и лошади с использованием SRFA с комбинацией ферментов SseI/MseI.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
5.1 Определения
В описании изобретения и последующих примерах используется ряд терминов.

Для получения ясного представления об описании и формуле изобретения приведены следующие определения.

- Рестрикционные Эндонуклеазы: рестрикционная эндонуклеаза или рестрикционный фермент представляет собой фермент, который распознает специфическую последовательность оснований (сайт-мишень) в молекуле двунитевой ДНК и расщепляет обе нити ДНК-молекулы в каждом сайте-мишени.

- Рестрикционные Фрагменты: молекулы ДНК, полученные перевариванием рестрикционными эндонуклеазами, называются рестрикционными фрагментами. Любой данный геном переваривается определенной рестрикционной эндонуклеазой в дискретный набор рестрикционных фрагментов. ДНК-фрагменты, полученные в результате расщепления рестрикционными эндонуклеазами, разделяют и определяют гель-электрофорезом.

- Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов (RFLP): геномные ДНК двух родственных организмов, например, проявляют различия в составе их нуклеотидных последовательностей во многих сайтах. Когда эти различия встречаются в сайте-мишени для рестрикционной эндонуклеазы, модифицированный сайт-мишень в данный момент не расщепляется. Аналогичным образом вариация последовательностей нуклеотидов может вводить новый сайт-мишень, когда не существует в другом организме, вызывая в этот момент разрезание ДНК рестрикционным ферментом. Альтернативно инсерции или делеции нуклеотидов, встречающиеся в одном организме между двумя сайтами-мишенями для рестрикционной эндонуклеазы, модифицируют расстояние между этими сайтами-мишенями. Вследствие этого переваривание ДНК двух организмов приводит к получению фрагментов разной длины. В результате возникает полиморфизм в длине рестрикционных фрагментов, полученных перевариванием ДНК двух организмов.

- Гель-Электрофорез: для определения рестрикционных фрагментов требуется аналитический метод фракционирования двунитивых молекул ДНК на основе размера. Наиболее широко используемым методом достижения такого фракционирования является электрофорез в гелях. Скорость, с которой фрагменты ДНК движутся в таких гелях, зависит от их размера; так, пройденные расстояния уменьшаются по мере увеличения длины фрагментов. ДНК-фрагменты, фракционированные гель-электрофорезом, можно визуализировать непосредственно с помощью метода окрашивания, если незначительно число фрагментов, включенных в структуру.

- Синтетические Олигонуклеотиды: однонитевые молекулы ДНК, имеющие предпочтительно около 10-50 оснований, которые можно синтезировать химически, называются синтетическими олигонуклеотидами. Вообще эти синтетические ДНК-молекулы строят таким образом, чтобы они имели уникальную последовательность нуклеотидов, хотя можно синтезировать семейства молекул, имеющих родственные последовательности и различные композиции нуклеотидов в специфических положениях в пределах нуклеотидной последовательности. Термин синтетический олигонуклеотид будет использован в отношении ДНК-молекул, имеющих уникальную нуклеотидную последовательность. Термин "смешанные синтетические нуклеотиды" будет использован в отношении семейств родственных синтетических олигонуклеотидов.

- Лигирование: ферментативная реакция, катализируемая ферментом лигаза, когда две двунитевые молекулы ДНК ковалентно связаны одна с другой, называется лигированием. Вообще-то обе нити ДНК ковалентно связаны одна с другой, однако также можно предотвратить лигирование одной из двух нитей путем химической или ферментативной модификации одного из концов. В этом случае ковалентное связывание будет происходить только в одной из двух нитей ДНК.

- Адаптеры: короткие двунитевые молекулы ДНК с ограниченным числом пар оснований, например, длиной от 10 до 30 пар оснований, которые построены таким образом, чтобы их можно было лигировать к концам рестрикционных фрагментов. Адаптеры выполнены из двух синтетических олигонуклеотидов, которые имеют нуклеотидные последовательности, частично комплементарные друг другу. При смешивании двух синтетических олигонуклеотидов они образуют двунитевую структуру в растворе при соответствующих условиях. Один из концов молекулы адаптера построен таким образом, чтобы его можно было лигировать к концу рестрикционного фрагмента, тогда как другой конец построен без возможности быть лигированным.

- Полимеразно-Цепьевая Реакция (ПЦР): ферментативная реакция, в которой фрагменты ДНК синтезируют in vitro из субстратной ДНК, называется ПЦР. Реакция предусматривает использование двух синтетических олигонуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидным последовательностям в молекуле ДНК, разделенным коротким расстояниям от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, и использование термостабильной ДНК-полимеразы. Реакция цепи состоит, например, из ряда 10-30 циклов. В каждом цикле субстратную ДНК вначале денатурируют при высокой температуре. После охлаждения синтетические олигонуклеотиды, присутствующие в большом избытке, образуют двунитевые структуры с молекулами субстратной ДНК в растворе в специфических сайтах на молекуле субстратной ДНК, которая имеет комплементарные нуклеотидные последовательности. Комплексы олигонуклеотидов субстратной ДНК затем служат в качестве инициирующих сайтов для реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНК-полимеразой, которая приводит к получению новой нити ДНК, комплементарной нити субстратной ДНК.

- ДНК-Амплификация: термин ДНК-амплификация будет использован для обозначения синтеза in vitro двунитевых молекул ДНК с использованием Полимеразно-Цепьевой Реакции (ПЦР). Продукты реакции ПЦР будут называться амплифицированными ДНК-фрагментами.

- Праймеры: вообще термин праймер относится к нити ДНК, которая может примировать синтез ДНК. ДНК-полимераза не может синтезировать de novo ДНК без праймеров: они могут лишь удлинять существующую нить ДНК в реакции, в которой комплементарную нить используют в качестве матрицы для того, чтобы руководить порядком нуклеотидов, подлежащих сборке. В данном описании праймерами называются молекулы синтетических олигонуклеотидов, которые используются в реакции ПЦР.

- Методика Саузерн-Гибридизации: целью методики Саузерн-гибридизации, упоминаемой также как Саузерн-блоттинг, является физический перенос ДНК, фракционированной агарозным гель-электрофорезом, на такой носитель, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра, с одновременным удержанием относительных положений ДНК-фрагментов, которые получены в результате фракционирования. Методология, используемая для выполнения переноса из агарозного геля на носитель, заключается в том, чтобы вытянуть ДНК из геля на носитель путем капиллярного действия.

- Нуклеиновокислотная Гибридизация: нуклеиновокислотную гибридизацию используют для обнаружения родственных ДНК-последовательностей путем гибридизации однонитевой ДНК на таких носителях, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра. Молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют комплементарные пары оснований, реформируют двунитевую структуру, если смешаны в растворе при надлежащих условиях. Двунитевая структура образуется между двумя комплементарными однонитевыми нуклеиновыми кислотами, даже если одна иммобилизирована на носителе. В методике Саузерн-гибридизации встречается последняя ситуация.

- Гибридизационный зонд: для обнаружения конкретной ДНК-последовательности в методике Саузерн-гибридизации меченая молекула ДНК или гибридизационный зонд подвергается взаимодействию с фракционированной ДНК, привязанной к такому носителю, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра. Участки на фильтре, которые несут ДНК-последовательности, комплементарные меченому ДНК-зонду, сами становятся мечеными в результате реакции повторного отжига. Гибридизационный зонд получают, как правило, молекулярным клонированием специфической формы ДНК-последовательности генома кукурузы.

5.2. Описание предпочтительных вариантов изобретения
Настоящее изобретение относится более конкретно к способу и средствам, позволяющим применять полимеразно-цепьевую реакцию (ПЦР) для определения полиморфизмов рестрикционных фрагментов (RFP), включая полиморфизмы длин. Настоящее изобретение включает методы определения RFP, синтетические олигонуклеотиды для использования в методах изобретения, наборы, содержащие средства определения RFP, и применения способов и методик изобретения для селекции растений и животных, диагностики генетически наследуемых заболеваний, идентификации организмов, а также судебного типирования и т.д.

В частности, настоящее изобретение предлагает способы идентификации или отдельных геномных рестрикционных фрагментов, или наборов геномных рестрикционных фрагментов из любых организмов, микроорганизмов, растений, животных или человека, которые в отдельности генетически связаны с одним или более конкретными признаками или которые сообща создают фингерпринт генома, который может быть использован для идентификации организма, вариетета либо индивидуума.

Общий метод в соответствии с изобретением для получения и идентификации рестрикционных фрагментов предусматривает использование рестрикционных эндонуклеаз, лигирование синтетических олигонуклеотидов к рестрикционным фрагментам и ПЦР-амплификацию рестрикционных фрагментов (Фиг.1). Рестрикционные эндонуклеазы расщепляют молекулы геномной ДНК в специфических сайтах, сайтах-мишенях, тем самым генерируя рестрикционные фрагменты.

ПЦР-амплификацию рестрикционных фрагментов, неважно, известна или не известна нуклеотидная последовательность концов рестрикционных фрагментов, можно осуществить в соответствии с изобретением путем первоначального лигирования синтетических олигонуклеотидов (адаптеров) к концам рестрикционных фрагментов, получая тем самым рестрикционный фрагмент с двумя общими метками, которые служат в качестве якорного основания для праймеров, используемых при ПЦР-амплификации.

Обычно рестрикционные ферменты продуцируют или одноуровневые концы, в которых терминальные нуклеотиды обеих нитей спарены в основаниях, или ступенчатые концы, в которых одна из двух нитей выступает с образованием короткого однонитевого удлиняющего сегмента (Фиг.2). В случае если рестрикционные фрагменты имеют одноуровневые концы, адаптеры используются также с одноуровневым концом. В случае если рестрикционные фрагменты имеют ступенчатые концы, используют адаптеры, которые имеют однонитевый удлиняющий сегмент, комплементарный однонитевому удлиняющему сегменту рестрикционного фрагмента. Следовательно, для каждого типа рестрикционного фрагмента используются специфические адаптеры, которые отличаются только в одном из концов так, чтобы адаптер можно было лигировать к рестрикционному фрагменту. Обычно используемые адаптеры состоят из двух синтетических олигонуклеотидов, которые частично комплементарны друг другу и, как правило, имеют приблизительно 10-30 нуклеотидов в длину, предпочтительно 12-22 нуклеотидов, и которые образуют двунитевые структуры, когда смешаны в растворе. При использовании фермента лигаза адаптеры лигируют к смеси рестрикционных фрагментов. При использовании большого молярного избытка адаптеров по сравнению с рестрикционными ферментами гарантируется то, что все рестрикционные фрагменты, полученные с помощью данного метода, называют мечеными рестрикционными фрагментами, а метод называется мечением рестрикционных фрагментов.

