Рекомбинантный белок asp-паллидипин, способ его производства и очистки, вектор, штамм, фармацевтическая композиция

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения ингибитора индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов у млекопитающих. Рекомбинантный белок Asp-паллидипин соединен на N-конце паллидипина пептидной связью с Asp. Способен ингибировать индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов у млекопитающих. Белок получают путем культивирования штамма Escherichia coli, трансформированного вектором, содержащим ДНК, кодирующую Asp-паллидипин. Белок очищают хроматографически. Изобретение позволяет получать лекарственное средство для лечения атеросклеротического или тромботического заболевания и рака с метастатическими опухолевыми клетками. 8 с. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Настоящее изобретение относится к способу производства модифицированного ингибитора индуцированной коллагеном агрегации трамбоцитов, называемого паллидипином. Изобретение также относится к веществу паллидипину, которое модифицировано.

Коллаген является наиболее мощным известным стимулятором агрегации человеческих тромбоцитов. Например, при повреждении стенки сосуда и воздействии коллагена кровяные пластинки быстро слипаются и становятся активированными (H.R. Baumgartner (1977) Thromb. Haemostas. 37:1-16; J. Hawiger (1987) Human Pathol. 18:111-122).

Индуцированная коллагеном агрегация тромбоцитов - тромбоцитов человека - представляет, таким образом, фактор риска для пациентов, подвергающихся воздействующим на сосуды процедурам, например ангиопластике или сепсису, для пациентов, страдающих от инфаркта миокарда, в частности для пациентов, выздоравливающих при лечении инфаркта миокарда.

В некоторых случаях необходимо ингибировать индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов. Известно, что некоторые соединения ингибируют такую агрегацию. Например, синтетические олигопептиды ингибируют индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов посредством связывания с тромбоцитами. См., например, Bevers et al. (1985) "Collagen Derived Octapeptide Inhibits Platelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin", Thrombosis Research, 37:365-370; Karniguian et al. (1983) "Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the Platelet/Collagen Interaction", Thrombosis Research, 32: 593-604; Caen et al. (1981) "01igopeptides with specific inhibiting properties of collagen-induced aggregation, process for preparing the same and pharmaceutical compositions containing them"; и ЕРА 0040149.

Другим источником ингибитора индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов является ингибитор, идентифицированный в змеином яде, имеющий неизвестное строение. См. Smith et al., "Identification of 50 kDalton snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen" (1991) FEBS 283:307-310.

Третий такой ингибитор из слюны медицинских пиявок описан Munro et al., (1991) "Calin - a platelet adhesion inhibitor from the saliva of the medicinal leech". Blood Coagulation and Fibrinolis 2:179-184. В публикации заявки на европейский патент ЕР 0480651 (Merck & Со. Inc., опубликована 15 апреля 1992) описывается белок, имеющий молекулярную массу около 16 килодальтон (кД) и способный ингибировать индуцированную коллагеном агрегацию человеческих тромбоцитов, и этот белок происходит из слюнной железы пиявки Haemaenteria officinalis. LAPP представляет собой белок в 16 кД из пиявки Haemaenteria officinalis, описанный в Connoly et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 6893-6898. См. также моубатин (Moubatin), описанный в Waxman and Connolly (1993) J.Biol. Chem. 268:5445-5449.

Еще один тип ингибитора индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов можно выделить из насекомых, как описано в публикации заявки на европейский патент ЕР 0530937. Эти белки названы "паллидипинами" (Pallidipins").

Щелочная фосфатаза (АР) представляет собой белок E.coli, который секретируется в периплазматическое пространство. АР синтезирована как белок-предшественник, имеет лидерную последовательность длиной в 21 аминокислоту, которая отщепляется лидерной пептидазой в ходе транслокации через бактериальную внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство (Y. Kikuchi et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:5671-5678). Ее биосинтез регулируется концентрацией фосфата в культуральной среде, и секреция продуктов гетерологичных генов, расположенных в прямом направлении АР-промотора, достигается путем применения низких концентраций фосфата (С. Monteilhet et al. (1993) Gene 125:223-228).

Природный источник белка паллидипина является ограниченным. Способы, использующие методы биотехнологии, являются логическим решением вопроса производства паллидипина. Экспрессия паллидипина в почечных клетках детеныша хомяка (ЕР 0530937) происходит с такой степенью продуцирования, которая должна быть увеличена, чтобы синтезировать паллидипин в промышленном количестве. Следовательно, необходима усовершенствованная система экспрессии.

Таким образом, существовала необходимость в улучшенном способе производства рекомбинантного паллидипина, который ин-гибирует индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов, и такой способ должен иметь высокий выход и допускать воспроизводимое отделение белка с высокой степенью чистоты. Новый способ не должен отрицательно влиять на биологическую активность получающегося в результате белка паллидипина.

