Пептиды с контринсулярным действием

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения гипогликемий, в частности гипогликемических состояний, вызванных повышенным содержанием в крови инсулина эндогенного или экзогенного происхождения. Для коррекции гипогликемического состояния предлагаются синтезированные пептиды инсулина человека, содержащие аминокислотные остатки, входящие в сайт связывания инсулина с клеточным рецептором, выбранные из группы: С - концевой пептид А-цепи инсулина (А12-А21), С - концевые пептиды В-цепи инсулина человека, содержащие 14-23 аминокислотных остатков, димер, содержащий С-концевой пептид А-цепи (А18-А21) и С-концевой пептид В-цепи (В17-В30), соединенные дисульфидным мостиком, а также их смеси. Предложенное средство оказывает более длительное действие. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения гипогликемии, в частности гипогликемических состояний, вызванных повышенным содержанием в крови инсулина эндогенного или экзогенного происхождения.

Кроме того, изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине или биологии в опытах in vivo или in vitro для блокады клеточных рецепторов инсулина без получения инсулиноподобного эффекта, а также в других случаях, где может быть необходим контринсулярный эффект.

В настоящее время во всем мире отмечается рост психоэмоционального напряжения, стресса. Среди стрессорно обусловленной патологии важное место занимают гипогликемические состояния, которые вызываются снижением уровня глюкозы в крови (ниже 50 - 70 мг %) и имеют различную этиологию. Различают: 1) гипогликемии, вызванные функциональной недостаточностью коры надпочечников (астеническое состояние), при которой скорость глюконеогенеза - образования глюкозы из неуглеводных продуктов (глюкогенных аминокислот) - существенно снижается; 2) гипогликемии печеночного типа, связанные с недостаточностью функции печени; 3) гипогликемии, вызванные усилением выделения глюкозы из организма (нарушением резорбции глюкозы в почках); 4) гипогликемии, вызванные усиленным распадом глюкозы в тканях (опухоли островков Лангерганса, гиперплазия и гипертрофия островков Лангерганса, преходящий гиперинсулинизм и др.) (Большая медицинская энциклопедия. - 1977. - Т.6. - С.198); 5) гипогликемии, возникающие в результате передозирования инсулина, вводимого с терапевтической целью, например, при диабете или при лечении психических заболеваний.

Непосредственной причиной гипогликемии является стимулируемое инсулином ускорение транспорта глюкозы из крови в ткани, тормозящее влияние инсулина на процессы глюконеогенеза и глюкозообразование в печени и почках с последующим замедлением поступления глюкозы из этих органов в кровяное русло, а при гипогликемии почечного происхождения - ускорением выделения глюкозы из крови в мочу (Большая медицинская энциклопедия. - 1977. - Т.5. - С.482 - 483).

Вышеперечисленные пять видов гипогликемии могут быть условно объединены в две группы: I. Гипогликемии, вызванные недостаточным поступлением глюкозы в кровь или ускоренным выведением ее из организма (1 - 3).

II. Гипогликемии, вызванные усиленным транспортом глюкозы из крови в клетку из-за высокого содержания в крови инсулина экзогенного или эндогенного происхождения (4 - 5).

Существует ряд средств и методов для лечения гипогликемических состояний. Коррекция гипогликемии в острой форме может быть проведена с помощью внутримышечного или подкожного введения глюкагона (Машковский М.Д. - 1993. - Ч. 1. - С.652) либо глюкагона и амилина (пат. 5234906 США). При алиментарной гипогликемии, а также при болезни Гирке показан адреналин (1 мл 0,1%-ного раствоpa), который быстро мобилизует гликоген печени, обеспечивая поступление глюкозы в кровь (Большая медицинская энциклопедия. -1977. -Т.5. - С. 482-483). Во многих случаях при гипогликемических состояниях больным вводят глюкозу (Там же; машковский М.Д. Лекарственные средства. - 1993. - Ч.2. - С. 219).

Вышеприведенные способы коррекции гипогликемических состояний оказывают временное действие и не направлены на купирование гормонального эффекта инсулина. Применение их может быть эффективным в случаях 1 - 3. В случаях же 4 - 5, связанных с выраженным проявлением гормонального эффекта инсулина, они недостаточно эффективны. В этих случаях предпочтительнее было бы использовать предлагаемые в настоящей заявке пептиды с контринсулярным действием. Они могут быть применены как самостоятельно, так и в сочетании с вышеуказанными средствами. Например, при коррекции гипогликемического состояния путем введения глюкозы очень трудно подобрать адекватную дозу глюкозы, если у больного имеет место высокая чувствительность тканей к инсулину. Введенная глюкоза быстро переходит из крови в клетки под влиянием инсулина и опять наступает гипогликемическое состояние. Введение же глюкозы совместно с предлагаемыми контринсулярными пептидами способно было бы решить данную проблему.