Теперь адаптеры могут служить в качестве матриц для праймеров, имеющих определенные выше характеристики, которые применяются в последующей реакции ПЦР-амплификации. В предпочтительном варианте изобретения рестрикционный фрагмент, несущий тот же адаптер с обоих концов и один ПЦР-праймер, может быть использован для амплификации рестрикционного фрагмента, как показано на Фиг.3. Поскольку в таком случае все рестрикционные фрагменты метят одинаковым путем, очевидно, что ПЦР-амплификация смеси меченых рестрикционных фрагментов приведет к амплификации всех рестрикционных фрагментов синхронным образом. В другом варианте с использованием двух разных рестрикционных ферментов для расщепления ДНК два разных адаптера лигируют к концам рестрикционного фрагмента. В этом случае два разных ПЦР-праймера можно использовать для амплификации таких рестрикционных фрагментов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения с использованием двух рестрикционных ферментов адаптер для одного из ферментов биотинилируют. Это позволяет отобрать в комплексной смеси рестрикционных фрагментов те рестрикционные фрагменты, которые несут по крайней мере один конец для такого рестрикционного фермента, с использованием обычных методов выделения биотинилированных молекул. Эта стадия снижает сложность исходной смеси рестрикционных фрагментов и порождает следующую стадию обогащения перед ПЦР-амплификацией, тем самым снижая в некоторых случаях фон. Одновременную амплификацию нескольких различных фрагментов часто называют множественной ПЦР.

Принцип множественной амплификации рестрикционных фрагментов проиллюстрирован на Фиг.4.

Настоящее изобретение также основано на определении специфически построенных праймеров и специфических методах направления реакции ПЦР-амплификации таким образом, чтобы существовала возможность проведения управляемой амплификации, а в особом варианте изобретения таким путем, чтобы можно было амплифицировать лишь малую субпопуляцию меченых рестрикционных фрагментов.

Вообще-то перевары геномной ДНК рестрикционной эндонуклеазой, в частности животной, растительной и человеческой геномной ДНК, приводят к получению очень больших количеств рестрикционных фрагментов. Число рестрикционных фрагментов зависит от размера генома и частоты встречаемости сайта-мишени рестрикционной эндонуклеазы в геноме, что в свою очередь определяется, главным образом, числом нуклеотидов в сайте-мишени. Число нуклеотидов в сайтах-мишенях традиционно используемых рестрикционных эндонуклеаз варьируется от 4 до 8. Размеры генома организмов варьируются в широких пределах от нескольких миллионов пар оснований в случае микроорганизмов до несколько миллиардов пар оснований в случае животных и растений. Отсюда число рестрикционных фрагментов, полученных после расщепления молекул геномной ДНК рестрикционным ферментом, может варьироваться от нескольких сотен до нескольких миллионов. Как правило, число рестрикционных фрагментов так высоко, что невозможно идентифицировать отдельные рестрикционные фрагменты в переварах геномной ДНК, фракционированных с помощью гель-электрофореза. Такие перевары обычно продуцируют пятно полос.

ПЦР-амплификация меченых рестрикционных фрагментов, таким образом, также должна продуцировать пятно полос, поскольку все фрагменты должны совместно амплифицироваться синхронно в ПЦР-реакции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применительно к геномным ДНК больших размеров заявитель использовал общий принцип ограничения числа рестрикционных фрагментов, подлежащих амплификации. Это сделано за счет предварительного отбора субпопуляции меченых рестрикционных фрагментов так, чтобы во время реакции ПЦР-амплификации амплифицировалось лишь относительно небольшое количество меченых рестрикционных фрагментов.

Селективный принцип, определенный в этом варианте изобретения, состоит в конструировании олигонуклеотидов, которые используются в качестве праймеров для ПЦР-амплификации, как показано на Фиг.5.

Меченые рестрикционные фрагменты имеют общую структуру в следующем виде: вариабельную ДНК-последовательность (соответствующую рестрикционному фрагменту перед мечением), фланкированную с обеих сторон инвертированной ДНК-последовательностью (константной последовательностью). Инвертированная ДНК-последовательность (константная ДНК-последовательность) состоит из части последовательности-мишени рестрикционной эндонуклеазы и последовательности адаптера, присоединенной к обоим концам рестрикционного фрагмента. Вариабельные последовательности рестрикционных фрагментов, содержащиеся между константными ДНК-последовательностями, обычно неизвестны и поэтому имеют хаотический состав последовательности, фланкирующие константную ДНК-последовательность, являются полностью разупорядоченными в большой смеси рестрикционных фрагментов.

Настоящее изобретение поэтому также предлагает специфические ПЦР-праймеры, которые содержат часть нуклеотидной последовательности, а в варианте изобретения, относящемся к амплификации ограниченной субпопуляции полученных рестрикционных фрагментов, содержит часть вариабельной последовательности. В части константной последовательности нуклеотидная последовательность построена таким образом, чтобы праймер надлежащим образом создавал пары оснований с константной последовательностью ДНК одной из нитей ДНК у конца рестрикционного фрагмента. Часть вариабельной последовательности содержит выбранную наугад нуклеотидную последовательность, имеющую от 1 до 10 отобранных оснований.

Выражение "вариабельная последовательность" более точно означает последовательность, состоящую из отобранных нуклеотидов, образующих последовательность, которая затем остается константной для целей амплификации субпопуляций рестрикционных фрагментов. В конкретном варианте настоящего изобретения можно использовать несколько последовательностей выбранных оснований с тем, чтобы определить несколько различных праймеров. В таком случае праймеры могут иметь одну и ту же константную последовательность и вариабельные последовательности, выполненные из отобранных оснований, которые разные у образованных таким образом праймеров.

Именно добавление этих вариабельных (отобранных) последовательностей к 3'-концу праймеров руководит предварительным отбором меченых рестрикционных фрагментов, которые будут амплифицированы на стадии ПЦР: при осуществлении реакции ПЦР в соответствующих условиях праймеры только инициируют ДНК-синтез на тех меченых рестрикционных фрагментах, в которых вариабельная ДНК-последовательность создает надлежащим образом пары оснований с матричной нитью меченого рестрикционного фрагмента, как показано на Фиг.5.

Отбор определяется числом нуклеотидных остатков в части вариабельной последовательности праймера: селективность праймеров возрастает с числом нуклеотидов в части вариабельной (отобранной) последовательности. Заявитель также использует термин "селективные основания" для обозначения нуклеотидов в части вариабельной последовательности, показывая тем самым, что отбор этих оснований придает селективцость праймеру. Следует понять, что меченый рестрикционный фрагмент будет амплифицирован лишь в том случае, когда селективные основания праймеров узнают обе комплементарные последовательности у концов фрагмента. В случае если праймер совмещается только с одним концом, амплификация становится линейной, а не экспоненциальной и продукт остается необнаруженным.

Существует возможность предварительной оценки степени селективности, полученной при использовании вариабельных последовательностей с различным количеством селективных оснований, за счет использования общей формулы 4²ⁿ, где n равно количеству селективных оснований: с использованием 1 селективного основания можно амплифицировать один из 16 меченых фрагментов; с использованием 2 селективных оснований можно амплифицировать один из 256 меченых фрагментов; с использованием 3 селективных оснований можно амплифицировать один из 4096 меченых фрагментов; с использованием 4 селективных оснований можно амплифицировать один из 65536 меченых фрагментов и так далее. Один предпочтительный вариант настоящего изобретения позволяет, таким образом, селективно амплифицировать разупорядоченную субпопуляцию меченых рестрикционных фрагментов из любого перевара геномной ДНК независимо от числа фрагментов, продуцированных с использованием рестрикционного фермента. В предпочтительном варианте число селективных нуклеотидов выбирают таким образом, чтобы количество амплифицируемых рестрикционных фрагментов было ограничено пределом от 5 до 200. Хотя это количество можно вычислить путем деления числа фрагментов на 4²ⁿ, точный прогноз невозможен, так как не все рестрикционные фрагменты могут быть амплифицированы с равной эффективностью. Поэтому на практике можно найти меньше фрагментов амплификации, чем ожидается теоретически. Следует также отметить, что можно использовать смеси двух (или более) праймеров. Это позволяет осуществить амплификацию фрагментов, распознаваемых каждым праймером и, кроме того, фрагментов, распознаваемых двумя праймерами. Наконец, следует отметить, что отбор на основе спаривания оснований между двумя селективными нуклеотидами праймера и комплементарной матрицей подвержен большому влиянию температуры, выбранной для стадии ренатурации в ПЦР-реакции. Когда эта температура находится ниже или близка к температуре плавления праймерно-матричного комплекса, праймеры ренатурируют несовершенно спаренные темплатные последовательности, вызывая в комплексе ошибочное спаривание. Этого следует избегать, так как может произойти амплификация намного большего числа фрагментов, нежели предсказано, что приводит к вариабельным результатам.

ПЦР-продукты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов фракционирования для выделения ДНК-молекул в соответствии с размером с последующим окрашиванием ДНК-молекул при помощи пригодных агентов. Альтернативно праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, могут быть помечены пригодным радиоактивным или флуоресцентным хромофором, что позволяет идентифицировать продукты реакции после фракционирования по размерам. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ПЦР-продукты фракционируют гель-электрофорезом с использованием стандартных гельных матриц, таких как, например, агарозная, полиакриламидная или смешанная агарозно/полиакриламидная. ПЦР-продукты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, далее будут обозначены термином Амплифицированные Рестрикционные Фрагменты (ARF).

Средства и метод настоящего изобретения могут быть использованы для создания наборов ARF в результате рестрикционных переваров любого сложного генома. Предлагаемое изобретение позволяет настроить ряд полученных рестрикционных фрагментов в соответствии с разрешающей способностью системы гель-фракционирования, используемой для выделения ARF. В одном предпочтительном варианте селективные праймеры конструируют для получения от 5 до 10 ARF, которые впоследствии разделяют агарозным гель-электрофорезом. Другой предпочтительный вариант изобретения включает использование селективных праймеров, которые конструируют для получения от 20 до 50 ARF, которые разделяют впоследствии на системе гель-электрофореза высокого разрешения, например на полиакриламидных гелях или смешаных полиакриламидно-агарозных гелях.

В одном предпочтительном варианте предлагаемого изобретения рестрикционный фермент или ферменты выбирают с получением рестрикционных фрагментов в диапазоне размера от 20 до 1000 пар оснований, поскольку, как это хорошо известно для ПЦР-амплификациии, фрагменты с такими размерами амплифицируются наиболее эффективно. Хотя многие фрагменты могут быть амплифицированы на различных стандартных гельных матрицах, наилучшие результаты получаются при фракционировании на системах денатурирующих полиакриламидных гелей, которые в настоящее время используются для секвенирования ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением в реакции ПЦР-амплификации получают различные наборы ARF с каждым отличающимся селективным праймером. Характеры ARF, идентифицированные после разделения, составляют уникальные и совершенно репродуцируемые фингерпринты геномной ДНК.

Такие фингерпринты могут иметь несколько применений, например в судебном типировании, при диагностической идентификации организмов и при идентификации видов, пород, вариететов или индивидуумов. Уровень идентификации определяется степенью сходности (степенью вариабельности), проявляемой различными членами конкретной группы. Вариабельность или сходность определяется степенью вариации в нуклеотидном составе родственных геномов. Решающим принципом настоящего изобретения является то, что в каждом амплифицированном рестрикционном фрагменте обнаруживают две нуклеотидные последовательности, которые отделяются друг от друга определенным расстоянием, как показано на Фиг. 9. Каждая из двух нуклеотидных последовательностей состоит из двух частей: (а) сайта-мишени для рестрикционной эндонуклеазы и (б) нуклеотидной последовательности, смежной с сайтом-мишенью, который включен в селективный праймер. В родственных организмах, видах, вариететах, породах или индивидуумах такие элементы последовательности и их относительные расстояния сохраняются в большей или меньшей степени. Поэтому фингерпринты составляют основу для определения степени родственности последовательностей между геномами. С другой стороны, различия в ARF характерах могут быть использованы для нахождения различий между геномами. Особенным преимуществом настоящего изобретения перед другими методами фингерпринтинга геномов является высокая разрешающая способность, которая может быть достигнута при использовании предлагаемого метода: одновременно можно сравнивать несколько десятков или даже сотен ARF.