В настоящее время обнаружено, что проблему можно решить с помощью способа производства рекомбинантного белка паллидипина (Asp-паллидипина), при этом Asp-паллидипин ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов у млекопитающих, и при этом Asp-паллидипин содержит (I) белок (паллидипин), выбираемый из группы паллидипиновых белков, и (II) аминокислоту - аспарагиновую кислоту, причем аспарагиновая кислота соединяется пептидной связью с N-концевой областью паллидипина; при этом Asp-паллидипин имеет следующие аминокислотные последовательности: а) последовательности, указанные в аа) послед. No.1; бб) послед. No.2; или вв) послед. No.3; или б) аллельные варианты или модификации, или мутеины последовательностей в любой из послед. NoNo 1-3, и эти аллельные вариации, или модификации, или мутеины не влияют, по существу, на активность белка, или
в) белок, соответствующий любой из послед. NoNo 1-3, или их вариантам, или мутеинам, упомянутым в б), имеющим посттрансляционные модификации, которые, по существу, не влияют на активность зрелого белка;
включающего стадии
аа) трансфекции, по крайней мере, одной бактерии соответствующим вектором, при этом вектор содержит
(I) ДНК или кДНК, кодирующую рекомбинантный Asp-паллидипин,
(II) подходящую сигнальную пептидную последовательность, которая расщепляется таким образом, что аспарагиновая кислота находится в положении +1 аминокислотной последовательности со стороны паллидипина, и
(III) подходящий промотор;
бб) экспрессии препротеина, содержащего Asp-паллидипин и сигнальную последовательность;
вв) переноса Asp-паллидипина из цитоплазмы бактерии в периплазму,
во время переноса - расщепление препротеина, по крайней мере, одной протеазой продуцирование Asp-паллидипина,
гг) выделения Asp-паллидипина посредством экстрагирования периплазмы, и
дд) очистки Asp-паллидипина.

E. coli является быстрой экспрессионной системой для продуцирования гетерологичных, т.е. эукариотных белков. Во время экспрессии эукариотных генных продуктов в E.coli неправильное складывание белков часто является проблемой, которая может привести к сниженной активности экспрессируемых продуктов. Вероятность правильного складывания белка намного больше, когда белок переносится в периплазму клеток E.coli, чем когда белок остается в цитоплазме. Перенос белков в периплазму индуцируется сигнальными пептидными последовательностями, связанными со зрелыми белками; эти сигнальные пептидные последовательности вместе с последовательностями зрелых белков названы "препротеинами". Правильное расщепление препротеина между сигнальной пептидной последовательностью и зрелым белком необходимо для экспрессии зрелых эукариотных белков в E.coli; последовательность сигнальной последовательности и последовательность зрелого белка оказывают влияние на правильное расщепление. Следовательно, не все сигнальные пептидные последовательности совмещаются со всеми кодирующими последовательностями.

Известно, что сигнальная последовательность щелочной фосфатазы E.coli эффективна для секреции препротеинов. Но известно, что сочетание данной сигнальной пептидной последовательности и последовательности зрелого белка не будет непременно приводить к хорошему процессингу препротеина.

Как ни удивительно, но обнаружено, что мощность способа производства по изобретению в 15 раз превышает мощность экспрессионной системы, использующей почечные клетки детеныша хомяка. Эти результаты приводятся в примерах. Функция и активность Asp-паллидипина, при сравнении с эукариотной экспрессионной системой почек хомяка, не испытывают негативного влияния со стороны способа по изобретению. Другое преимущество состоит в том, что протеаза (например, лидерная пептидаза), необходимая для расщепления препротеина, продуцируется самой E.coli.

Очистка зрелого белка Asp-паллидипина значительно проще при использовании способа по изобретению, чем очистка экспрессированных белков, образовавшихся и оставшихся в цитоплазме бактерии. Осмотический шок является достаточным для выделения Asp-паллидипина, накопленного в периплазме.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения ДНК, кодирующая сигнальную пептидную последовательность, кодирует сигнальную последовательность щелочной фосфатазы (АР), предпочтительно АР E.coli.

Настоящее изобретение относится к способу, при котором вектор для Asp-паллидипина изобретения происходит от вектора pSB94 (U. Boidol et al. (1982) Mol. Gen. Genet. 185:510-512).

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой вектор, упомянутый ранее, и, кроме того, подходящий сигнальный пептид, подходящий промотор и, при необходимости, подходящий энхансер. Векторы подробно описаны в литературных ссылках в примерах, а также в публикациях европейских патентов ЕР 0480651; 0462632 и 0173177.

Бактерия E. coli является предпочтительным хозяином. Подходящими также являются другие микроорганизмы, например Bacillus subtilis.

Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку Asp-паллидипину, при этом Asp-паллидипин ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию трамбоцитов у млекопитающих, и при этом Asp-паллидипин содержит
(I) белок (паллидипин), выбираемый из группы паллидипиновых белков, и
(II) аминокислоту - аспарагиновую кислоту,
при этом аспарагиновая кислота соединяется пептидной связью с N-концевой областью паллидипина;
вследствие чего Asp-паллидипин имеет аминокислотные последовательности, выбираемые среди
а) последовательности, выбираемой из числа аа) послед. No.1;
бб) послед. No.2; или
вв) послед. Nо.3; или
б) аллельного варианта, или модификации, или мутеина последовательности из послед. NoNo 1-3, и этот аллельный вариант, или модификация, или мутеин имеет, по существу, такую же активность, как Asp-паллидипин с послед. NoNo 1-3; или
в) белка, соответствующего послед. NoNo 1-3 или их вариантам или мутеинам, упомянутым в б), имеющим посттрансляционные модификации, которые, по существу, не влияют на активность зрелого белка.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному белку Asp-паллидипину, при этом Asp-паллидипин ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию трамбоцитов у млекопитающих, и при этом Asp-паллидипин содержит
(I) белок (паллидипин), выбираемый из группы паллидипиновых белков, и
(II) аминокислоту - аспарагиновую кислоту,
при этом аспарагиновая кислота соединяется пептидной связью с N-концевой областью палидипина;
на основе чего Asp-паллидипин имеет следующие аминокислотные последовательности:
а) последовательности, указанные в
аа) послед. No.1;
бб) послед. No.2; или
вв) послед. No.3; или
б) аллельные варианты или мутеины последовательностей в любой из послед. NoNo 1-3, и эти аллельные варианты или мутеины, по существу, не влияют на активность белка, или
в) белок, соответствующий любой из послед. NoNo 1-3, или их вариантам, или мутеинам, упомянутым в б), имеющим посттрансляционные модификации, которые, по существу, не влияют на активность зрелого белка;
при этом Asp-паллидипин продуцируется способом, включающим стадии
аа) трансфекции, по крайней мере, одной бактерии соответствующим вектором, при этом вектор содержит действующую связь
(I) первой молекулы ДНК или кДНК, кодирующей рекомбинантный Asp-паллидипин,
(II) второй молекулы ДНК, кодирующей подходящую сигнальную пептидную последовательность, и
(III) подходящего промотора;
вследствие чего при экспрессии препротеин, содержащий сигнальный пептид и Asp-паллидипин, расщепляется таким образом, что аминокислота - аспарагиновая кислота - находится вположении +1 аминокислотной последовательности зрелого Asp-паллидипина,
бб) экспрессии препротеина, содержащего Asp-паллидипин и сигнальную пептидную последовательность;
вв) переноса Asp-паллидипина из цитоплазмы бактерии в периплазму, в соответствии с чем во время переноса расщепление препротеина, по крайней мере, одной протеазой продуцирует зрелый Asp-паллидипин;
гг) выделения Asp-паллидипина посредством экстрагирования периплазмы; и
дд) очистки Asp-паллидипина.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения Asp-паллидипин получают по способу, включающему стадии
культивирования бактерии, трансфецированной соответствующим вектором, при этом вектор содержит действующую связь
(I) первой молекулы ДНК или кДНК, кодирующей рекомбинантный Asp-паллидипин,
(II) второй молекулы ДНК, кодирующей подходящую сигнальную пептидную последовательность, и
(III) подходящего промотора;
вследствие чего при экспрессии препротеин, содержащий сигнальный пептид и Asp-паллидипин, расщепляется таким образом, что аминокислота - аспарагиновая кислота - находится в положении +1 аминокислотной последовательности зрелого Asp-паллидипина,
при условиях, вследствие которых
экспрессируется препротеин, содержащий Asp-паллидипин и сигнальную пептидную последовательность, и
Asp-паллидипин переносится из цитоплазмы бактерии к периплазме, вследствие чего расщепление препротеина, по крайней мере, одной протеазой во время переноса продуцирует зрелый Asp-паллидипин, и
очистки Asp-паллидипина из периплазмы.

Предпочтительным является белок, в котором сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность щелочной фосфатазы (АР), предпочтительно - АР E.coli,
Промышленным применением белков по изобретению является использование белков в фармацевтической композиции, содержащей белок, соответствующий изобретению, в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Аллельные вариации или модификации, упомянутые ранее, включают изменение в последовательности нуклеотидов или аминокислот. изменение генотипа или фенотипа. По крайней мере, один нуклеотид или одна аминокислота может быть замещена, вырезана или вставлена.

Не ожидается, что большинство делеций, инсерций и замещений продуцирует радикальные изменения в характеристиках белка изобретения. Модифицированные или мутированные белки, соответствующие изобретению, могут быть получены традиционно и скринированы, чтобы определить точное действие замещения, делеции или инсерций посредством сравнения функций модифицированного или мутированного белка с характерными функциями белка изобретения, например белков послед. NoNo 1-3, или с нативным Asp-паллидипином, причем посредством этого определяют, имеет ли измененный белок сравнимую активность, например биологическую активность.

Генетический код является вырожденным; иными словами, большинство аминокислот кодируются несколькими кодонами из трех нуклеотидов. Соответственно, аллельная вариация или модификация в нуклеотидной последовательности может или не может изменить аминокислотную последовательность. Следовательно, аллельные вариации существуют, в первую очередь, на уровне ДНК и также могут существовать, во вторую очередь, на уровне аминокислотной последовательности.

