Препараты крови для трансфузии и способ их получения

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к получению препаратов крови, а именно свежезамороженной плазмы и эритроцитной массы, использующихся для гемотрансфузий при лечении пациентов с заболеваниями различного генеза, а также способа их получения. Сущность изобретения заключается в том, что кровь, полученную от доноров, собирают стерильно в строенные полимерные контейнеры, содержащие консервант крови СРDA-1 и не позднее 2-5 ч с момента сбора крови проводят низкоскоростное центрифугирование при 2500-3500•g в течение 15-20 мин при температуре 22-24^oС, в результате центрифугирования происходит одномоментное разделение крови на плазму, эритроцитную массу и лейкотромбослой. Полученная указанным способом плазма содержит форменные элементы крови в следующем количестве: эритроциты 2,0-4,0•10⁸/л, лейкоциты 5,5-9,5•10⁶/л, тромбоциты 3,5-5,5•10⁹/л, активность фактора VIII 0,7-1,6 МЕ/мл, содержание общего белка равно 55-65 мг/мл. Концентрация гемоглобина в эритроцитной массе составляет 250-270 г/л, показатель гематокрита - 76-80%, содержание лейкоцитов - 5,4-6,4•10⁹/л, тромбоцитов - 120-156•10⁹/л. Плазму замораживают при температуре 40-45^oС в течение 30-40 мин и хранят в течение 12-24 месяцев. Эритроцитную массу охлаждают при температуре 2-4^oС и хранят до использования в течение 35-42 дней. Преимущество изобретения в улучшении качества продуктов. 3 с. и 3 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к получению препаратов крови, а именно свежезамороженной плазмы и эритроцитной массы, использующихся для гемотрансфузий при лечении пациентов с заболеваниями различного генеза.

Известен способ получения плазмы крови путем плазмафереза с последующей гепаринпреципитацией при температуре -20-35^oС и сорбции супернатанта размороженной плазмы (1).

Недостатком указанного способа является его низкая воспроизводимость, ограниченность источников сырья для получения целевого продукта, возможность бактериального контаминирования на всех этапах приготовления.

Еще одним недостатком этого способа является сложность получения целевого продукта, обусловленная необходимостью наличия дорогостоящего оборудования для проведения плазмафереза.

Известен способ получения свежезамороженной плазмы и эритроцитной массы, заключающийся в заготовке крови в сдвоенные полимерные контейнеры с консервантом CPDA-1 и последующем центрифугировании при температуре +4-6^oС в течение 20 мин при 2000•g, фракционировании на плазму и эритроцитную массу и последующем замораживании плазмы при -35-40^oС (2).

Недостатком указанного способа является отсутствие как изосерологического, биохимического и вирусологического обследования доноров, так и отсутствие характеристик целевых продуктов: свежезамороженной плазмы (активность фактора VIII, содержание общего белка, бактериальных и клеточных контаминантов), эритроцитной массы (содержание гемоглобина, гематокрит, содержание клеточных и бактериальных контаминантов). Поэтому полученные указанным способом препараты крови могут быть использованы только для аутогемотрансфузий из-за отсутствия показателей, характеризующих качество и безопасность целевых продуктов.

Другим недостатком указанного способа является получение препарата свежезамороженной плазмы путем центрифугирования при температуре +4-6^oС при 2000•g, что не позволяет достичь высокой степени очистки от клеток-контаминантов крови. Использование для трансфузий плазмы с высоким содержанием клеток-контаминантов способствует развитию пирогенных, аллергических и анафилактических реакций, нередко приводящих к смертельным исходам.

Известен способ получения свежезамороженной плазмы из донорской крови или заготовленной плазмаферезом путем центрифугирования, при этом центрифугирование проводят в сроки, не превышающие 6-18 часов после заготовки крови (3). Полученная после жесткого центрифугирования крови плазма содержит не менее 70% исходного фактора VIII и, как минимум, сходные количества других факторов свертывания крови и естественных ингибиторов.

Недостатком указанного способа является то, что многие количественные показатели препаратов указаны в допустимых пределах без их оптимальной характеристики, что не дает возможности стандартизовать процесс получения целевых продуктов.

В Рекомендациях Совета Европы "Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components" (4) дана характеристика эритроцитной массы, содержащей минимально 43 г гемоглобина в одной дозе (250±50мл) и имеющей гематокрит 65-75%, а также свежезамороженной плазмы, которая содержит не менее 0,7 МЕ/мл активности фактора VIII. В этом Руководстве указаны следующие допустимые пределы содержания клеток-контаминантов в плазме: для эритроцитов - менее 6,0•10⁹/л, для лейкоцитов - менее 0,1•10⁹/л, для тромбоцитов - менее 50•10⁹/л. Однако не приведены четкие параметры, характеризующие препараты с оптимальными свойствами, которые могут быть использованы с полной гарантией безопасности при введении больным.