Другое конкретное применение настоящего изобретения заключается в скрининге и идентификации полиморфизмов рестрикционных фрагментов (RFP). Изменения в нуклеотидном составе геномной ДНК часто приводят к полиморфизмам рестрикционных фрагментов: инсерции или делеции влияют на размер содержащего их рестрикционного фрагмента (Фиг.10), нуклеотидные изменения могут привести к элиминированию сайтов-мишеней эндонуклеазы или созданию новых сайтов-мишеней для стрикционных эндонуклеаз (Фиг.11). Наиболее широко используемыми методиками идентификации таких изменений являются эксперименты Саузерн-блоттинг-анализа с использованием клонированных ДНК-зондов, методика, которую обычно называют обнаружением полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP). Эта методика предполагает экстенсивный скрининг разноупорядоченно клонированных фрагментов ДНК в экспериментах Саузерн-блоттинга на ассоциированные RFLP среди различных геномов. В соответствии с методом настоящего изобретения RFP могут быть идентифицированы непосредственно путем сравнения ARF, полученных из различных геномов. В принципе метод настоящего изобретения является более чувствительным для определения RFLP, поскольку определяются не только различия в сайтах мишенях, но также и различия в смежных нуклеотидных последовательностях, содержащихся в селективных ПЦР-праймерах. Следовательно, метод настоящего изобретения составляет намного более лучший способ обнаружения RFLP.

RFLP используются в настоящее время в нескольких областях, включая судебное типирование, мониторинг генетически наследуемых заболеваний у людей, а также мониторинг наследования агрономических признаков при селекции растений и животных. Отличительным признаком является то, что определенные ДНК-полиморфизмы, тесно связанные со специфическими генетическими признаками, могут быть использованы для контроля за присутствием или отсутствием специфических генетических признаков. В соответствии с методом настоящего изобретения анализ характеров ARF может быть использован для определения генетической связи полиморфных ARF co специфическими генетическими признаками- Такие полиморфные ARF далее будут упоминаться как Полиморфизмы Длин Амплифицированных Фрагментов (AFLP) для проведения различия между полиморфизмами ДНК типа RFLP, обнаруживаемыми в экспериментах Саузерн-блоттинга с использованием клонированных ДНК-зондов.

Одно конкретное применение настоящего изобретения заключается в обнаружении AFLP, связанных со специфическими генетическими признаками.

Данное применение предусматривает анализ характеров ARF, полученных с различными селективными праймерами при рестрикционных переварах геномной ДНК родственных индивидуумов, проявляющих различия в специфическом генетическом признаке, и использование методов анализа, которые могут найти корреляции между наследованием одного или более AFLP и фенотипом, проявляемым специфическими генетическими признаками.

Второй предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения состоит в использовании метода изобретения с целью идентификации одного или большего количества специфических рестрикционных фрагментов. Один специфический рестрикционный фрагмент может быть амплифицирован из комплексной смеси меченых рестрикционных фрагментов путем определения нуклеотидной последовательности первых 8-12 оснований у каждого конца рестрикционного фрагмента. На основе этих последовательностей можно построить два праймера, каждый с 5-10 селективными нуклеотидами, проявляющими последовательность, комплементарную последовательности, которая фланкирует рестрикционный сайт комплементарной нити рестрикционного фрагмента. С использованием таких наборов праймеров можно получить после ПЦР-амплификации один амплифицированный фрагмент. Рестрикционный фрагмент, используемый в этом методе, может быть или клонированным рестрикционным фрагментом, или амплифицированным рестрикционным фрагментом. Так как нельзя эффективно амплифицировать много рестрикционных фрагментов, предпочтительный метод изобретения для идентификации маркеров полиморфной ДНК предусматривает амплификацию наугад выбранного набора фрагментов и идентификацию AFLP, которые продуцируют сильные полосы после ПЦР-амплификации. Эти AFLP могут быть охарактеризованы секвенированием с целью генерации специфических праймеров рестрикционных фрагментов. Обычно AFLP выделяют путем отрезания соответствующей ДНК-нити от геля и определения нуклеотидных последовательностей у обоих концов с тем, чтобы установить последовательность первых 5-10 нуклеотидов, смежных с сайтами-мишенями для рестрикционных эндонуклеаз. После того как эти нуклеотидцые последовательности стали известны, можно построить специфические праймеры рестрикционных фрагментов, которые амплифицируют только лишь один рестрикционный фрагмент из перевара геномной ДНК. В этом конкретном варианте изобретения для определения специфического рестрикционного фрагмента можно использовать один набор из двух разных селективных праймеров. В каждом из этих двух селективных праймеров одного набора селективные основания выбирают таким образом, чтобы они были комплементарны нуклеотидной последовательности, смежной с сайтом-мишенью для рестрикционной эндонуклеазы, как показано на Фиг.8. Число селективных оснований, включаемое в каждый праймер, зависит от сложности смеси фрагментов рестрикционной эндонуклеазы.

Методика полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) получила огромное развитие в последние несколько лет и быстро становится одним из наиболее широко используемых диагностических методов в области здравоохранения человека. Ее применение включает, среди других, обнаружение инфекционных заболеваний и определение генетически наследуемых заболеваний. Каждый диагностический тест основан на применении двух специфических синтетических олигонуклеотидов, которые используются в качестве праймеров в ПЦР-реакции для получения одного или более фрагментов ДНК определенной длины. При обнаружении заболевания данный тест направлен на выявление присутствия только одной молекулы ДНК в пробе с получением характерного ДНК-фрагмента. В случае генетически наследуемых заболеваний праймеры строятся таким образом, чтобы их продукты смогли отличать нормальные аллели от болезненных. Различие заключается либо в различиях последовательностей в ДНК-сегменте в геноме, который комплементарен праймеру, либо в различиях расстояний между двумя праймерами.

Поскольку праймеры проявляют крайне высокую степень специфичности, существует возможность контролировать различные заболевания одновременно, и этот метод часто называют множественной ПЦР. Однако метод множественной ПЦР страдает ограниченностью в том смысле, что позволяет контролировать только несколько, от 5 до 8, различных признаков одновременно. Научной основой такой ограниченности является то, что оптимальные условия для осуществления ПЦР-амплификации (температура ренатурации, концентрация Mg+, концентрация праймера) значительно варьируются в зависимости от пары используемых праймеров. При проведении множественной ПЦР необходимо устанавливать компромисные условия, при которых все праймерные пары приводят к получению обнаруживаемых продуктов. Кроме того, на это явление накладывает отпечаток другое явление, которое состоит в сильном различии в эффективности амплификации разных фрагментов. Следовательно, специалист часто сталкивается с такой проблемой, что продукты некоторых праймерных пар не обнаруживаются при проведении множественных ПЦР-реакций.

Методы настоящего изобретения существенным образом устраняют вышеприведенные ограниченности множественных ПЦР, поскольку все праймеры, используемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют значительную часть их нуклеотидной последовательности, общую для всех. Кроме того, путем отбора AFLP можно отобрать ДНК-маркеры, которые амплифицируются с равной эффективностью. Следовательно, наиболее благоприятные условия ПЦР-амплификации для различных селективных праймеров обусловливают намного меньшую вариацию, нежели та, которая наблюдается с использованием традиционных праймеров, специфичных к последовательностям. В сущности это и есть идеальный компромисс между числом оснований в синтетическом олигонуклеотиде, которое необходимо для получения требуемой специфичности обнаружения одного ДНК-фрагмента определенного размера в сложном геноме, и длиной и составом олигонуклеотида, являющимся оптимальным для эффективной ПЦР-амплификации. Таким образом, метод настоящего изобретения представляет собой намного лучший способ множественной ПЦР.

Настоящее изобретение предлагает общий способ выделения ДНК-маркеров из любого генома и использования таких ДНК-маркеров во всех возможных применениях ДНК-фингерпринтинга.

Следующие примеры и чертежи дают иллюстрацию изобретения, которое тем не менее не ограничивается примерами.

ПРИМЕР 1. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ТОМАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ PSTI
А) Выделение и модификация ДНК
Полную ДНК томатов (Lycopersicon esculentum c.v. Moneymaker) выделяют из молодых листьев, как описано Bernatzski and Tanksley (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321). Обычный выход составляет 50-100 мкг ДНК на грамм свежего листового материала. ДНК рестрицируют с помощью PstI (Pharmacia) и двунитиевые (ds) PstI-адаптеры лигируют к рестрикционным фрагментам с использованием методики, описанной ниже. Эти адаптеры имеют следующую структуру:
5- CTCGTAGACTGCGTAСATGCA -3;
3- CATCTGACGCATGT -5,
3'ТGСА-выступ в этих адаптерах ренатурируют к ступенчатым концам, созданным с помощью PstI. Последовательность PstI-узнавания CTGCAG не восстанавливается после лигирования этого адаптера, так как 5' С-остаток замещен А. Реакцию лигирования проводят таким образом, чтобы конечный результат приводил почти исключительно к созданию молекул ДНК-фрагмента к адаптеру. Это достигается путем: 1. использования нефосфорилированных адаптеров, что исключает адаптерно-адаптерное лигирование; 2. осуществления реакции лигирования и рестрикции в одно и то же время. Последняя методика приводит к рестрикции любого продукта фрагментно-фрагментного лигирования, что элиминирует эти продукты почти полностью. Продукты адаптерно-адаптерного лигирования не могут быть рестрицированы рестрикционным ферментом, поскольку последовательность PstI-узнавания не восстанавливается в этих продуктах. Для лигирования адаптеров используют следующие реакционные условия:
2 мкг ДНК томатов
0,2 мкг адаптеров
20 единиц PstI
1 единица ДНК-лигазы Т4
10 мМ Tris.HAc, рН 7,5, 10 мМ MgAc, 50 мМ КАс, 2 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ АТР.

Реакцию лигирования осуществляют в реакционном объеме 20 мкл в течение 3 часов при температуре 37^oС. После лигирования адаптеров нелигированные адаптеры удаляют селективной преципитацией. Для этой цели реакционную смесь увеличивают до объема 100 мкл и NH4Ac добавляют до конечной концентрации 2,5 М. 100 мкл эталона с температурой -20^oС добавляют в смесь, которую инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре. ДНК собирают центрифугированием в течение 10 минут при 14000 об/мин в охлажденной центрифуге Эппендорфа при температуре 4^oС. Осадок ДНК после центрифугирования промывают один раз 0,5 мл 70% этанола при комнатной температуре и растворяют в 40 мкл Т0.1Е (10 мМ Tris. HCl, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТК). ДНК сохраняют при температуре -20^oС. Описанная здесь методика селективной преципитации позволяет эффективно удалить из реакционной смеси нелигированные адаптеры, однако небольшие ДНК-фрагменты (≤ 200 пар оснований) также теряются.