В случае 4 при развитии гипогликемии на фоне опухолевого процесса введение одной глюкозы нецелесообразно, т.к. оно стимулирует рост опухоли. Здесь также более благоприятный эффект может быть получен при введении глюкозы совместно с контринсулярными пептидами, являющимися предметом данной заявки. Контринсулярные пептиды в данном случае будут оказывать цитостатический эффект.

Патентный поиск был проведен по рубрикам МКИ⁵ А 61 К 37/26 и С 07 К 7/40 - 7/42, а также по рубрикам МПК⁶ А 61 К 38/28 и С 07 К 14/62.

Анализ патентных документов, выявленных в данных рубриках, показал, что найденные патентные документы относятся к решению следующих задач: - производство и очистка инсулина; - получение аналогов и производных инсулина; - разработка форм и способов введения инсулина в организм;
- инсулинотерапия (лечение сахарного диабета, психических заболеваний и проч.).

Было обнаружено несколько патентных документов, где описываются пептиды - фрагменты инсулина (а.с. 1149603 СССР, заявка 89825-91 Австралии, патент 915933 Финляндии). Однако во всех этих случаях решается задача создания пептидов с гипогликемической, т.е. инсулиноподобной активностью.

Обнаружены также патентные документы, где речь идет
- о гипергликемических препаратах (патент 5234906 США),
- о способе и препарате для лечения сахарного диабета и гипогликемии (патент 5321008 США).

В первом случае используется глюкагон с амилином, а во втором - инсулин с кальцитонином.

В изученной литературе отсутствуют сведения о создании пептидов - фрагментов инсулина, которые бы предлагались для коррекции гипогликемических состояний.

Сущность изобретения
Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что для коррекции гипогликемического состояния предлагаются синтезированные пептиды инсулина человека, содержащие часть аминокислотных остатков, входящих в сайт связывания инсулина с клеточным рецептором, причем при отсутствии инсулиноподобного действия синтезированные пептиды проявляют себя как активные конкуренты инсулина за клеточный рецептор, вследствие чего препятствуют транспорту глюкозы из крови в клетки и тормозят развитие гипогликемии. Данный механизм не используется ни в одном из существующих средств коррекции гипогликемического состояния.

Структура синтетических пептидов
1. С-концевой пептид "10" А-цепи инсулина:
S--L--Y--Q--L--E--N--Y--C-N
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
2. С-концевой пептид "14" В-цепи инсулина:
L--V--С--G--E--R--G--F--F--Y--Т--Р--К-Т
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
3. С-концевой пептид "16" В-цепи инсулина:
L--Y--L--V--C--G--E--R--G--F--F--Y--T--P--K-T
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
4. С-концевой пептид "23" В-цепи инсулина:
G--S--H--L--V--E--A--L--Y--L--V--C--G--E--R--G--F--F--Y-
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Т--Р--К-Т
27 28 29 30
5. Димер, содержащий С-концевые пептиды А- и В-цепей инсулина: NYCN - С-концевой пептид из А-цепи (А 18 - А 21)

где S - серии, L - лейцин, Y - тирозин, Q - глутамин, Е -глутаминовая кислота, N - аспарагин, С - цистеин, V - валин, R -аргинин, F - фенилаланин, Т - треонин, Р - пролин, К - лизин, G - глицин, Н - гистидин, А - аланин.

Инсулин - небольшой глобулярный белок с известной первичной и третичной структурой, состоящий из двух пептидных цепей. А-цепь инсулина содержит 21 аминокислотный остаток, В-цепь - 30 аминокислотных остатков. Сайт связывания инсулина с рецептором, согласно литературным данным, представляет собой два сближенных в пространстве участка поверхности молекулы инсулина. Первый участок включает остатки В-цепи: Val-12, Tyr-16, Gly-23, Phe-24, Phe-25 и Туr-26. Второй участок включает аминокислоты А-цепи: Gly-1, Glu-4, Gln-5 и Asn-21. Показано, что мутантный инсулин с заменой Туr-В16 на His сохраняет лишь 43% активности нативного человеческого инсулина, а замена остатка Phe-B24 на серин приводит к полной утрате эффекта связывания.

Отсюда видно, что связывание инсулина с рецептором - сложный и тонкий процесс. Поэтому было неочевидно, будут ли садиться на рецептор и конкурировать с инсулином синтезированные пептиды, содержащие часть аминокислотных остатков, входящих в сайт связывания с рецептором, т.е. будут ли синтезированные пептиды проявлять контринсулярную активность.

Проведенные эксперименты показали, что предлагаемые пептиды действительно тормозят транспорт глюкозы из крови в клетки, проявляя себя как контринсулярные пептиды.