Задачей данного изобретения является улучшение качества целевых продуктов, удовлетворяющих современным международным требованиям.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что кровь, полученную от доноров, обследованных в соответствии с "Порядком медицинского освидетельствования донора крови и ее компонентов" (5), собирают стерильно в строенные полимерные контейнеры, содержащие консервант крови CPDA-1, и определяют массу содержимого контейнера для последующего контроля стабильности выхода целевых продуктов. Биохимические (АЛТ, общий белок, белковые фракции), изосерологические (группа крови, Rh-фактор, изоиммунные антитела), вирусологические и бактериологические исследования (маркеры гепатита В и С, ВИЧ-1,2, сифилиса) проводят на пробах крови, взятых у доноров во время кроводачи. Затем не позднее 2-5 часов с момента сбора крови проводят низкоскоростное центрифугирование при 2500-3500•g в течение 15-20 минут при температуре +22-24^oС. В результате центрифугирования происходит одномоментное разделение крови на плазму, эритроцитную массу и лейкотромбослой. Плазму и лейкотромбослой с помощью плазмаэкстрактора переводят в индивидуальные контейнеры - "сателлиты", а эритроцитная масса остается в исходном контейнере. Выделенную плазму контролируют визуально на отсутствие посторонних примесей и прозрачность, а затем определяют содержание форменных элементов-контаминантов, активность фактора VIII и содержание общего белка. Полученная указанным способом плазма содержит форменные элементы крови в следующем количестве: эритроциты 2,0-4,0•10⁸/л, лейкоциты 5,5-9,5•10⁶/л, тромбоциты 3,5-5,5•10⁹/л; активность фактора VIII не менее 0,7-1,6 МЕ/мл. Содержание общего белка, измеренного биуретовым способом, равно 55-65 мг/мл. Эритроцитную массу контролируют визуально на отсутствие гемолиза и сгустков крови. Концентрация гемоглобина в эритроцитной массе при данном способе получения составляет 250-270 г/л, показатель гематокрита 76-80%. Содержание лейкоцитов равно 5,4-6,4•10⁹/л, тромбоцитов 120-156•10⁹/л Не позднее 2 часов после центрифугирования плазму замораживают при температуре -40-45^oС в течение 30-40 мин и хранят в замороженном состоянии в течение 12-24 месяцев. Эритроцитную массу охлаждают при температуре +2-4^oС и хранят до использования в течение 35-42 дней. Лейкотромбослой подвергается последующей обработке для получения концентрата тромбоцитов и приготовления интерферона. Осуществляют выборочный контроль препаратов на стерильность.

Техническим результатом использования изобретения является получение высокоочищенной стерильной свежезамороженной плазмы и высокостабильного препарата эритроцитной массы, соответствующих Требованиям Европейской фармакопеи (6).

Способ осуществляют следующим образом. Здоровых доноров в возрасте 18-60 лет осматривает врач, в стерильном боксе берут кровь из локтевой вены в строенные полимерные или стеклянные контейнеры в объеме 450±10 мл с консервантом крови CPDA-1. Полимерные контейнеры перед заполнением крови, а также в процессе получения целевых продуктов несколько раз контролируют на герметичность. Каждый контейнер взвешивают для последующего контроля стабильности выхода целевых продуктов. Биохимические (АЛТ, общий белок, белковые фракции), изосерологические (группа крови, Rh-фактор, изоиммунные антитела), вирусологические и бактериологические исследования (маркеры гепатита В и С, ВИЧ-1,2, сифилиса) проводят с образцами крови, взятыми у доноров во время кроводачи. Затем не позднее 2-5 часов с момента сбора крови проводят низкоскоростное центрифугирование при 2500-3500•g в течение 15-20 минут при температуре +22-24^oС. В результате центрифугирования происходит одномоментное разделение крови на плазму, эритроцитную массу и лейкотромбослой. Затем плазму и лейкотромбослой с помощью плазмаэкстрактора переводят в индивидуальные контейнеры-"сателлиты", а эритроцитная масса остается в исходном контейнере. Плазму контролируют на содержание форменных элементов крови (лейкоциты, эритроциты, тромбоциты), общего белка и активность фактора VIII. Полученная указанным способом плазма содержит форменные элементы крови в следующем количестве: эритроциты 2,0-4,0•10⁸/л, лейкоциты 5,5-9,5•10⁶/л, тромбоциты 3,5-5,5•10⁹/л; активность фактора VIII не менее 0,7-1,6 МЕ/мл; содержание общего белка, измеренного биуретовым способом, равно 55-65 мг/мл. Эритроцитную массу контролируют визуально на отсутствие гемолиза и посторонних примесей, определяют концентрацию гемоглобина и показатели гематокрита. Концентрация гемоглобина при таком способе получения эритроцитной массы составляет 250-270 г/л, показатель гематокрита равен 76-80%. Осуществляют выборочный контроль проб на стерильность. Не позднее 2 часов после центрифугирования плазму замораживают в течение 30-40 минут при температуре -40-45^oС. Полученную свежезамороженную плазму хранят в замороженном состоянии в течение 12-24 месяцев. Эритроцитную массу охлаждают при температуре +2-4^oС и хранят до использования в течение 35-42 дней. Лейкотромбослой подвергается последующей обработке для получения концентрата тромбоцитов и приготовления интерферона.