Б) Реакция амплификации
ДНК, полученную выше, используют в качестве матрицы для амплификации PstI -фрагментов. Реакционная смесь для ПЦР содержит:
1 нг матричной ДНК
150 нг праймера
1 единицу ДНК-полимеразы Tag (Perkin Elmer)
200 мкМ всех четырех dNTP
10 мМ Tris.HCl, pH 8,5, 1,5 мМ MgCl₂, 50 мМ КС1, Н₂O до полного объема 50 мкл.

Реакционную смесь покрывают 20 мкл светлого минерального масла с целью предотвращения упаривания во время реакции амплификации. ПЦР осуществляют на термоячейке для реакций ДНК Perkin Elmer с использованием следующего профиля циклов: 1 минута при температуре 94^oС, 1 минута при температуре 60^oС, повышение температуру с 60 до 72^oС со скоростью 1^oС/5 секунд и 2,5 минуты при температуре 72^oС. Всего осуществляют 33 цикла.

После проведения реакции прибавляют 20 мкл хлороформа и 10 мкл загрузочного красителя, в данном случае 50% сахарозы с 0,1% масса/объем красителя оранжевого G (Merck). Полученную смесь хорошо перемешивают с реакционной смесью и наскоро центрифугируют с целью удаления органической фазы (минерального масла и хлороформа) из органической смеси, пополненной загрузочным красителем. 20 мкл этой реакционной смеси анализируют на 1,0% агарозном геле.

В) Амплификация ДНК томатов праймерами повышенной селективности
ДНК томатов, рестрицированную с помощью PstI и меченную с помощью PstI-адаптера, амплифицуруют с использованием вышеприведенных условий. Отбирают четыре различных праймера со следующей последовательностью:
1. 5-CTCGTAGACTGCGTACA-3
2. 5-GACTGCGTACAtgcagA-3
3. 5-GACTGCGTACAtgcagAC-3
4. 5-GACTGCGTACAtgcagACC-3
Праймер 1 представляет собой часть верхней нити адаптера, используемого для модификации ДНК и поэтому должен амплифицировать все PstI-фрагменты. Праймер 2 содержит часть последовательности адаптера, последовательность PstI-распознавания (прописные буквы) и один селективный нуклеотид (жирный шрифт) и должен теоретически амплифицировать около 1/16 части всех PstI-фрагментов. Праймеры 3 и 4 аналогичны праймеру 2, однако содержат 2 и 3 селективных нуклеотида соответственно и поэтому должны амплифицировать около 1/256 и 1/4096 PstI-фрагментов. Часть реакционной смеси анализируют на 1,0% агарозном геле, который приведен на фиг.11. Дорожки 1 и 6 на этой фигуре содержат ДНК-маркеры, размеры которых указаны слева. Дорожки 2, 3, 4 и 5 содержат ПЦР, полученные с использованием праймеров 1, 2, 3 и 4 соответственно. Результаты показывают, что лишь в случае использования праймера с 3 селективными нуклеотидами число амплифицированных фрагментов таково, что получен ясный характер исчерченности. Три других праймера дают характеры исчерченности, которые нельзя разрешить на агарозных гелях, поскольку генерируется слишком много продуктов ПЦР. Среди этих многих продуктов ПЦР всегда доминируют некоторые фрагменты, и они видны как полосы на фоновом пятне других продуктов ПЦР. Возможно, что эти более сильные продукты присутствуют с более высоким числом копий на геноме томатов либо амплифицируются более эффективно, нежели другие продукты. Ожидается, что праймеры с 3 селективными нуклеотидами должны быть использованы для получения ясного характера исчерченности на агарозных гелях из-за общего числа PstI-фраментов геномной ДНК томатов (от 20000 до 100000).

Г) Анализ амплифицированных фрагментов Саузерн-блоттингом
Амплифицированные фрагменты анализируют на блоттах Саузерна с целью проверки того, что эти фрагменты соответствуют рестрикционным фрагментам bonafide того же размера. Для этой цели четыре отдельных фрагмента, полученные с праймером 4, отрезают от агарозного геля. ДНК очищают от этих гельных кусочков посредством абсорбции к стеклянным гранулам (Gene Clean, изготовитель Bio 101) и часть очищенной ДНК повторно амплифицируют с получением около 1 мкг каждого из четырех фрагментов ДНК. Реакции повторной амплификации затем электрофорезуют на 1,0% препаративном агарозном геле и желаемые ДНК-фрагменты очищают. 200 нг каждого фрагмента метят с помощью (α-32P)dATP с использованием набора для хаотического гексамерного мечения в соответствии с инструкциями изготовителя (Boehringer Mannheim). Полную ДНК томатов рестрицируют с помощью PstI и электрофоризуют на 1,0% агарозном геле. Используют четыре ясно выделенные дорожки, каждая из которых содержит около 3 мкг рестрикцированной ДНК. Затем агарозный гель подвергают блоттингу к гибридизационной мембране Genescreen+, как указано изготовителем (New England Nuclear). После блоттинга гель отрезают на четыре кусочка, каждый из которых содержит одну дорожку ДНК томатов, рестрицированную с помощью PstI. Эти четыре кусочка каждый гибридизируют к одному из четырех ДНК-зондов, следуя методике, описанной Klein-Lankhorst et al. (Theor. Appl. Genet. 81, 661-667). Гибридизированные блотты авторадиографируют в течение 40 часов с использованием пленок Kodak XAR5. Полученные результаты показывают, что все фрагменты геномной ДНК, узнаваемые четырьмя ДНК-зондами, имеют ту же длину, что и эти зонды. Это показывает, что амплифицированные фрагменты, используемые в качестве зондов, происходят от фрагментов, полученных на блоттах.

Д) Селективная амплификация одного рестрикционного фрагмента
Строят три набора праймеров для соответствующих наугад выбранных PstI-фрагментов от геномной ДНК томатов, причем известна последовательность, следующая за последовательностью узнавания PstI. Наборы праймеров с 5 селективными нуклеотидами получают в следующем виде (см. схему 1).

ДНК томатов переваривают с помощью PstI и адаптеры лигируют к концам рестрикционных фрагментов, как описано выше. Эту ДНК используют в качестве матрицы в реакциях ПЦР с наборами праймеров 1, или 2, или 3, используя условия, описанные в одном из предыдущих разделов. Реакционные продукты каждой реакции ПЦР анализируют на 1,0% агарозном геле. Этот гель приведен на фиг. 12. фиг.12 показывает 13 дорожек, из которых дорожки 1, 2, 12 и 13 являются ДНК-маркерами. Размеры в килобазах этих маркеров указаны с обеих сторон геля. Дорожки 3, 6 и 9 показывают плазмидную ДНК с каждым из трех PstI-фрагментов, рестрицированных с помощью PstI. что приводит к получению векторного фрагмента, pUCIS (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119), а также инсерцированного PstI-фрагмента. Дорожки 4 и 5 показывают амплификацию с использованием праймерного набора 1, имеющего 5 нг соответствующей плазмидной ДНК и 1 нг полной геномной ДНК, а дорожки 10 и 11 показывают амплификацию с праймерным набором 3. Эти результаты демонстрируют, что можно амплифицировать одиночные PstI-фрагменты из смеси по крайней мере 20000 фрагментов, используя методику селективной амплификации рестрикционных фрагментов с помощью праймеров, имеющих 5 селективных нуклеотидов.

Е) Идентификация ДНК-полиорфизмов с использованием SRFA
В предыдущем разделе было ясно продемонстрировано, что с использованием методики селективной амплификации рестрикционных фрагментов можно амплифицировать рестрикционные фрагменты либо выбранные наугад, либо специфические фрагменты, когда известна информация о последовательностях. Следовательно, можно было бы осуществить поиск полиморфизмов сайтов рестрикции между индивидуумами одного вида. Это описано ниже в отношении двух линий томатов, которые являются очевь близкими, но отличаются присутствием гена резистентности к нематоде корневого нароста, Mi, в одной из линий. Этот Mi-ген происходит от Lycopersicon peruvianum, вида, отдаленно родственного съедобной линии томатов L.esсulentum. Его вводят в линию L.esculentum путем скрещивания и последующего возвратного скрещивания 12 раз с родителем L.esculentum и отбора потомства на присутствие Mi-гена. Поэтому две линии томатов отличаются только малой частью их генетического материала, то есть Mi-гена и окружающей области. Как вычислено с использованием классических генетических методов, Mi-область составляет менее 1% генома этой линии.

ДНК выделяют из двух линий томатов (линия 83М-71392, Mi-чувствительная и линия 83М-71398, Mi-резистентная, получены из De Ruiter Seeds, Bleiswijk, The Netherlands) и затем рестрицируют с помощью PstI и снабжают адаптерами, как описано выше. Осуществляют большое число реакций амплификации с использованием праймеров, которые отличаются их сегментами удлинения селективных нуклеотидов. Используют три селективных нуклеотида и помимо одиночных праймеров используют также комбинации двух разных праймеров. Реакции анализируют на смешанных полиакриламидных/агарозных гелях: 2,5% полиакриламида и 1,0% агарозы с отношением акриламида к бисакриламиду, равным 20: 1. Гели проводят на ячейке гелей Protean II (Biorad), используя спейсерные области размером 1,5 мм. Bceroi используют 16 различных праймеров, что позволяет провести 16 реакций с одиночным праймером и 120 реакций со всеми возможными комбинациями двух праймеров. Типичный пример геля с шестью такими комбинациями приведен на фиг.13. Дорожки 1 и 14 этого геля содержат ДНК-маркеры, размеры которых в килобазах указаны с правой стороны от геля. Дорожки 2 и 3, 4 и 5, 6 и 7 и т.д. содержат амплификации со специфическим праймером или парой праймеров этих двух линий томатов. Скрининг на полиморфизм сайтов рестрикции приводит к получению ряда фрагментов, три из которых являются очень заметными и изображены на дорожках 9, 11 и 12 на фиг.13 (отмечены малым кругом).

Полиморфные полосы на дорожках 9 и 11, как ожидается, являются одними и теми же, так как в обеих реакциях присутствует один и тот же праймер (отличием является присутствие второго праймера на дорожке 11). Два полиморфных фрагмента дорожек 11 и 12 отрезают от геля, гельные кусочки дробят, пропуская их сквозь иглу 18 калибра, и ДНК элюируют из гельных кусочков путем элюирования через диффузию в 200 мкл 100 мМ Tris.HCl, pH 8,0, 10 мМ ЭДТК. 2 мкл используют для повторной амплификации этих фрагментов, как описано выше. 200 нг каждого фрагмента делают тупоконечными, применяя ДНК-полимеразу Т4, и затем лигируют к 100 нг плазмидного вектора pUC18 (Yanisch-Perron et al. , Gene 33, 103-119), рестрицированного с помощью SmaI. Смесь для лигирования трансформируют к E.coli, и для каждого фрагмента один рекомбинантный клон E.coli отбирают для анализа последовательности. Все эти манипуляции осуществляют с использованием стандартных методик, как описано в работе Sambrook, Fritsch and Maniatis: Molecular Clonning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

Два набора праймеров с б селективными нуклеотидами синтезируют на основе последовательностей двух фрагментов, как описано выше. Заявитель смог амплифицировать каждый фрагмент конкретно, используя эти праймерные наборы. Фрагменты были амплифицированы только из линии томатов, откуда они происходили. Следовательно, эти праймерные наборы проявляют один и тот
же полиморфизм, первоначально обнаруженный 3 селективными нуклеотидами, используемыми для обнаружения этого полиморфизма.