Последовательность ДНК, кодирующая белок изобретения, может быть модифицирована обычными методами для продуцирования вариаций конечного белка изобретения, которые еще имеют, по существу, ту же активность, что белок изобретения, например Asp-паллидипин с послед. NoNo 1-3, или как у нативного паллидипинового белка. Активность измеряется в соответствии с примерами. Так, одна или несколько аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. . . - до 15 аминокислот - могут быть добавлены, замещены или удалены без существенного влияния на активность белка изобретения. Замещения могут быть осуществлены, в основном, в соответствии с приведенной ниже таблицей 1, когда желательно тонко модулировать аминокислотную последовательность белка изобретения.

Существенные изменения в функции или иммунологической идентичности могут быть осуществлены путем селективных замещений, которые менее консервативны, чем замещения в табл.1, т.е. селекцией остатков, которые более существенно отличаются по своему действию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замещения, например конформации листа или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы, или (в) объема боковых цепей.

Мутеины определяются гомологией двух сравниваемых белков. Экспрессионная "гомология" включает подобие аминокислот и пробелов в последовательностях обеих сравниваемых последовательностей. Подобие аминокислот определяется, например, в табл.1. Предпочтительно, мутеины настоящего изобретения содержат последовательность аминокислот, имеющую гомологию по крайней мере 60%, предпочтительнее по крайней мере 80%, еще предпочтительнее по крайней мере 90% и наиболее предпочтительно по крайней мере 95%, с последовательностью одного из белков с послед. No.No. 1-3.

"Посттрансляционными вариациями", упоминавшимися выше, называются вариации во время или после трансляции, такие как образование дисульфидных мостиков и химических модификаций аминокислот.

Белки часто образуют ковалентные внутрецепные связи. Такие дисульфидные связи образуются между цистеин-SH аминокислотами в сложенном белке или в белке, который складывается во время трансляции. Связи стабилизируют трехмерную структуру белка. Такие дисульфидные связи редко образуются в молекулах белка, которые все еще находятся в клеточном цитозоле, поскольку высокая внутримолекулярная концентрация -SS-(дисульфид)-восстанавливающего агента глутатиона разрушает большую часть таких связей. Как только белки оказываются вне цитоплазмы, секретируются или находятся на клеточной поверхности, они часто образуют дополнительные ковалентные внутрицепные связи.

Кроме того, аминокислоты могут быть изменены так, как описано в заявке РСТ ВОИС 91/10684. Возможны другие изменения боковых цепей аминокислот.

Белок изобретения имеет чистоту по крайней мере 40%, предпочтительно по крайней мере 60%, предпочтительнее по крайней мере 80% и наиболее предпочтительно по крайней мере 90%. Чистота определяется количеством белка изобретения по отношению к общему количеству белка. При использовании методов очистки, описанных в примерах, не обнаруживается никаких иных белков, кроме белков изобретения.

Используя очищенный белок изобретения, можно продуцировать моноклональные антитела в соответствии с хорошо известным способом Кехлера и Милштейна (Koehler and Milstein), который, в частности, включает обычную иммунизацию мышей или кроликов очищенным белком изобретения как иммуногеном с последующим продуцированием гибридом из продуцирующих антитела клеток мыши или кролика.

Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является белок, упоминаемый в послед. 1, экспрессируемый в штамме Е 15 Е. coli.

Аsр-паллидипин обнаруживает фармакологическую активность и может, следовательно, быть полезным в качестве фармацевтического препарата. Аsр-паллидипин может использоваться в фармацевтической композиции, содержащей Аsр-паллидипин в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически активный Аsр-паллидипин, соответствующий изобретению, и фармацевтически приемлемую соль или фармацевтически приемлемый носитель.

В частности, Аsр-паллидипин ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов и ингибирует адгезию опухолевых клеток, предпочтительно метастатических опухолевых клеток, к коллагену.

Аsр-паллидипин ингибирует агрегацию тромбоцитов. Система испытаний описана в примерах. Аsр-паллидипин существенно ингибирует агрегацию тромбоцитов при концентрации белка 0,5-50 мкг. Наиболее предпочтительный Аsр-паллидипин - белок послед. 1 имеет, в соответствии с примерами, IC₅₀ порядка 50 нмоль/л хорошо очищенного белка. Аsр-паллидипин ингибирует агрегацию тромбоцитов при концентрации от 5 нмоль/л до 1000 нмоль/л.

Результаты, полученные при испытаниях in vitro, показывают, что белки изобретения могут использоваться в качестве лекарственных средств или могут использоваться для консервативного лечения. Результаты испытаний, полученные в системе in vitro, могут быть соотнесены с результатами в системе in vivo, поскольку это признанная система в этой области техники. См. R.J. Shebuski et al. (1990), Thrombosis and Haemostasis, 64:576-581.

Asp-паллидипин может вводиться интраперитонеальными инъекциями, которые могут даваться ежесуточно или 2-3 раза в неделю. Когда животные получают ежесуточные инъекции, чтобы достичь концентрации в крови 100 нмоль/л, у них уменьшается агрегация тромбоцитов. При этих условиях не отмечается никаких серьезных побочных эффектов. Asp-паллидипин вызывает такое подавление агрегации тромбоцитов у мышей при ежесуточном дозировании, при котором достигается концентрация в крови от 10 нмоль/л до 1000 нмоль/л.

