Способ получения диагностических коклюшных сывороток к агглютиногенам 1,2,3 для реакции агглютинации (варианты)

 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения диагностических коклюшных сывороток к агглютиногенам 1,2,3 для реакции агглютинации. Сущность изобретения: в способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 1 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,0 или 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком убитой коклюшной культуры того же серовара и осадком живой паракоклюшной культуры. В способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 2 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком живой коклюшной культуры и осадком живой паракоклюшной культуры. В способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 3 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,3 адсорбируют осадком живой коклюшной культуры. Адсорбцию каждой сыворотки проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах. Преимущество заключается в том, что полученные сыворотки обладают высокой специфичностью, высоким титром в РА не ниже 1:25 на предметном стекле и 1:1280 - в PA на планшетах. Они являются стандартными сухими препаратами с массой влаги не выше 3%. 3 с. и 7 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения сывороток диагностических коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3, адсорбированных, сухих для реакции агглютинации (РА), используемых для серологической идентификации бактерий Bordetella pertussis в реакции агглютинизации, дифференциации культур коклюшных микробов по видам и сероварам.

Известен способ получения диагностических коклюшных сывороток к агглютиногену 1 (Eldering G., Eveland W.C., Kendrick P.L., Ibid., 1962, v.83, p. 745), включающий использование рабочей схемы, характеризующей взаимоотношения антигенных факторов культур Bordetella, составленной ранее этими же авторами на основании результатов опытов перекрестной сорбции и агглютинации.

В качестве ближайшего аналога принят способ получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 1 (М.С. Захарова, О.П. Панова-Стоянова "Специфические видовые антисыворотки для представителей рода Bordetella", ЖМЭИ, 1965, 6, с.60-64), разработанный на основе схемы Eldering G., Eveland W.C., Kendrick P.L.

Способ заключается в том, что производят подбор и культивирование штаммов для адсорбции антибактериальной гипериммунной сыворотки, которую проводят путем тщательного перемешивания смеси сыворотки и соответствующей культуры клеток в равных объемах и прогревания на водяной бане при температуре 37^oС в течение 4 часов с последующим центрифугированием. Полученную надосадочную жидкость используют в реакции агглютинации с соответствующими культурами для проверки полноты сорбции. Для получения сыворотки коклюшной к агглютиногену 1 используют гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу (В. pertussis, штамм 22402). Адсорбцию проводят в несколько этапов с использованием прогретой при 100^oС в течение 2,5 часов микробной взвеси штамма B.pertussis 22402; надосадочной жидкости этой же культуры; культуры штамма В. bronchiseptica 899.

Недостатком известного способа является то, что адсорбцию проводят суспензией микробной культуры, в результате происходит разведение и снижение титра сыворотки.

Кроме того, при получении сыворотки коклюшной используют надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования прогретой при температуре 100^oС в течение 2,5 часов микробной взвеси, что приводит к снижению титра и увеличению доз микробов для сорбции. Гомогенизацию суспензии на шуттель-аппарате не применяют. В итоге получают жидкие сыворотки со сроком годности 1 год.

Разброс титра в РА составляет 1:80-1:320.

Задачей изобретения является создание более простого способа получения стандартных сывороток коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3, обладающих высокой специфичностью, более высоким титром и более длительным сроком годности.

Поставленная задача решается следующим образом.

Вариант 1.

В способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 1 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,0 или 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком убитой коклюшной культуры того же серовара и осадком живой паракоклюшной культуры, при этом каждую адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

Используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

Для адсорбции используют штамм Bordetella parapertussis 402 или 17903.

Вариант 2.

В способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 2 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком живой коклюшной культуры и осадком живой паракоклюшной культуры, при этом каждую адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

Используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

Для адсорбции используют штамм Bordetella pertussis серовара 1,0,3 160 или 5373 и штамм Bordetella parapertussis 402 или 17903.

Вариант 3.

В способе получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 3 для реакции агглютинации гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,3 последовательно адсорбируют осадком живой коклюшной культуры и осадком живой паракоклюшной культуры, при этом каждую адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

Используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

Для адсорбции используют штамм Bordetella pertussis серовара 1,2,0 38 или 21487 и штамм Bordetella parapertussis 402 или 17903.

Адсорбцию сыворотки осадком живой паракоклюшной культуры проводят при наличии в ней антител.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Полученные сыворотки обладают высокой специфичностью, высоким титром в РА не ниже 1:25 на предметном стекле и 1:1280 - в PA на планшетах. Они являются стандартными сухими препаратами по 0,5 мл в ампуле, с массой влаги не выше 3%. Срок годности увеличивается до 3 лет (по сравнению с 1 годом срока годности жидких сывороток) за счет лиофильного высушивания.