ПРИМЕР 2. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ТОМАТОВ РЕСТРИКЦИОННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ
В примере 1 принцип селективной амплификации рестрикционных фрагментов (SRFA) приведен с использованием ДНК томатов и рестрикционного фермента PstI. В этом примере будет показана SRFA с использованием двух различных рестрикционных ферментов PstI и MseI.

Выделение и модификация ДНК
Полную ДНК томатов выделяют из молодых листьев, как описано в примере 1. Две пары так называемых изогенных линий используют в качестве источника ДНК под названием Gem^R и Gem^S и GCR26 и GCR151 соответственно (эти линии описаны в следующих публикациях: Denby and Williams, [1962], Can. J. Plant Sci. 42, 681-685, Smith and Ritchie, [1983], Plant Mol. Biol. Rep. 1, 41-45).

Два индивидуума из каждой пары изогенных линий генетически являются весьма сходными, однако отличаются присутствием признака, придающего резистентность к грибковому патогену Verticillium albo-atratum.

Первая стадия модификации ДНК включает рестрикцию ДНК с помощью двух ферментов PstI и MseI. Рестрикцию ДНК, а также последующее лидирование адаптеров к ДНК-фрагментам осуществляют в одном и том же буфере, который назван RL-буфером (рестрикционно-лигирующий буфер) и который содержит: 10 мМ Tris. HAc/10 мМ MgAc/50 мМ КАс/5 мМ DTT, рН 7,5.

Рестрикция ДНК с помощью PstI и MseI
2,5 мкг ДНК
12,5 единиц PstI (Pharmacia, 10 единиц/мкл)
12,5 единиц MseI (N.E. Biolabs, 4 единицы/мкл)
5 мкл 10•RL-буфера
Вода до 50 мкл
Инкубацию осуществляют при температуре 37^oС в течение одного часа.

Следующим шагом модификации ДНК является лигирование молекул адаптера до концов ДНК-фрагментов. Сначала должны быть получены двунитевые присвоенные молекулы адаптера.

Получение адаптеров
MseI-адаптер:
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-5
Для получения раствора 50 пмоль/мкл этого адаптера 8 мкг (1430 пмоль) 16-мера 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 смешивают с 7 мкг (1430 пмоль) 14-мера 5-TACTCAGGACTCAT-3 в общем объеме 28,6 мкл воды.

PstI-адаптер:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
Для получения раствора 5 пмоль/мкл этого адаптера 5,25 мкг (715 пмоль) биотинилированного 21-мера 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 смешивают с 3,5 мкг (715 пмоль) 14-мера 5-TGTACGCAGTCTAC-3 в общем объеме 143 мкл воды.

Лигирование молекул адаптера
К рестрицированной ДНК прибавляют смесь 10 мкл, содержащую:
1 мкл PstI bio-адаптера (=5 пмоль)
1 мкл MseI-адаптера (=50 пмоль)
1,2 мкл 10 мм АТР
1 мкл 10•RL-буфера
1 мк-единицу ДНК-лигазы Т4 (Pharmacia, 5 единиц/мкл)
Воду до 10 мкл
Полученную реакционную смесь 60 мкл инкубируют в течение 3 часов при температуре 37^oС.

Адаптеры строят таким образом, чтобы сайты рестрикции не восстанавливались после лигирования. Таким образом предотвращается лигирование фрагмента к фрагменту, поскольку конкатемеры фрагментов рестрикцированы вследствие того, что рестрикционнные ферменты продолжают оставаться активными в течение реакции лигирования. Лигирование адаптера к адаптеру возможно, так так адаптеры не фосфорилированы (см. также пример 1).

Отбор биотинилированных ДНК-фрагментов
Получение матричных ДНК для SRFA с использованием двух рестрикционных ферментов, как правило, предполагает наличие дополнительной стадии, не используемой при проведении SRFA с одним ферментом. В данной стадии ДНК-фрагменты, к которым лигируют биотинилированный адаптер, отделяются от всех других фрагментов.

Биотинилированные фрагменты выделяются из небиотинилированных фрагментов (MseI-MseI-фрагментов) на этой стадии путем связывания парамагнитных стрептавидиновых гранул (Dynal). 10 мкл гранул промывают один раз в 100 мкл STEX (1000 мМ NaCl/Tris.HCl/1 мМ ЭДТК/0,1% Triton Х-100, рН 8,0) и ресуспендируют в 140 мкл STEX. Гранулы затем прибавляют к смеси для лигирования с получением конечного объема 200 мкл. Полученную смесь инкубируют в течение 30 минут при осторожном перемешивании при комнатной температуре с тем, чтобы обеспечить должное связывание биотинилированных ДНК-фрагментов с гранулами. Гранулы собирают, удерживая пробирки, содержащие гранулы, вблизи магнита. Это препятствует тому, чтобы гранулы удалялись с помощью пипетки при переносе супернатанта в другую пробирку. Гранулы промывают один раз, а затем переносят в свежую пробирку. Затем гранулы промывают 3 раза с помощью 200 мкл STEX. Наконец, гранулы ресуспендируют в 200 мкл Т01.Е (10 мМ Tris/0,1 мМ ЭДТК, рН 8,0) и переносят в свежую пробирку. ДНК сохраняют при температуре 4^oС. ДНК, рестрикцированные с помощью рестрикционных фрагментов, снабженные адаптерами, присоединенные к парамагнитным стрептавидиновым гранулам и очищенные от MseI-MseI-фрагментов, полученных в соответствии с вышеприведенным описанием, будут называться в следующих стадиях матричными ДНК.

Амплификация PstI-MseI-фрагментов
Матричные ДНК, полученные как описано выше, должны содержать все фрагменты PstI-MseI из упомянутых линий томатов, а, кроме того, небольшое количество PstI-PstI-фрагментов без каких либо внутренних MseI-фрагментов. В данном эксперименте число этих PstI-MseI-фрагментов визуализируют путем амплификации в основном в соответствии с примером 1. Гель-анализы продуктов амплификации осуществляют на денатурирующих акриламидных 30 гелях (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564), так как тип фрагментов, полученных с помощью методики, описанной в этом примере, имеет намного меньший размер, нежели тот, который описан в примере 1. Кроме того, эти типы гелей позволяют осуществлять разделение вплоть до 100 полос на дорожку, что составляет величину, приблизительно в 10 раз большую, нежели у агарозных гелей, описанных в примере 1. Фрагменты визуализируют путем мечения одного из ПЦР-праймеров со стороны 5'- конца с использованием (τ-³²P) АТР и полунуклеотид-киназы.

Мечение ПЦР-праймера
Праймер, отобранный для мечения, представляет собой 19-мер 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3, который назван MseI-праймер-1 и в котором селективные нуклеотиды указаны прописными буквами. Мечение осуществляется следующим образом.

3,0 мкл 18-мера (из раствора 509 нг/мкл-150 нг)
5,0 (τ-³²P)-АТР (из раствора 10 мкКи/мкл =50 мкКи)
3,0 мкл 250 мМ Tris.HCl/100 мМ MgCl₂/50 мM DTT, pH 7,5
0,5 мкл Т4-киназы (Pharmacia, 10 единиц/мкл),
18,5 мкл воды.

Это дает общий объем 30 мкл, который инкубируют при температуре 37^oС в течение 30 минут. Для каждой ПЦР прибавляют 1 мкл этого праймера.

Всего осуществляют 28 ПЦР и в каждой из них 4 матричных ДНК амплифицируют с помощью 7 комбинаций праймеров. Каждая комбинация праймеров имеет один и тот же MseI-праймер (MseI-праймер-1, описанный выше), однако варьируется в выборе PstI-праймера. Всего отбирают 7 различных праймеров (как и в случае MseI- праймера, селективные нуклеотиды указаны прописными буквами):
PstI-праймер-1:
5-GACTGCGTACATGCAQga-3
PstI-пpaймep-2:
5-GACTGCGTACATGCAGgt-3.

PstI-праймер-3:
5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
PstI-npaймep-4:
5-GACTGCGTACATGCAGag-3
PstI-npaймep-5:
5-GACTGCGTACATGCAGat-3
PstI-праймер-6:
5-GACTGCGTACATGCAGct-3
PstI-npaймep-7:
5-GACTGCGTACATGCAGta-3
Все ПЦР-праймеры растворяют в воде при концентрации 50 нг/мкл.

Реакция амплификации
Реакционная смесь для ПЦР содержит 2,0 мкл матричной ДНК; 1,0 мкл 5'-меченого MseI-праймера (5 нг); 0,5 мкл немеченого MseI-праймера (25 нг) 0,6 мкл PstI-праймера (30 нг); 2,0 мкл 250 мМ Tris.HCl/15 мМ MgCl₂/500 мМ КС1, рН 8,5; 0,8 мкл 5 мМ dNTP; 0,1 мкл Tag-полимеразы (Cetus Perkin Elmer, 5 единиц/мкл) 13,0 мкл воды.

Все компоненты реакции прибавляют и хорошо смешивают, при этом существенный компонент ПЦР, обычно фермент, прибавляют в последнюю очередь. Затем реакцию начинают как можно быстрее.

Амплификации осуществляют на термоячейке Perkin Elmer 9600. Профиль циклов имеет следующий вид:
1 цикл:
денатурация: 30 с при 94^oC
отжиг: 30 с при 65^oC
удлинение: 30 с при 72^oC
11 циклов:
денатурация: 30 с при 94^oC
в каждом цикле температуру понижают на 0,7, 61,3, 63,6, 62,9, 61,5, 60,8, 60,1, 59,4, 58,7, 58,0, 57,3^oC. Инкубируют в течение 30 с при каждой указанной температуре,
удлинение: 60 с при 72^oC
23 цикла:
денатурация: 30 с при 94^oC
отжиг: 30 с при 56^oC
удлинение: 30 с при 72^oC
Гель-анализ амплифицированных фрагментов
Реакционные продукты анализируют на 4,51% денатурирующих полиакриламидных гелях. Используют гели размером 50•38 см, при этом гельные кассеты для получения этих гелей поставляются из Biorad. Используют 100 мл гельного раствора, содержащего 4,5% (масса/объем) акриламида/0,225% (масса/объем) бисакриламида/7,5 М мочевины/50 мМ Тris/50 мМ борной кислоты/1 мМ ЭДТК, рН 8,3. 100 мл гельного раствора смешивают с 500 мкл 10% персульфата алюминия и 100 мкл TEMED непосредственно после заливки геля. Буферный раствор Tris/борной кислоты/ЭДТК используют в качестве буфера электрофореза, который содержит: 100 мМ Tris/100 мМ борной кислоты/2 мМ ЭДТК, рН 8,3. Реакционные смеси перемешивают с равным объемом (20 мкл) 98%-ного раствора формальдегида/10 мМ ЭДТК/0,01% (масса/объем) бромофенолового голубого/0,01% (масса/объем) ксилолцианола. Полученные смеси нагревают в течение 3 минут при температуре 95^oС и затем быстро охлаждают на льду. Гели пропускают при постоянной мощности 110 Вт с получением постоянного выделения тепла во время проведения электрофореза. При этих условиях напряженность поля гелей соответствует величине от 40 до 50 В/см.