Asp-паллилипин, следовательно, пригоден для лечения повреждений при атеросклеротических или тромботических заболеваниях или для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда. Asp-паллидипин может использоваться в качестве антиатеросклеротического и антитромботического средства для млекопитающих, включая человека, например для лечения атеросклеротических/тромботических повреждений, например, вследствие разрыва атеросклеротических бляшек или вследствие пертурбации или удаления эндотелия, например при сепсисе или пересадке, или для лечения нестабильной стенокардии. Он также может применяться для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда фибринолизом или ангиопластикой (РТСА). Если для лечения инфаркта миокарда применяется фибринолитическая терапия (со стрептокиназой, t-PA или другими активаторами плазминогена), Аsр-паллидипин может использоваться в качестве вспомогательного средства для предупреждения реокклюзии кровеносного сосуда. Лечение инфаркта миокарда с использованием катетера-баллона Фогарти (РТСА) также повреждает стенки сосуда, и это обстоятельство может привести к образованию новых тромбов. Это явление можно предотвратить путем введения Аsр-паллидипина во время или после процедуры. Аsр-паллидипин может применяться при пластической операции на коронарных сосудах, а также при других случаях ангиопластики.

Настоящее изобретение относится
а) к применению белка изобретения для производства лекарственного средства для лечения атеросклеротического или тромботического заболевания или для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда (таким образом, белки пригодны в качестве профилактических эффективных лекарственных средств для лечения пациентов, у которых, известно, существует опасность развития заболевания или болезненного состояния);
б) к способу лечения атеросклеротического или тромботического заболевания или предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда, который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, подавляющего заболевание эффективного количества белка изобретения;
в) к фармацевтической композиции для лечения атеросклеротического или тромботического заболевания или для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда, которая содержит белок изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

При таких показаниях соответствующая дозировка будет, конечно, меняться в зависимости от, например, используемого соединения изобретения, реципиента, способа введения и природы и тяжести состояния, которое лечат. Однако показано, что, как правило, удовлетворительные результаты на животных получают при ежесуточных дозировках, при которых достигается концентрация соединения в крови от 10 до 1000 нмоль/л, предпочтительно при ежесуточных дозировках от 30 до 300 нмоль/л.

Белки изобретения можно вводить любым обычным способом, в частности энтерально или парентерально, например, в форме растворов или суспензий для инъекций. Предпочтительны интраперитонеальные инъекции.

Предпочтительным соединением является белок с послед. 1.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения изобретения в сочетании с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции могут быть изготовлены обычными способами. См. Remington's Pharmaceutical Science, 15^th ed. Mack Publiching Company, Easton Pennsylvania (1980).

Белки изобретения также ингибируют адгезию метастатических раковых клеток к коллагену. Система испытаний описана в примерах. Белки изобретения обнаруживают существенное подавление адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену при концентрации белка 1-100 мкг.

При испытаниях наиболее предпочтительного белка - белка с послед. 1 получают величину IC₅₀ для высокочистого белка 100 нмоль/л, согласно примерам 2 и 15. Белки изобретения показывают подавление адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену при концентрации от 10 до 2000 нмоль/л.

Результаты, полученные в тест-системах in vitro, показывают, что белки изобретения могут использоваться в качестве лекарственного средства или могут применяться для консервативного лечения. Результаты проверок могут быть перенесены от системы in vitro на систему in vivo, поскольку это признанная система в этой области техники. См. Chan et al. (1990), Science, 2:1600-1602.

Белки изобретения могут вводиться во время и после хирургических операций первичной опухоли для предупреждения образования метастазов отделившимися опухолевыми клетками, которые могут проникнуть в кровоток во время операции. Такое антиметастатическое действие может быть показано на "экспериментальной" и "спонтанной" животной модели, как описано в Chan et al. (1990), Science, 2:1600-1602.

Белки изобретения можно вводить интраперитонеальными инъекциями, которые даются ежесуточно или 2-3 раза в неделю. Когда животные получают ежесуточные инъекции, при которых достигается концентрация в крови порядка 200 нмоль/л, у них уменьшается адгезия метастатических опухолевых клеток, измеренная путем оценки очагов осажденных метастатических клеток. При этих условиях не отмечается никаких серьезных побочных эффектов.

Белки изобретения показывают такое подавление адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену у мышей при ежесуточных дозировках для достижения концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно концентрации от 60 до 600 нмоль/л.

Белки изобретения являются, следовательно, пригодными для лечения рака, особенно рака с метастатическими опухолевыми клетками, наиболее предпочтительно рака с высокометастатическими опухолевыми клетками.

Таким образом, настоящее изобретение относится
а) к применению белка изобретения для производства лекарственного средства для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками (белки, таким образом, пригодны для профилактически эффективных лекарственных средств, вводимых перед, например, хирургическим удалением опухолей);
б) к способу лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, подавляющего заболевание эффективного количества белка изобретения;
в) к фармацевтической композиции для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, которая содержит белок изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

При таких показаниях соответствующая дозировка будет, конечно, меняться в зависимости от, например, используемого соединения изобретения, реципиента, способа введения и природы и тяжести состояния, которое лечат. Однако показано, что, как правило, удовлетворительные результаты на животных получают при ежесуточных дозировках, при которых достигается концентрация соединения в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно при ежесуточных дозировках от 60 до 600 нмоль/л.