Пример. В регистратуре станции (отделения) переливания крови донора регистрируют (о повторных донорах имеются базовые данные, занесенные в компьютер). Затем в соответствии с "Порядком медицинского обследования донора крови и ее компонентов" (2001г.) донора осматривает терапевт. Далее в операционной в стерильных условиях проводят взятие крови в строенные полимерные контейнеры, например, фирмы Baxter, США, предварительно проверенные на герметичность и срок годности. В основной контейнер вносят 63 мл консерванта крови CPDA-1. У донора (АЛТ, общий белок, белковые фракции), изосерологического (группа крови, Rh-фактор, изоиммунные антитела), бактериологического (маркеры сифилиса) и вирусологического контроля (маркеры гепатитов В и С, ВИЧ-1,2). Затем заполненные контейнеры взвешивают для контроля стабильности выхода компонентов и повторно контролируют герметичность контейнеров (визуально и сжатием). После этого проводят низкоскоростное центрифугирование на центрифуге типа Sorval RC-3C plus при 3000•g в течение 15 минут при температуре + 22-24⁹С. После центрифугирования контейнеры помещают в плазмаэкстрактор для отделения плазмы и лейкотромбослоя в индивидуальные контейнеры-"сателлиты". Эритроцитную массу оставляют в исходном контейнере, охлаждают до +4^oС.

Лейкотромбослой используют для последующей обработки (получение концентрата тромбоцитов и приготовления интерферона).

Полученную плазму контролируют визуально на отсутствие посторонних примесей, прозрачность и проводят контроль на содержание белка, контаминацию форменными элементами крови и активность фактора VIII. Выборочно проводят контроль на стерильность. Концентрация белка, измеренная биуретовым методом, составляет 65 г/л. Форменные элементы присутствуют в следующем количестве: эритроциты 3•10⁸/л, лейкоциты 7,7•10⁶/л, тромбоциты 4,5•10⁹/л. Активность фактора VIII, измеренная по одностадийному графическому методу, составляет 1,26 МЕ/мл. Не позднее 2 часов после получения плазмы ее замораживают в быстром замораживателе, например, фирмы Frigera, Чехия, при температуре -40С в течение 30 минут. Свежезамороженная плазма хранится до 24 месяцев при температуре -30-40С. Перед трансфузией плазму размораживают, контролируют на активность фактора VIII, которая должна быть не менее 0,7 МЕ/мл, и на содержание белка, которое составляет не менее 60 г/л.

Эритроцитную массу контролируют визуально на отсутствие гемолиза и сгустков крови, определяют в ней концентрацию гемоглобина и показатель гематокрита, а также содержание клеток-контаминантов. Полученный препарат имеет следующие характеристики: концентрация гемоглобина 260 г/л, показатель гематокрита 78%, содержание лейкоцитов 6,0•10⁹/л, тромбоцитов 130•10⁹/л. Данный препарат хранят в течение 42 дней при температуре +4^oС.

Литература 1. Патент RU 2014847.

2. Патент RU 2151617.

3. Руководство по приготовлению, использованию и обеспечению качества компонентов крови. Стандарт Европы, 1996.

4. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, 2001.

5. Порядок медицинского освидетельствования донора крови и ее компонентов (Приказ Минздрава РФ 364 от 14.09.2001 г.).

6. European Pharmacopoeia.- 1997,-p.965-967.

Формула изобретения

1. Препарат крови для трансфузии, характеризующийся тем, что он представляет собой свежезамороженную плазму с концентрацией общего белка 55-65 мг/мл и активностью фактора VIII 0,7-1,6 МЕ/мл при следующем содержании клеток-контаминантов: эритроцитов 2-4•10⁸/л, лейкоцитов 5,5-9,5•10⁶/л, тромбоцитов 3,5-5,5•10⁹/л.

2. Препарат крови для трансфузии, представляющий собой эритроцитную массу с концентрацией гемоглобина 250-270 г/л, и показателем гематокрита 76-80%, при следующем содержании клеток-контаминантов: лейкоцитов 5,4-6,4•10⁹/л, тромбоцитов 120-156•10⁹/л.

3. Способ получения препаратов крови для трансфузии, характеризующийся тем, что свежесобранную донорскую кровь не позднее 2-5 ч с момента сбора фракционируют посредством центрифугирования при 2500-3500•g в течение 15-20 мин при температуре 22-24^oС в полимерных контейнерах с консервантом CPDA-1 и отделяют плазму от эритроцитной массы.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что полученную плазму подвергают замораживанию при температуре 40-45^oС в течение 30-40 мин и хранят в замороженном состоянии в течение 12-24 месяцев.

5. Способ по любому из пп. 3 и 4, отличающийся тем, что замораживание плазмы проводят не позднее 2 ч после центрифугирования.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что полученную эритроцитную массу охлаждают до 2-4^oС и хранят при этой температуре в течение 35-42 дней.

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 14.12.2007

Извещение опубликовано: 27.07.2009        БИ: 21/2009

---