Результаты реакции SRFA приведены на фиг.14. Дорожки пронумерованы от 1 до 28 и содержат в каждый момент времени четыре линии томатов с одной из 7 комбинаций праймеров. Порядок линий томатов на геле следующий: 1. GCR26, 2. GCR151, 3. Gem^R, 4. Gem^S. Дорожки 1-4 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-праймера-1; дорожки 5-8 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-npaймepa-2; дорожки 9-12 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-праймера-3; дорожки 13-16 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-npaймepa-4; дорожки 17-20 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и РstI-праймера-5; дорожки 21-24 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-праймера-6; дорожки 25-28 содержат эти ДНК, амплифицированные с применением MseI-праймера-1 и PstI-праймера-7. Гель не содержит никаких размерных маркеров, однако визуализированные ДНК-фрагменты соответствуют от ±200 нуклеотидов в нижней части рисунка до ±500 нуклеотидов в верхней части.

ПРИМЕР 3. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ LACTUCA С ПОМОЩЬЮ ДВУХ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФЕРМЕНТОВ
В примере 2 принцип селективной амплификации рестрикционных фрагментов (SRFA) приведен для ДНК томатов. В настоящем примере будет показано, что аналогичные результаты получаются при использовании ДНК различных видов Lactuca с применением тех же рестрикционцых фрагментов PstI и MseI.

Выделение и модификация ДНК
ДНК выделяют, как описано в примере 1, с использованием материала молодых листьев различных видов Lactuca. Как указано ниже, эти растения включают товарный сорт (L.sativa) и несколько индивидуумов двух диких видов Lactuca, L-saligna и L.virosa. Растениям произвольно присваивают следующие названия:
1. L.saligna, номер 21, растение 1
2. L.saligna, номер 21, растение 2
3. L.saligna, номер 22, растение 1
4. L.saligna, номер 22, растение 2
5. L.virosa, номер 01, растение 1
6. L.virosa, номер 01, растение 2
7. L.virosa, номер 02
8. L.virosa, номер 03, растение 1
9. L.virosa, номер 03, растение 2
10. L.sativa, товарный сорт
Анализируемый генетический материал представляет собой, таким образом, шесть разных растительных типов, включая два различных индивидуума из четырех растений.

Модификацию ДНК Lactuca для получения матриц для SRFA осуществляют идентично той методике, которая описана b примере 2.

Амплификация фрагментов PstI-MseI
ДНК, полученную описанным выше способом, используют в качестве матриц для проведения реакций SRFA. Используют две комбинации праймеров с применением одного MseI-праймера и двух разных PstI-праймеров. Эти праймеры (селективные нуклеотиды изображены прописными буквами) представляют собой:
MseI-праймер:
5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3:
PstI-праймер-1:
5-GACTGCGTACATGCAGaa-3:
РstI-праймер-2:
5-GACTGCGTACATGCAGca-3
Амплификацию фрагментов PstI-MseI с использованием праймеров, изображенных выше, осуществляют точно в соответствии с описанием в примере 2 и полученные фрагменты визуализируют на денатурирующих полиакриламидных гелях, как описано в примере 2. Полученные характеры исчерченности приведены на фиг. 15. Дорожки 1-10 показывают ДНК с 1 по 10, амплифицированные с помощью MseI-маркеров в комбинации с PstI-праймером-1; дорожки 11-20 показывают ДНК с 1 по 10, амплифицированные с помощью MseI-маркеров в комбинации с РstI-праймером-2. Размерные маркеры (не видимые на этой фигуре) в нуклеотидах указаны справа от геля. Различия в характерах исчерченности отражают различия в родственности различных растений.

ПРИМЕР 4. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ КУКУРУЗЫ С ПОМОЩЬЮ РЯДА КОМБИНАЦИЙ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФЕРМЕНТОВ
В примерах 2 и 3 принцип селективной амплификации рестрикционных фрагментов (SRFA) с использованием двух рестрикционных ферментов приведен для ДНК томатов и латука (вид Lactuca) соответственно. В настоящем примере будет показано, что аналогичные результаты получаются при использовании -линий кукурузы (Zea mais). Кроме того, будет показано, что ряд комбинаций рестрикционных ферментов можно использовать для получения фингерпринтов ДНК в этих линиях кукурузы.

Выделение и модификация ДНК
Используют инбредные линии кукурузы, названные 1 и 2. Источник этих линий является неуместным, поскольку, как показывает опыт, любая отобранная линия дает хорошие ДНК-фингерпринты при использовании SRFA. ДНК этих линий выделяют из материала молодых листьев, кик описано в работе Saghai-Mahoof et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 8014-8018). Для получения матричных ДНК используют следующие комбинации рестрикпионных ферментов (ЕK):
PstI/TagI, EcoRI/TagI, AseI/TagI, Sse8387-I/TagI. Все ферменты поставляются фирмой Pharmacia за исключением AseI, который поставляется фирмой New England Biolabs, и Sse8387-I, который поставляется фирмой Amersham. Матричные ДНК получаюся в основном так, как описано в примерах 2 и 3, за следующим исключением: рестрикцию ДНК осуществляют инкубированием с помощью TagI при температуре 65^oС в течение одного часа с последующим инкубированием с помощью второго фермента, PstI, AseI, EcoRI или Sse8387-I в течение еще одного часа при температуре 37^oС. Лигирование адаптеров соответствует описанному в примере 2 с использованием следующих адаптеров:
TagI-адаптер:
5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
PstI и Sse8387-I-aдаптep:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
AseI-адаптер:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGAT-5
EcoRI-адаптер:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
Амплификация рестрикпионных фрагментов
Амплификацию рестрикционных фрагментов осуществляют, как описано в примере 2. Праймеры, отобранные для мечения продуктов аплификации, являются следующими TagI-праймерами, имеющими 3 селективных нуклеотида (указаны прописными буквами):
TagI - праймеры (5'-меченые)
1. 5-TGAGTCCTGACCGAacc-3
2. 5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
3. 5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
4. 5-TGAGTCCTGACCGAcac-3
Эти 4 праймера используют для обнаружения продуктов амплификации со всеми четырьмя комбинациями ферментов. Для каждой комбинации ферментов отбирают 4 праймера для другого фермента, получая всего 16 комбинаций для каждого фермента. Эти праймеры указаны ниже (селективные нуклеотиды показаны прописными буквами). Для EcoRI и AseI отбирают праймеры с 3 селективными нуклеотидами, для PstI отбирают праймеры с 2 селективными нуклеотидами и для SseI отбирают праймеры с одним селективным нуклеотидом. Для ферментов, расщепляющих в геномной ДНК кукурузы с меньшей частотой, отбирают праймеры, содержащие сегменты удлинения с меньшим количеством селективных нуклеотидов.

EcoRI-праймер:
1. 5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3
2. 5-CTGCGTTACCAATTCaca-3
3. 5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
4. 5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
AseI-праймер:
1. 5-GACTGCGTACCTAATaac-3
2. 5-GACTGCGTACCTAATaag-3
3. 5-GACTGCGTACCTAATacc-3
4. 5-GACTGCGTACCTAATgaa-3
PstI-праймер:
1. 5-GACTGCGTACATGCAGac-3
2. 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
3. 5-GACTGCGTACATGCAGca-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
Ssе8387-I-праймер:
1. 5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
2. 5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
3. 5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
Всего осуществляют 128 ПЦР (2 ДНК • комбинация 4 ферментов • 16 комбинаций праймеров) в соответствии с протоколом, описанным в примере 2. Реакционные продукты этих ПЦР анализируют на 3 гелях (содержащих 48 дорожек/гель), как описано в примере 2. Все комбинации праймеров дают ДНК-фингерпринты, содержащие 50-100 полос на дорожку за исключением комбинации SseI/TagI, которая дает только 10-15 полос на дорожку. Пример одного из гелей приведен на фиг.16. Эта фигура показывает часть геля с анализом ДНК-фингерпринтов, полученных с комбинациями ферментов SseI/TagI и EcoRI/TagI. Дорожки 1-8 показывают ДНК-фингерпринты для двух ДНК кукурузы, полученных методом SRFA с применением TagI-праймера-3 и PstI-праймеров-1, -2, -3 и -4 соответственно; дорожки 9-16 показывают ДНК-фингерпринты для двух ДНК кукурузы, полученных методом SRFA с применением ТаgI-праймера-4 и PstI-праймеров-1, -2, -3 и PstI-праймеров-1, -2, -3 и -4 соответственно; дорожка 17 показывает лямбду-ДНК размерного маркера, которая рестрицирована с помощью PstI, причем размеры некоторых фрагментов в нуклеотидах указаны справа; дорожки 18-25 показывают ДНК-фингерпринты для двух ДНК кукурузы, полученных методом SRFA с применением TaqI-праймера-1 и EcoRI-праймеров-1, -2, -3 и -4 соответственно.

ПРИМЕР 5. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДНК
В примерах 2, 3 и 4 принцип селективной амплификации рестрикционных фрагментов (SRFA) с использованием двух рестрикционных ферментов приведен для ДНК томатов, латука (вид Lactuca) и кукурузы соответственно. В настоящем примере будет показано, что аналогичная методика может быть использована для определения характеристик бактериальных ДНК. Ряд штаммов Xanthomonas campestris получают из Лаборатории Микробиологии в Генте, Бельгия, с тем чтобы показать пригодность методики на бактериях.

Выделение и модификация ДНК
Все ДНК получают из штаммов Xanthomonas campestris, выделенных из разнообразных источников, главным образом из инфецированных растений. Эти штаммы, пронумерованные от 1 до 26, приведены в таблице и могут быть получены из Лаборатории Микробиологии в Генте, Бельгия.

ДНК этих бактериальных штаммов выделяют, как описано в работе Marmur (J. Mol. Biol. 3, 208-218). ДНК рестрицируют в основном в соответствии с примером 4 за исключением того, что в качестве рестрикционных ферментов используют TagI и ApaI. Лигирование адаптеров осуществляют, как описано в примере 4, с использованием следующих адаптеров:
TagI-адаптер:
5-GACGATGAGTCCTGAC-3.

3-TACTCAGGACTGGC-5
ApaI-адаптер:
5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3-CATCTGACGCATGT-5
Амплификация рестрикционных фрагментов
Амплификацию рестрикционных фрагментов осуществляют, как описано в примере 2. Праймеры, отобранные для мечения продуктов амплификации, являются TagI-праймер, имеющий один селективный нуклеотид (указаны прописными буквами): 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 и ApaI-праймер, имеющий один селективный нуклеотид (указаны прописными буквами):
5-GACTGCGTACAGGCCCg-3. ApaI-праймер метят с 5'-конца для обнаружения амплифицированных фрагментов, как описано в примере 2. Каждую из 26 ДНК амплифицируют с использованием праймерного набора, описанного выше. Условия амплификации соответствуют описанным в примере 2 за исключением того, что последние 9 циклов ПЦР опускают из-за более низкой сложности ДНК по сравнению с растительной ДНК в примерах 2, 3 и 4. ДНК-фингерпринты, полученные с бактериальными ДНК, как описано в данном примере, показаны на фиг.17. Дорожки 1-26 представляют собой бактериальные ДНК с 1 по 26. Размеры маркерных ДНК (не видимых на гелях) в нуклеотидах указаны справа от геля. На этой фигуре ясно продемонстрировано, что родственность бактериальных штаммов отражается сходством характеров исчерченности.