Способ получения более простой и менее трудоемкий за счет соответствующего подбора серотипов коклюшных штаммов для адсорбции и применения технических приемов.

Технический результат достигается за счет того, что: - проводят осаждение микробных клеток перед адсорбцией путем центрифугирования; - применяют гомогенизацию смеси сыворотки и микробной массы при проведении адсорбции; - адсорбцию осуществляют меньшей дозой микробов; - в работе применяют гипериммунные ослиные сыворотки, высокоспецифичные и с высоким титром; - в результате специально проведенных исследований получены сыворотки к факторам 2 и 3; - применен метод лиофильного высушивания.

Способ осуществляется следующим способом: Вариант 1.

Для получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 1 для реакции агглютинации используют ослиную или баранью антибактериальную гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,0 или 1,2,0. Адсорбцию гетерологичных антител из сыворотки проводят последовательно в два этапа - сначала автоклавированной взвесью коклюшного штамма серовара 1,0,0 ( 353 или 5609) или 1,2,0 ( 38 или 21487), а затем живой культурой паракоклюшного микроба. Процесс начинают с восстановления штамма коклюшного микроба высевом на среду Борде-Жангу (БЖ) или казеиново-угольный агар (КУА) с добавлением 5% крови человека (генерация 1). Выращивание производят в термостате при температуре (36±1)^oС в течение 48-72 часов. При тех же условиях проводят второй пассаж и пересевают культуры в пробирки со средой КУА, выращивание проводят при тех же условиях (генерация 2). Выросшую культуру контролируют на чистоту и пересевают на матрацы со средой КУА. Выращивание производят в течение 48 часов при температуре (36±1)^oС. Микробную массу смывают 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,0-7,2. Микробную суспензию прогревают при температуре 120^oС в течение 1 часа для разрушения термостабильных антигенов и отделяют осадок путем центрифугирования в течение 3-х часов при 3000 об/мин. Осадок убитой коклюшной культуры используют для адсорбции из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1:3000 - 1:5000. Смесь гомогенизируют путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4 часов при температуре (36±1)^oС, затем оставляют в холодильнике и выдерживают в течение 18 часов при температуре (5±3)^oС.

Полученную суспензию подвергают центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно сливают.

Процесс выращивания паракоклюшной культуры - штаммы 402 или 17903 (8, 9, 10, 14) - аналогичен процессу выращивания коклюшной культуры. Микробную массу смывают 0,9% раствором натрия хлорида и отделяют осадок путем центрифугирования в течение 3 часов при 3000 об/мин.

Полученную сыворотку после первой адсорбции соединяют стерильно с осадком живой паракоклюшной культуры из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки. Адсорбцию осуществляют при тех же условиях. Сыворотку отделяют от осадка путем центрифугирования, сливают ее в стерильных условиях и добавляют к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

Проводят контроль готовой сыворотки на стерильность (ГФ Х 1, выпуск 2, стр.187), физические свойства (ГФ XI, выпуск 1, стр.176), определение специфической активности (рабочее разведение) и полноту сорбции.

Специфическую активность готового препарата определяют в реакции агглютинации на стекле со штаммами коклюшного микроба, содержащими соответствующие агглютиногены. Полноту сорбции гетерологичных антител проверяют со штаммами паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Сыворотка диагностическая коклюшная к агглютиногену 1 должна агглютинировать культуры коклюшного микроба всех сероваров и не агглютинировать культуры паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Сыворотку разливают в ампулы по 0,5 мл, лиофильно высушивают и запаивают при пониженном давлении. В результате получают стандартный, специфический, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле не ниже 1:25, в РА на планшетах - не ниже 1:1280.

Пример 1. Для получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 1 использовали гипериммунную сыворотку осла к коклюшному микробу серовара 1,2,0, а для ее адсорбции - коклюшный штамм того же серовара 1,2,0 353 и паракоклюшный штамм 17903 (8,9,10,14).

Провели культивирование штаммов, отобранных для адсорбции.

Выращенную микробную массу смыли 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,0. Суспензию коклюшной культуры прогрели при температуре 120^oС в течение 1 часа, осадок убитой коклюшной культуры отделили центрифугированием в течение 3 часов при 3000 об/мин и использовали его для адсорбции из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1:5000. Смесь гомогенизировали путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4-х часов при температуре 37^oС, затем выдержали в холодильнике 18 часов при температуре 5^oС. Полученную суспензию подвергли центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно слили.