Предлагаемое изобретение соответствует, таким образом, критерию "изобретательский уровень".

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пептиды синтезировали твердофазным методом. В работе применяли L-аминокислоты с шелочелабильной 2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонильной (NSC) N^а-защитной группой. В качестве защиты боковых функций аминокислот использовали: для Glu, Туr, Thr - трет-бутиловые эфиры; для Arg - мезитиленсульфонильную группу; для Cys - тритильную; для Lys - трет-бутилоксикарбонильную; для Asn - ксантинильную защитную группу. Сборку пептидных цепей осуществляли в ручном синтезаторе на смоле Ванга (0,8 ммоль/г ОН-групп), используя в качестве конденсирующего агента ВОР - реагент Кастро по синтетическому протоколу, описанному ранее (Samukov V.V. et al.//Tetrahedron Lett. 1994. V.35. P. 7821-7824). Деблокирование и отщепление пептидов от полимера проводили по методу Тамма (Tam J.P.//Org. Chem. 1985. V.50. Р.5291-5298).

Очистку пептидов осуществляли полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием хроматографа Pharmacia-LKB 2249 (Швеция) на колонке (10 х 250 мм), заполненной сорбентом LiChrosorb 100RP - 18 (10 мкм; Merck), в градиенте концентрации ацетонитрила (0-50%) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте за 60 мин при скорости потока 4 мл/мин. Объем фракции 4 мл. Фракции, содержащие пептиды с чистотой выше 90% по данным аналитической ВЭЖХ, объединяли, растворитель удаляли при пониженном давлении на ротационном испарителе при температуре бани 30^oС. Остаток растворяли в ледяной уксусной кислоте, фильтровали через стеклянный фильтр, лиофилизировали. На полупрепаративную колонку наносили до 200 мг неочищенных пептидов. Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке (4,6 х 150 мм) с сорбентом Nucleosil 100 RP-18 (5 мкм). Детекцию осуществляли спектрофотометрически по поглощению при 226 нм. Аминокислотный состав пептидов определяли после гидролиза в 6 н. HCL (110^oС, 24 ч; в запаянных ампулах) на аминокислотном анализаторе Biotronik LC 5001(ФРГ).

Получение димера. 10 мг лиофилизированного пептида NYCN со свободной сульфгидрильной группой растворяли в 5 мл дегазированной 50%-ной уксусной кислоты, добавляли 15 мг 2,2'-дипиридилдисульфида (Merck) и 3 ч перемешивали реакционную смесь без доступа воздуха. Ход реакции контролировали с помощью ВЭЖХ. Затем реакционную смесь наносили на колонку и NYC(Ps)N выделяли полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в хроматографических условиях, описанных выше. Выход лиофилизированного продукта 90%.

По 10 мг пептидов NYC(Ps)N и LVCGERGFFYTPKT растворяли в атмосфере аргона в 5 мл дегазированной 50%-ной уксусной кислоты. В ходе реакции, по данным ВЭЖХ, появлялся новый пик. После полного исчезновения исходного тетрадекапептида (5 ч) октадекапептид с дисульфидным мостиком выделяли из реакционной смеси с помощью ВЭЖХ. Фракции, содержащие целевой пептид с чистотой выше 95%, объединяли, удаляли растворитель при пониженном давлении, остаток растворяли в дегазированной воде, фильтровали и лиофилизировали. Выход лиофилизированного материала в расчете на тетрадекапептид 60%.

Все полученные в результате синтеза пептиды имели корректный аминокислотный состав.

Синтезированные пептиды вводили мышам (гибриды СВА х С57 Black) внутрибрюшинно в эквимолярных количествах. Мышей забивали декапитацией через 30, 60, 90 и 120 мин после введения препаратов. Содержание сахара в крови определяли глюкозоксидазным методом с помощью набора реактивов "Новоглюк" производства "Вектор-Бест" (Новосибирск).

Полученные результаты представлены в табл.1 и 2. Из представленных данных видно, что все синтезированные нами пептиды не обладали гормональным (проинсулярным) эффектом (табл.1), но все обладали контринсулярным действием, задерживая поглощение глюкозы из крови под влиянием гормона (табл.2).

Формула изобретения

Средство, обладающее контринсулярным действием, отличающееся тем, что оно представляет собой пептид, выбранный из группы: С - концевой пептид А-цепи инсулина, включающий 10 аминокислотных остатков (А12 - А21), С - концевые пептиды В-цепи инсулина, включающие 14-23 аминокислотных остатков, димер, содержащий соединенные дисульфидным мостиком С-концевой тетрапептид А-цепи (А18 - А21) и С-концевой тетрадекапептид В-цепи инсулина (В17 - В30), или их смеси.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2