ПРИМЕР 6. СЕЛЕКТИВНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК РАЗЛИЧНЫХ ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ ДВУХ РЕСТРИКЦИОННЫХ ФЕРМЕНТОВ
В предыдущих примерах принцип селективной амплификации рестрикционных фрагментов (SRFA) приведен для ДНК различных источников. В настоящем примере показана эффективность методики с использованием отобранных наугад образцов ДНК, полученных на различных домашних животных. Испытывают следующие животные виды: Gallus domesticus (цыпленок); Susscrofa domestica L. (свинья); Bos taurus (корова); Equus caballus (лошадь). Используемыми рестрикционными ферментами являются Sse8387I и MseI.

Выделение и модификация ДНК
ДНК выделяют из проб крови в соответствии с методикой, полученной в работе Maniatis et al. (1982). Образцы ДНК с 1 по 3 (цыпленок), 4 по 7 (свинья), 8 по 11 (корова) и 12 по 15 (лошадь) переваривают рестрикционными ферментами Sse8387 и MseI. ДНК-фрагменты лигируют к адаптерам, как описано в примере 2. Поскольку рестрикционные ферменты Sse8387I и PstI генерируют совместимые 3'-выступы, можно использовать PstI- и MseI-адаптер, описанный в примере 2.

Амплификация рестрикционных фрагментов
Матричные ДНК, упомянутые выше и полученные в соответствии с примером 2, служат в качестве матриц в реакциях SRFA. Используемые праймерные комбинации состоят из одного MseI-праймера и различных SseI-праймеров:
MseI-праймер:
5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3:
Ssе8387I-праймер-1:
5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3
Ssе8387I-праймер-2:
5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
Амплификацию фрагментов Sse8387I-MseI с использованием праймерных пар, описанных выше, осуществляют, как описано в примере 2. Реакционные продукты пропускают через денатурирующие полиакриламидные гели также в соответствии с примером 2. Авторадиография, показывающая фингерпринты выше приведенных образцов, приведена на фиг.18. Дорожки 1-15 показывают фингерпринты ДНК с 1 по 15, амплифицированных с помощью MseI-праймера, спаренного с Ssе8387I-праймером-2; дорожки 16-30 показывают аналогичные характеры, полученные с помощью MseI-праймера в комбинации с Ssе8387I-праймером-2. Различия в фингерпринтах между животными одного вида отражают гетерогенность в животных популяциях; полные характеры являются показателем специфических видов.

В своем особенном варианте изобретение относится к способу управляемой амплификации по крайней мере одной части исходной ДНК, которая содержит множество рестрикционных сайтов для определенной рестрикционной эндонуклеазы и в которой по крайней мере часть ее нуклеиновокислотной последовательности не известна, причем в данном способе:
(а) указанную исходную ДНК переваривают указанной специфической рестрикционной эндонуклеазой для того, чтобы фрагментировать ее в соответствующие ряды рестрикционных фрагментов, которые соответственно содержат 5'-концы и 3'-концы;
(б) если 5'- и 3'-адаптеры, определенные здесь, уже не присутствовали в отдельных формах, также переваривают указанной специфической эндонуклеазой, определенным двунитевым олигонуклеотидным линкером, включающим один сайт в пределах своей собственной нуклеотидной последовательности для этой специфической эндонуклеазы, тем самым расщепляя указанный линкер в таких 5'- и 13'-адаптерах соответственно;
(в) рестрикционные фрагменты, полученные из исходной ДНК, лигируют со стороны их 5'- и 3'-концов с помощью указанных 3'- и 5'-адаптеров соответственно, получая тем самым меченые рестрикционные фрагменты исходной ДНК, которые затем содержат со стороны их соответственных 5'- и 3'-концов метки, нуклеотидные последовательности которых включают последовательности этих 3'- и 5'-адаптеров, включая нуклеотиды, вовлеченные в специфический сайт рестрикции;
(г) если, где это подходит для получения пригодных матриц для праймеров, указанные 5'- и 3'-адаптеры перед предыдущим лигированием не были продлены путем добавления к ним олигонуклеотидных сегментов определенных константных последовательностей со стороны их соответственных 5'- и 3'-концов, продляют, если подходит для той же цели, соответствующие концы указанных меченых рестрикционных фрагментов указанными олигонуклеотидными сегментами, посредством чего получают меченые рестрикционнные фрагменты с обоих концов с указанными константными последовательностями;
(д) указанные меченые или, если подходит, элонгированные рестрикционные фрагменты подвергают в условиях гибридизации взаимодействию с двумя олигонуклеотидными праймерами;
(е) причем указанные праймеры включают последовательности, имеющие такую же нуклеотидную последовательность, как и терминальные части нитей у 5'- и 3'-концов указанных меченых или, если подходит, элонгированных рестрикционных фрагментов, которые сами комплементарны нитям, действующим в качестве матриц для указанных праймеров, причем указанные праймеры соответственно включают нуклеотиды, комплементарные тем, которые вовлечены в образование сайта для указанной определенной специфической рестрикционной эндонуклеазы в матричной нити;
(ж) амплифицируют указанные элонгироварные меченые рестрикционные фрагменты, гибридизированные с указанными праймерами, методиками ПЦР или аналогичными в присутствии требуемых нуклеотидов и полимеразы с целью вызвать дальнейшую элонгацию гибридизированных праймеров вдоль тех рестрикционных фрагментов исходной ДНК, к которым указанные праймеры первоначально гибридизированы по всей своей длине
(з) идентифицируют или восстанавливают упомянутые последними рестрикционные фрагменты.

В конкретном варианте данного способа терминальный нуклеотид по крайней мере одного из указанных праймеров в направлении элонгации считают соответствующим последнему из нуклеотидов, вовлеченных в рестрикционный сайт для специфической эндонуклеазы, причем способ включает идентификацию или восстановление рестрикционных фрагментов указанной исходной ДНК, которая была амплифицирована.

В другом конкретном варианте данного способа терминальный нуклеотид по крайней мере одного из указанных праймеров включает отобранную последовательность, включающую определенное число (один или несколько) нуклеотидов, проходящих за пределы последнего из нуклеотидов, вовлеченных в рестрикционный сайт для указанной специфической эндонуклеазы в направлении собственной элонгации в пределах соответствующих рестрикционных фрагментов во время стадии амплификации.

В специфическом варианте вышеописанного способа двунитевый ДНК-линкер содержит несколько сайтов для различных специфических эндонуклеаз, которые все отличаются одна от другой, причем способ предусматривает повторение на той же самой исходной ДНК стадий способа, определенных выше с участием одной из этих рестрикционных эндонуклеаз еще и с другой из числа указанных отличающихся специфических эндонуклеаз и после использования праймеров, нуклеотидные последовательности которых отбирают в соответствии с вышеприведенным описанием, еще и в отношении указанной другой специфической эндонуклеазы.

Способ, описанный выше, или олигонуклеотид в соответствии с изобретением пригоден для идентификации полиморфизмов в определенных ДНК, происходящих от одинаковых живых видов, например геномных ДНК микробных, растительных или животных видов, включая человека, или их фрагментов, либо среди самих, либо в отношении соответствующего определенного стандарта ДНК, причем исследуемые ДНК подвергаются воздействию способа или взаимодействию с олигонуклеотидом в условиях, позволяющих осуществить реакцию амплификации или элонгации, сравнивают полученные рестрикционные карты, начиная с каждой из указанных ДНК и по выбору из указанных стандартных ДНК, и соотносят существование и, где подходит, локализацию этого ДНК-полиморфизма с различиями, наблюдаемыми между размерами рестрискционных фрагментов различных ДНК. Изобретение также относится к фрагментированной ДНК, различные фрагменты которой имеют последовательности, которые все соответствуют первоначальным переварам нефрагментированной исходной ДНК, из которой получены с помощью той же определенной специфической эндонуклеазы, отличающейся тем, что все указанные фрагменты мечены у своих 5'- и 3'-концов соответственно с помощью определенных 3'- и 5'-адаптеров, соответствующих расщепленной части линкера той же исходной ДНК, который первоначально включал один рестрикционный сайт для указанной специфической эндонуклеазы и был по выбору пролонгирован с помощью определенных константных последовательностей. Фрагментированная ДНК может находится в форме миграционных полос на пригодном носителе, например гельном носителе, причем его фрагменты первоначально были вынуждены мигрировать под влиянием электрического поля.

Фрагментированная ДНК также может включать концевые части, содержащие олигонуклеотид, отличающийся следующим составом, начиная с 5'-конца:
(I) нуклеотидная последовательность (константная последовательность), содержащая по меньшей мере 10 оснований, но не более 30 оснований, комплементарная определенной ДНК-последовательности, используемой в качестве адаптера, за которой сразу следует:
(II) нуклеотидная последовательность, комплементарная сайту-мишени специфической рестрикционной эндонуклеазы, используемой в стадии (а), если только эта нуклеотидная последовательность или ее часть не содержится в (II), за которой сразу следует:
(III) нуклеотидная последовательность по крайней мере из одного нуклеотида, но которая короче 10 нуклеотидов, выбранная, например, из расчета 1-5 нуклеотидов в длину.

Изобретение также относится к набору для фрагментации определенных ДНК с помощью по крайней мере одной специфической рестрикционной эндонуклеазы на фрагменты и анализа этих фрагментов, который включает:
- специфическую рестрикционную эндонуклеазу;
- олигонуклеотидный линкер двунитиевой ДНК, включающий один сайт в пределах своей собственной нуклеотидной последовательности для указанной специфической эндонуклеазы с тем, чтобы тем самым расщеплять указанный линкер в соответствующих 5'- и 3'-адаптерах, причем указанный двунитиевый ДНК-линкер имеет достаточный размер для создания 5'- и 3'-частей, которые могут затем создать матрицы для ПЦР-праймеров данного набора;
- ПЦР-праймеры, которые соответственно содержат, с одной стороны, те же самые последовательности, что и нити 5'- и 3'-адаптеров, комплементарные нитям, действующим впоследствии в качестве матриц для указанных праймеров, причем эти праймеры дополнительно включают нуклеотиды, комплементарные тем, которые вовлечены в образование сайта для указанной определенной специфической рестрикционной эндонуклеазы в матричных нитях;
- если подходит, олигонуклеотидные сегменты определенных (константных) последовательностей для образования сайтов, имеющих длину, достаточную для гибридизации с указанными праймерами, для элонгации 5'-концов указанных 5'-адаптеров или 3'-концов указанных 3'-адаптеров, либо тех и других, перед перевариванием указанного линкера указанной специфической рестрикционной эндонуклеазой с получением указанных 5'- и 3'-адаптеров соответственно или альтернативно для элонгации меченых фрагментов, полученных после лигирования указанных 5'- и 3'-адаптеров к оконечностям фрагментов исходной ДНК;
- по выбору фрагментированной ДНК-стандарт, соответствующий определенной ДНК, подвергаемой фрагментационному исследованию, посредством чего фрагменты указанной ДНК-стандарта получают при переваривании его указанной специфической эндонуклеазой.