Полученную сыворотку соединили в стерильных условиях с осадком живой паракоклюшной культуры, полученным путем центрифугирования, из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки. Адсорбцию проводили при тех же условиях. Осадок отделили путем центрифугирования. Сыворотку стерильно слили и добавили к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

После проведения контроля готовой сыворотки на стерильность, физические свойства, специфическую активность и полноту сорбции ее разлили в ампулы и подвергли лиофильному высушиванию.

Получен стандартный, специфичный, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле 1:25, в РА на планшетах - 1:1280.

Вариант 2.

Для получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 2 для реакции агглютинации используют ослиную или баранью антибактериальную гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,2,0. Для проведения последовательной адсорбции гетерологичных антител из сыворотки используют коклюшный штамм серовара 1,0,3 160 или 5373 и паракоклюшный штамм 402 или 17903.

Процесс выращивания коклюшной культуры аналогичен варианту 1.

Микробную массу смывают 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,0-7,2. Прогревание исключают. Микробную суспензию подвергают центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин. Осадок живой коклюшной культуры используют для адсорбции из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1: 3000 - 1:5000. Смесь гомогенизируют путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4 часов при температуре (36±1)^oС, затем выдерживают в холодильнике в течение 18 часов при температуре (5±3)^oС.

Полученную суспензию подвергают центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно сливают.

Процесс выращивания паракоклюшной культуры (штаммы 402 или 17903 (8, 9, 10, 14) аналогичен процессу выращивания коклюшной культуры. Микробную массу смывают 0,9% раствором натрия хлорида и отделяют осадок путем центрифугирования в течение 3-х часов при 3000 об/мин.

Полученную сыворотку после первой адсорбции соединяют стерильно с осадком живой паракоклюшной культуры из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки. Адсорбцию осуществляют при тех же условиях. Сыворотку отделяют от осадка путем центрифугирования, сливают ее в стерильных условиях и добавляют к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

Проводят контроль готовой сыворотки на стерильность, физические свойства, определение специфической активности (рабочее разведение) и полноту сорбции.

Специфическую активность готового препарата определяют в реакции агглютинации на стекле со штаммами коклюшного микроба, содержащими соответствующие агглютиногены. Полноту сорбции гетерологичных антител проверяют со штаммами паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Сыворотка диагностическая коклюшная к агтлютиногену 2 должна агглютинировать коклюшные культуры сероваров 1, 2, 3 и 1, 2, 0 и не агглютинировать культуры паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Сыворотку лиофильно высушивают в ампулах. В результате получают стандартный, специфический, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле не ниже 1:25, в РА на планшетах - не ниже 1:1280.

Пример 2. Для получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 2 использовали гипериммунную сыворотку барана к коклюшному микробу серовара 1,2,0, а для ее адсорбции - коклюшный штамм серовара 1,0,3 160 и паракоклюшный штамм 402.

Провели культивирование штаммов, отобранных для адсорбции.

Выращенную микробную массу смыли 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2. Суспензию коклюшной культуры подвергли центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин. Полученный осадок живой коклюшной культуры использовали для адсорбции из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1:5000. Смесь гомогенизировали путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4-х часов при температуре 37^oС, затем выдержали в холодильнике 18 часов при температуре 8^oС. Полученную суспензию подвергли центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин, сыворотку стерильно слили.

Сыворотку соединили в стерильных условиях с осадком живой паракоклюшной культуры, полученным путем центрифугирования, из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки. Адсорбцию проводили при тех же условиях. Осадок отделили путем центрифугирования. Сыворотку стерильно слили и добавили к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

После проведения контроля готовой сыворотки на стерильность, физические свойства, специфическую активность и полноту сорбции ее разлили в ампулы и подвергли лиофильному высушиванию.

Получен стандартный, специфичный, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле 1:25, в РА на планшетах - 1:1280.

Вариант 3.

При получении диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 3 для реакции агглютинации используют ослиную или баранью антибактериальную гипериммунную сыворотку к коклюшному штамму серовара 1,0,3, 267, а для адсорбции гетерологичных антител из сыворотки - коклюшный штамм серовара 1,2,0 38 или 21487.

Выращенную микробную массу (аналогично варианту 1) смывают 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,0-7,2). Прогревание исключают. Микробную суспензию подвергают центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин.

Определяют титр гипериммунной сыворотки, разводят ее физиологическим раствором (рН 7,0) до титра 1:3000 - 1:5000. Затем в стерильных условиях небольшими порциями с помешиванием добавляют ее в центрифужные стаканы с осадком живых микробных клеток из расчета 2000 млрд. на 1 мл сыворотки. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой и переносят в колбу, которую ставят на шуттель-аппарат и проводят гомогенизацию смеси при температуре (36±1)^oС в течение 4 часов.