Белки изобретения можно вводить любым обычным способом, в частности энтерально или парентерально, например, в форме растворов или суспензий для инъекций.

Предпочтительным соединением является белок с послед. 1.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения изобретения в сочетании с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. Такие композиции могут быть изготовлены обычными способами. См. Remington's Pharmaceutical Science, 15^th ed. Mack Publiching Company, Easton Pennsylvania (1980).

В своем другом аспекте настоящее изобретение относится к ДНК-последовательностям, векторам, содержащим эти последовательности, клеткам, содержащим упомянутые векторы, способам рекомбинантного продуцирования белков и антител к белкам изобретения. Оно также относится к выделенным и/или рекомбинантным ДНК-последовательностям (например, геномным или кДНК), кодирующим белок, который ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию человеческих тромбоцитов. Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к белкам настоящего изобретения, продуцируемым рекомбинантным методом, т.е. к белкам, имеющим описанные здесь последовательности.

Термин "выделенный" означает, что ингибитор по настоящему изобретению или другая сущность находится в форме, отделенной от (очищенной от) компонентов, с которыми ее продуцируют рекомбинантным методом или синтетически. Включаются, вообще, все степени такого выделения или очистки. Предпочтительными являются степени выделения или очистки, вследствие которых ингибитор пригоден для фармацевтических целей. Например, такие степени выделения (например, активности или чистоты) могут быть достигнуты традиционно с помощью хроматографических методов таких, какие использованы в примерах. Дополнительная очистка, например, до гомогенного состояния, может быть осуществлена без проблем с использованием обычных способов, таких как способы, описанные в следующих публикациях.

Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academic Press 1990;
Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E.L.V. Harris and S. Angel, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Robert Scopes, Springer-Verlag 1982; и
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. Janson and L. Ryden, VCH publischers 1989.

Чистота может быть определена любым из многочисленных традиционных способов, например электрофорезом в полиакрила-мидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), аналитической ВЭЖХ и т.п. Очищенный ингибитор может применяться для определения аминокислотной последовательности белка по способам, совершенно обычным для рядового специалиста в этой области техники. См. Hewick, R.M. et al. (1981), J. Biol. Chem. 256, 7990-7997.

Аминокислотная последовательность ингибитора настоящего изобретения может использоваться для определения последовательности подходящих ДНК-зондов, которые могут применяться для поиска новых ингибиторов, например, в других видах. Такие зонды могут синтезироваться традиционными способами, например, с использованием автоматизированного синтезатора ДНК, и скрининг геномных или кДНК библиотек является, подобным образом, обычным для рядового специалиста в этой области техники. (См. международную публикацию ВОИС 90/07861, датированную 26 июля 1990).

Следовательно, настоящее изобретение также включает ДНК-последовательность, соответствующую (кодирующую) как ДНК-последовательности (гену) Аsр-паллидипина, когда он выделен из естественного окружения, например, в растворе или на векторе, а также его мутеинов. Способы продуцирования мутеинов также являются традиционными и обычными для рядового специалиста в этой области техники, как и способы скринирования для проверки эффективности таких новых белков, например такие, какие описаны здесь.

Подходящими мутеинами являются мутеины, имеющие по крайней мере фракцию, например, по крайне мере 5%, предпочтительно по крайней мере, 50%, наиболее предпочтительно по крайней мере, 90%, ингибитора с биологической активностью, например ингибитора индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, который описан здесь.

Также настоящее изобретение относится к способу очистки, при этом очистка включает следующие последовательные стадии:
(i) очистка катионообменной хроматографией;
(ii) очистка анионообменной хроматографией; и
(iii) очистка путем исключения размера.

Без дополнительных уточнений предполагается, что специалист в этой области техники может, используя предшествующее описание, использовать настоящее изобретение с наибольшей полнотой. Поэтому, приведенные ниже конкретные примеры осуществления изобретения должны истолковываться только как иллюстративные, а не как ограничивающие в какой-либо степени остальную часть описания.

В вышеупомянутой части и в последующих примерах все температуры приводятся в градусах по Цельсию; и, если нет других указаний, все части и проценты являются массовыми.

Все заявки, патенты и публикации, цитированные выше и далее, включая ЕР 94250224.6, зарегистрированную 2 сентября 1994, включены в настоящее в качестве ссылок.

ПРИМЕРЫ
Пример 1. Построение экспрессирующего вектора
Для построения вектора по изобретению, кодирующего Asp-паллидипин, используют следующие смысловые и антисмысловые праймеры:
р3:
5'-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3' (NruI)
(послед. 4); и
р4:
5'-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC- 3' (ВаmНI)
(послед. 5).