Особый вариант предлагаемого набора состоит в том, что указанные олигонуклеотидные сегменты для элонгации обоих указанных 5'- и 3'-адаптеров или 5'- и 3'-концов меченых фрагментов ДНК имеют идентичные нуклеотидные последовательности.

В другом варианте линкер набора содержит несколько соответственных уникальных сайтов для специфических эндонуклеаз, которые все отличаются одна от другой, причем данный набор также включает праймеры, соответствующие каждому из 5'- и 3'-адаптеров, образованных расщеплением указанного линкера указанными различными специфическими эндонуклеазами соответственно, при этом данные праймеры соответствуют определению в п.8 формулы изобретения в отношении 5'- и 3'-адаптеров, которые получают в указанном линкере путем расщепления его каждой из этих специфических эндонуклеаз.

Кроме того, в особом варианте изобретения набор может включать фрагментированные ДНК-стандарты, определенные выше в отношении соответствующих специфических рестрикционных эндонуклеаз, при этом каждый из указанных фрагментированных ДНК-стандартов соответствует каждому из определенных рестрикционных ферментов.

Формула изобретения

1. Способ амплификации по меньшей мере одного рестрикционного фрагмента ДНК, полученного из исходной ДНК, предусматривающий этапы: (а) получение рестрикционных фрагментов в результате обработки исходной ДНК, по меньшей мере одной эндонуклеазой рестрикции, специфичной для этой ДНК; (в) получение меченого рестрикционного фрагмента путем лигирования полученного рестрикционного фрагмента с двунитевым синтетическим адаптером, имеющим конец, совместимый с одним или обоими концами этого фрагмента; (c) контактирование меченых рестрикционных фрагментов в условиях гибридизации по меньшей мере с одним олигонуклеотидным праймером (d) с последующей амплификацией гибридизующихся с праймером фрагментов в присутствии требуемых нуклеотидов и ДНК полимеразы, отличающийся тем, что на стадии (с) осуществляют контактирование всех меченых рестрикционных фрагментов с праймером или праймерами, включающими нуклеотидную последовательность с парными основаниями для части последовательности мишени, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции, присутствующей в меченых рестрикционных фрагментах и парными основаниями для части адаптерной последовательности, причем по меньшей мере один из указанных праймеров на своем 3' - конце содержит селективную последовательность по меньшей мере с одним нуклеотидом, расположенным в непосредственной близости к нуклеотидам, вовлеченным в формирование последовательности, узнаваемой рестриктазами а на стадии (d) амплифицируют указанные меченые рестрикционные фрагменты, гибридизующиеся с указанным праймером или праймерами, или проводят элонгацию гибридизуемых праймеров вдоль меченых рестрикционных фрагментов и (е) идентифицируют или восстанавливают амплифицированные или элонгированные фрагменты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве праймера или праймеров на этапе (с) используют праймер или праймеры с последовательностью, идентичной последовательности нуклеотидов терминальной части нитей указанных меченых рестрикционных фрагментов, включая нуклеотиды, вовлеченные в формирование последовательности, узнаваемой указанными рестрикционными эндонуклеазами, и включающей по меньшей мере часть нуклеотидов, присутствующих в лигированном адаптере, при этом по меньшей мере часть этих праймеров включает селективную последовательность на 3' - конце, содержащую по меньшей мере один нуклеотид, расположенный в непосредственной близости к нуклеотидам, вовлеченным в формирование последовательности, узнаваемой указанной эндонуклеазой рестрикции.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве праймера или праймеров на этапе (с) используют праймер или праймеры с полностью парными основаниями для постоянной последовательности, состоящей частично из последовательности, узнаваемой рестрикционной эндонуклеазой, и последовательности адаптера.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве праймера или праймеров используют по меньшей мере один праймер, включающий селективную последовательность из 1-10 нуклеотидов.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что в качестве праймера используют праймер, включающий 10-50 нуклеотидов с последовательностью, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции, включающей 4-8 нуклеотидов.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что в качестве праймера используют праймер, нуклеотидная последовательность которого содержит от 10 до 30 нуклеотидов с основаниями, парными адаптеру.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что в качестве адаптеров используют адаптеры, которые конструируются таким образом, чтобы соответствующая последовательность, узнаваемая эндонуклеазой рестрикции, восстанавливалась при гибридизации адаптера с меченым(и) рестрикционным(и) фрагментом(ами), при этом в качестве праймера или праймеров используют олигонуклеотидный праймер или праймеры, состоящие из постоянной последовательности оснований, полностью парных к части последовательности, узнаваемой указанными рестрикционными эндонуклеазами, причем по меньшей мере один из указанных праймеров включает на 3'- конце нуклеотиды, находящиеся в непосредственной близости к нуклеотидам, вовлеченным в формирование указанной последовательности, а также 1-10 дополнительных селективных нуклеотидов.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что в качестве последовательности исходной ДНК используют последовательность ДНК, которая по меньшей мере частично известна.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что используют по меньшей мере две эндонулеазы рестрикции.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют праймеры, которые имеют одинаковую постоянную последовательность нуклеотидов.

11. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют смесь различных праймеров.

12. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют по меньшей мере один праймер, который содержит 1, 2 или 3 селективных нуклеотидов на 3'- конце.

13. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что на этапе (а) используют по меньшей мере 2 различные эндонуклеазы рестрикции, а в качестве адаптера используют по меньшей мере один двунитевой синтетический биотинилированный адаптер для одной из эндонуклеаз.

14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что в качестве праймера используют по меньшей мере один меченый праймер.

15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что в качестве праймера используют праймеры с числом селективных нуклеотидов, ограничивающих число амплифицируемых рестрикционных фрагментов до 5-200.

16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что в качестве исходной амплифицируемой ДНК используют геномную ДНК из человеческой или животной биологической пробы, особенно из пробы ткани или крови.

17. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что в качестве исходной амплифицируемой ДНК используют геномную ДНК из растений или тканей растений.

18. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что в качестве исходной амплифицируемой ДНК используют ДНК-микроорганизма.

19. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют сравнение двух или более амплифицированных или элонгированнных ДНК-фрагментов, идентифицированных или восстановленных на этапе (е) для обнаружения сходства между разновидностями животных или растений, видами, культиварами, микроорганизмами или для оценки генетических различий и характеристик таких разновидностей растений или животных, видов, культиваров, микроорганизмов.

20. Способ по любому из пп. 1-15 отличающийся тем, что амплифицируемые или элонгируемые фрагменты ДНК на этапе (е) дополнительно идентифицируются или восстанавливаются как ДНК-фингепринты.

21. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что дополнительно (f) изолируют по меньшей мере один идентифицированный или восстановленный на этапе (е) фрагмент ДНК; (g) определяют нуклеотидную последовательность первых 8-10 нуклеотидных остатков, прилежащих непосредственно к последовательности, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции, на обоих концах указанных ДНК-фрагментов; затем (h) конструируют олигонуклеотидные праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность, соответствующую праймерам этапа (с) п. 1, где селективные нуклеотиды включают 5-10 нуклеотидных остатков, которые относятся к первым 8-12 нуклеотидным остаткам, непосредственно прилежащим к сайтам рестрикции на обоих концах указанного фрагмента ДНК.

22. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что идентифицируют полиморфизмы в геномной ДНК-микроорганизмов, растений или животных, включая человека, или фрагментах, выделенных из них, или среди них, или относительно соответствующей определенной исходной ДНК.

23. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что идентифицируют ДНК-полиморфизмы, обусловленные генетически наследуемыми признаками у человека, или ДНК-полиморфизмы, обусловленные генетически наследуемыми признаками у животных, или ДНК-полиморфизмы, обусловленные генетически наследуемыми признаками у растений, и идентифицируют ДНК-маркеры, основанные на таком ДНК-полиморфизме.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что идентифицируют ДНК-маркер, связанный с генетическим признаком, при котором после идентификации полиморфизма у исходной ДНК, происходящей из тех живых видов, которые наследуют отличие в указанном генетическом признаке, проводят корреляцию указанного полиморфизма с фенотипами, наследующими указанный генетический признак.

25. Олигонуклеотид для амплификации, включающий так называемые постоянные последовательности с нуклеотидами, комплементарными по крайней мере части адапторной последовательности и по крайней мере части последовательности сайта рестрикции, узнаваемого эндонуклеазой рестрикции, указанный олигонуклеотид, кроме того, включает на 3'-конце 1-10 случайно выбранных нуклеотидов и имеет длину 10-50 нуклеотидов.

26. Олигонуклеотид по п. 25, который включает 4-8 нуклеотидов последовательности, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции.

27. Олигонуклеотид по пп. 25 или 26, который включает 10-30 нуклеотидов постоянной последовательности.

28. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-27, который включает постоянную последовательность, комплементарную части последовательности сайта рестрикции, узнаваемого эндонуклеазой рестрикции, и последовательность, комплементарную части адаптерной последовательности, прилегающей к концу рестрикционного фрагмента.

29. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-28, который включает 1, 2 или 3 случайно выбранных нуклеотида.

30. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-29, который является меченым.

31. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-30, который предназначен для идентификации полиморфизмов в геномной ДНК-микроорганизмов, растений или животных, включая человека, или фрагментов, выделенных из них, или среди них, или относительно соответствующей определенной исходной ДНК.

32. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-30, который используется для получения амплифицированных или элонгированных ДНК-фрагментов, которые в дальнейшем идентифицируются или восстанавливаются для обнаружения сходства между разновидностями животных или растений, видами, культиварами, микроорганизмами или для оценки генетических различий и характеристик таких разновидностей растений или животных, видов, культиваров, микроорганизмов.

33. Олигонуклеотид по любому из пп. 25-30, который используется как селективный праймер для элонгации или амплификации набора меченых рестрикционных фрагментов, полученных из исходной ДНК.

34. Набор для амплификации по меньшей мере одного рестрикционного фрагмента из исходной ДНК после ее обработки одной или более специфическими рестрикционными эндонуклеазами, включающий специфическую рестрикционную эндонуклеазу или эндонуклеазы; по меньшей мере один двунитевой синтетический олигонуклеотид (адаптер), который является совместимым для лигирования с одним или обоими концами рестрикционных фрагментов для образования меченых рестрикционных фрагментов исходной ДНК, праймер или праймеры, отличающийся тем, что в качестве праймера или праймеров он включает олигонуклеотидный праймер по любому из пп. 25-30.

35. Набор по п. 34, отличающийся тем, что, кроме того, включает ДНК-полимеразу, преимущественно Taq полимеразу и/или дНТФ, и/или буферный раствор.

36. Набор по п. 34 или 35, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют для идентификации ДНК-полиморфизмов, обусловленных генетически наследуемыми признаками у человека, или ДНК-полиморфизмов, обусловленных генетически наследуемыми признаками у животных, или ДНК-полиморфизмов, обусловленных генетически наследуемыми признаками у растений, а также для идентификации ДНК-маркеров, основанных на таком ДНК-полиморфизме.

37. Набор по п. 34 или 35, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют для генетического анализа, например для судебно-медицинского типирования людей.

38. Набор по п. 34 или 35, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют для генетического анализа, например для выявления наследуемости определяемых признаков у животных или признаков у растений.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36