После проведения адсорбции смесь в колбе выдерживают в холодильнике при температуре (5±3)^oС в течение 18 часов, после чего ее подвергают центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин. Сыворотку отделяют в стерильных условиях.

В полученную сыворотку добавляют консервант мертиолят из расчета 1:10000 (100 мкг/мл)±10%.

Проводят контроль готовой сыворотки на стерильность, физические свойства, определение специфической активности (рабочее разведение) и полноту сорбции.

Специфическую активность готового препарата определяют в реакции агглютинации на стекле со штаммами коклюшного микроба, содержащими соответствующие агглютиногены. Полноту сорбции гетерологичных антител проверяют со штаммами паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Готовая сыворотка к агглютиногену 3 должна агглютинировать коклюшные культуры сероваров 1,2,3 и 1,0,3 и не агглютинировать культуры паракоклюшного и бронхисептикозного микробов.

Дополнительную адсорбцию полученной сыворотки осадком живой паракоклюшной культуры (штамм 402 или 17903) проводят только при наличии к ней антител. В этом случае адсорбцию и последующее стерильное отделение сыворотки проводят при тех же условиях.

Сыворотку лиофильно высушивают в ампулах. В результате получают стандартный, специфический, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле не ниже 1:25, в РА на планшетах - не ниже 1:1280.

Пример 3. Для получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену 3 использовали гипериммунную сыворотку барана к коклюшному штамму серовара 1,0,3 267, а для ее адсорбции - коклюшный штамм серовара 1,2,0 38.

Выращенную микробную массу смыли 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,0. Микробную суспензию подвергли центрифугированию в течение 3 часов при 3000 об/мин. Полученный осадок живой коклюшной культуры использовали для адсорбции из расчета 2000 млрд. микробных клеток на 1 мл сыворотки, разведенной до титра 1: 5000. Смесь гомогенизировали путем растирания в шуттель-аппарате в течение 4-х часов при температуре 37^oС, затем выдержали в холодильнике 18 часов при температуре 8^oС. Полученную суспензию подвергли центрифугированию в течение 3-х часов при 3000 об/мин, сыворотку слили в стерильных условиях, добавили к ней консервант мертиолят из расчета 1:10000.

Провели контроль сыворотки на стерильность, физические свойства, специфическую активность и полноту сорбции.

Дополнительную адсорбцию сыворотки не проводили в связи с отсутствием в ней антител к паракоклюшному микробу.

Получен стандартный, специфичный, высокоактивный препарат с титром в РА на предметном стекле 1:25, в РА на планшетах - 1:1280.

Предлагаемый набор диагностических сывороток позволяет поставить диагноз заболевания коклюшем экспресс методом в течение 3-5 минут, определить серотип используемых в работе коклюшных штаммов, сравнить исследуемые коклюшные штаммы по их активности.

Формула изобретения

1. Способ получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену для реакции агглютинации, отличающийся тем, что для получения диагностической сыворотки к агглютиногену 1 гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,0 или 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком убитой коклюшной культуры того же серовара и осадком живой паракоклюшной культуры, при этом каждую адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что для адсорбции используют штамм Bordetella parapertussis 402 или 17903.

4. Способ получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену для реакции агглютинации, отличающийся тем, что для получения диагностической сыворотки к агглютиногену 2 гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,2,0 последовательно адсорбируют осадком живой коклюшной культуры и осадком живой паракоклюшной культуры, при этом каждую адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

6. Способ по пп. 4 и 5, отличающийся тем, что для адсорбции используют штамм Bordetella pertussis серовара 1,0,3 160 или 5373 и штамм Bordetella parapertussis 402 или 17903.

7. Способ получения диагностической коклюшной сыворотки к агглютиногену для реакции агглютинации, отличающийся тем, что для получения диагностической сыворотки к агглютиногену 3 гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу серовара 1,0,3 адсорбируют осадком живой коклюшной культуры, при этом адсорбцию проводят путем гомогенизации с последующим отделением сыворотки в стерильных условиях, а готовую сыворотку лиофильно высушивают в ампулах.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что используют ослиную или баранью гипериммунную сыворотку к коклюшному микробу.

9. Способ по пп. 7 и 8, отличающийся тем, что адсорбцию сыворотки осадком живой паракоклюшной культуры проводят при наличии в ней антител.

10. Способ по пп. 7-9, отличающийся тем, что для адсорбции используют штамм Bordetella pertussis серовара 1,2,0 38 или 21487 и штаммы Bordetella parapertussis 402 или 17903.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (RU)

Адрес для переписки:
123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Извещение опубликовано: 10.02.2010        БИ: 04/2010