ПЦР представляет собой 8 циклов по 2 минуты при 94^oС, 1 минуту 30 секунд при 42^oС и 2 минуты 30 секунд при 72^oС, с использованием р3 и р4 в качестве праймерных пар и 1 мкг матричной ДНК. После очистки и переваривания с NruI и ВаmНI фрагмент субклонируют в pSB/pho. Плазмиду получают перевариванием ХmаI с последующей обработкой фасолью золотистой, чтобы дефосфорилировать 5'-выступ и перевариванием ВаmНI.

Конструкцию проверяют секвенированием полной ДНК вставленных фрагментов, используя метод дидезоксицепной терминации (F. Sanger et al. (1977), Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) и набор для секвенирования с [³⁵S]dATP (адениндезоксирибозо-5'-трифосфат). Трансформацию компетентной Е. coli, E15, паллидипиновой экспрессирующей конструкцией или пустой плазмидой (псевдотрансформацию) осуществляют, используя стандартные способы (J. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Пример 2. Экспрессия и экстракция Asp-паллидипина
Для плазмиды pSB/pho (происходящей от pSB94; см. J. Daum et al. (1989) Eur. J. Biochem. 185:347-354) в течение ночи культуры E15 (S.J. Hayashi et al. (1964) J. Biol. Chem. 239:3091-3106) разбавляют до 8% (о/о) в слабофосфатной среде и выращивают в течение 6 часов при 37^oС. (A. Becker et al. (1994) Protein Expression and Purification 5:50-56). Бактерии после индукции собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/10 объема 50 ммоль/л трис-НСl (рН 8,0)/100 ммоль/л NaCl. Этот препарат замораживают, оттаивают и центрифугируют, получая, таким образом, первую супернатантную фракцию (SN1). Бактериальный осадок ресуспендируют и перед центрифугированием уравновешивают в течение 10 минут при комнатной температуре в 0,5 моль/л сахарозы. Супернатант (SN2) сохраняют для анализа, в то время как осадок ресуспендируют в охлажденной льдом воде, в которую добавлен 1 ммоль/л PMSF (фенилметилсульфонилфторид), и инкубируют в течение 10 минут на льду. После такого осмотического шока клетки центрифугируют и собирают супернатант (SN3). Осадок, содержащий цитоплазматическую фракцию (CF), ресуспендируют в 50 ммоль/л трис-НСl (рН 8,0)/100 ммоль/л NaCl.

Пример 3. Очистка рекомбинантного Аsр-паллидипина
Супернатантную фракцию, содержащую массу рекомбинантного Аsр-паллидипина, (SN1), доводят до рН 4,0 уксусной кислотой и вносят в катионообменную колонку (Mono S, Pharmacia), используя систему FPLC. После промывания раствором NaCl с градиентом от 0 до 500 ммоль/л в ацетате натрия, рН 4,0, элюирования Аsр-паллидипина достигают при 20 ммоль/л NaPi, рН 7,0. Элюированные фракции, содержащие Аsр-паллидипин, что оценивается электрофорезом на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (PAGE) и иммуноблоттингом, соединяют, доводят рН до 8,0 и вносят в анионообменную колонку (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Элюирования Аsр-паллидипина достигают при градиенте NaCl от 0 до 1 ммоль/л в 20 ммоль/л ацетата натрия, рН 8,4. Для последней очистки фракции, содержащие Аsр-паллидипин, объединяют, концентрируют в Seed-Vac (Bachofer) и подвергают эксклюзионной хроматографии, используя суперозу 12 (Pharmacia).

Пример 4. Проверка агрегации тромбоцитов
Проверку осуществляют, по существу, так, как описано в публикации С. Noeske-Jungblut (С. Noeske-Jungblut (1994) J. Biol. Chem. 269:5050-5053). Коротко, человеческую кровь отбирают в 1/6 объема 71 ммоль/л лимонной кислоты/85 ммоль/л тринатрийцитрата/111 ммоль/л глюкозы. Обогащенную тромбоцитами плазму получают центрифугированием при 135 g в течение 20 минут. Перед добавлением коллагена (2 мкг/мл) Аsр-паллидипин инкубируют с 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 1 минуты при 37^oC. Агрегацию контролируют, используя агрегометр Micron, и определяют максимальную величину. Значение IC₅₀ составляет около 50 нм. Существенное различие между соединениями с и без Asp в первой позиции не может быть замечено.

Определяют биологическую активность и выход очищенного Аsр-паллидипина из периплазматического пространства Е. coli. Обогащенную тромбоцитами плазму инкубируют с Аsр-паллидипином и контрольными соединениями. Индуцируют агрегацию, добавляя коллаген. В качестве позитивного контроля используют очищенный паллидипин дикого типа, выделенный из пиявок. В качестве контрольных используют и ряд других конструкций, показывая преимущество изобретенного Аsр-паллидипина. Белок изобретения и контрольные соединения показывают различный выход (см. табл.2).

Пример 5. Адгезия опухолевых клеток к коллагену снижается в присутствии белка изобретения
Белок изобретения ингибирует адгезию опухолевых клеток к коллагеновой матрице. Следовательно, оседание мигрирующих опухолевых клеток в органах или кровеносных сосудах может быть предотвращено частично или полностью, когда в крови или плазме пациента присутствует белок изобретения.

Клетки MTLn3 (клетки опухоли молочной железы крысы) метят ⁵¹Сr. На луночный планшет в течение ночи при 4^oС наносят покрытие из коллагена (тип III). Сначала 2•10⁴ меченых клеток в 500 мкл среды DMEM F12, 20 ммоль/л Нереs, 1 ммоль/л бикарбоната, 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) инкубируют с 0, 2, 5 или 10 мкл белка изобретения ("суперозный пул", 0,5 мг белка на мл), соответственно, в течение 10 минут при 37^oС. Затем эту суспензию переносят на покрытый коллагеном луночный планшет и инкубируют в течение 2 часов при 37^oС. Затем лунки промывают, и прилипающие клетки удаляют 1 мол/л NaOH. Подсчитывают радиоактивность прилипающих клеток (см. табл. 3)
Пример 6. Продуцирование антител
Около 100 мкг очищенного в соответствии с примерами ингибитора добавляют к 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда, и эмульсию инъецируют подкожно (s.с.) кролику. Через 2 недели дают вторую инъекцию, состоящую из 80 мкг очищенного ингибитора и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. После инъекции отбирают несколько образцов сыворотки и проверяют продуцирование специфических антител. Анализ осуществляют Вестерн-блоттингом. Вносят 20 нг очищенного белка в полиакриламидный гель с 12,5% SDS и проводят электрофорез, блоттинг и детекцию по стандартным методам, описанным в Е. Harlowe, D. Lane, (1988) Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory (разведение проверяемой сыворотки 1:500, IgG, конъюгированный с козьей антикроличьей пероксидазой, как второе антитело, детекция с набором ECL от Amersham International, Amersham, UK). Блот показывает, что антисыворотка специфически реагирует с очищенным ингибитором.

Приведенные выше примеры можно повторить с равным успехом, замещая вообще или специфически описанные реагенты и/или оперируя с условиями настоящего изобретения для реагентов, описанных в приведенных выше примерах.

Основываясь на приведенном выше описании, специалист в этой области техники может легко установить существенные признаки настоящего изобретения и может, не отступая от его сущности и объема, осуществить различные изменения и модификации изобретения, чтобы приспособить для различного использования и условий.

Описание последовательностей (1-5) см. в конце описания.

Формула изобретения

1. Рекомбинантный белок Asp-паллидипин, способный ингибировать индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов у млекопитающих, содержащий аминокислотную последовательность паллидипина, выбранную из группы SEQ ID NO: 1-3, соединенную на N-конце паллидипина пептидной связью с Asp.

2. Способ производства рекомбинантного Asp-паллидипина, отличающийся тем, что конструируют вектор, содержащий ДНК или кДНК, кодирующую рекомбинантный Asp-паллидипин по п. 1, ДНК, кодирующую подходящую сигнальную пептидную последовательность и подходящий промотор, и обеспечивающий экспрессию препротеина и перенос его в периплазму с образованием зрелого Asp-паллидипина, имеющего аспарагиновую кислоту в положении +1 аминокислотной последовательности, затем полученный вектор трансформируют в бактериальную клетку, трансформированную бактериальную клетку культивируют с последующим выделением Asp-паллидипина из периплазмы экстрагированием и очисткой.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, кодирует сигнальную последовательность щелочной фосфатазы (АР).

4. Способ по п. 2 или 3, отличающийся тем, что бактерия представляет собой Е. coli.

5. Рекомбинантный белок по п. 1, отличающийся тем, что получен способом по п. 2.

6. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения атеросклеротического или тромботического заболевания или для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда или для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, содержащая эффективное количество Asp-паллидипина по п. 1 или 5 в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

7. Рекомбинантный белок для производства лекарственного средства для лечения атеросклеротического или тромботического заболевания или для предупреждения реокклюзии после лечения инфаркта миокарда, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок представляет собой Asp-паллидипин по п. 1 или 5.

8. Рекомбинантный белок для производства лекарственного средства для лечения рака с метастатическими опухолевыми клетками, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок представляет собой Asp-паллидипин по п. 1 или 5.

9. Способ очистки рекомбинантного Asp-паллидипина, отличающийся тем, что рекомбинантный Asp-паллидипин по п. 1 экстрагируют из трансформированных клеток бактерий и очищают последовательно путем катионообменной, анионообменной и эксклюзивной хроматографии.

10. Рекомбинантный вектор для экспрессии Asp-паллидипина, содержащий ДНК или кДНК, кодирующую рекомбинантный Asp-паллидипин по п. 1, находящуюся в действующей связи с ДНК, кодирующей подходящую сигнальную пептидную последовательность, и подходящий промотор, и обеспечивающий экспрессию в соответствующем бактериальном хозяине препротеина и его расщепление с образованием зрелого Asp-паллидипина, имеющего аспарагиновую кислоту в положении +1 аминокислотной последовательности.

11. Штамм Escherichia coli, трансформированный вектором по п. 10, используемый для экспрессии Asp-паллидипина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7