Полимерный гидрогель акриламидного сополимера терапевтического применения и способ его получения

 

Гидрогель представляет собой сополимер N-замещенного метакриламида или акриламида, сшивающего агента и соединения сахара или его производного, пептида, соединяющего ткань, или сопряженного полимера с антителами, причем полимер является гетерогенным, упругодеформирующимся и имеющим равновесное содержание воды, по крайней мере, около 80%. Он может быть использован для регенерации ткани и для восстановления органа, например, в развивающейся и зрелой нервной системе. Гидрогель обладает улучшенной способностью заживления ткани в тканевом образовании, которое достигается благодаря контролю над разрастанием клетки, инфильтрацией клетки и организацией ткани в стабильной полимерной матрице. 2 с. и 16 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к полимерному гидрогелю. В частности, настоящее изобретение относится к пористому полимерному гидрогелю, способному быть имплантатом, для терапевтических целей, например, который может быть использован при замене внутренних тканей любой части мягких органов, для заживления раны, для регенерации ткани и для восстановления органа вообще, особенно в развивающейся и взрослой нервной системе или в других подобных областях терапии. Настоящее изобретение относится, в частности, к полимерному гидрогелю, который после имплантации становится пористой матрицей, заполняется биологическими жидкостями и молекулами, образуя так называемый органоидный гидрогель, и постепенно интегрируется в организм благодаря последующему врастанию ткани и кровеносных сосудов. Настоящее изобретение относится также к методу введения клеток живой ткани, клеток предшественников или генетически модифицированных клеток в такой полимерный гидрогель с целью получения биогибридных материалов, которые пригодны для трехмерных клеточных культур, или для перестройки ткани. Также настоящее изобретение относится к методу получения полимерного гидрогеля, соответствующего настоящему изобретению, и к биогибридным материалам, получаемым по вышеупомянутому методу. И, наконец, настоящее изобретение относится к методу лечения поврежденных участков центральной нервной системы, особенно спинного мозга и зрительного нерва или периферических нервов, или других тканей путем имплантации в них полимерного гидрогеля или биогибридных материалов, соответствующих настоящему изобретению.

Предпосылки создания изобретения Трансплантация органа является в настоящее время единственной альтернативой смягчению результатов повреждений органа и восстановлению или улучшению функции и состояния органов. Однако некоторые недостатки терапевтических методов с органом-трансплантатом состоят в потенциальной передаче болезни от донора к реципиентам, в коротком сроке его хранения, в ограниченных возможностях наличия донорских органов и в возможных иммунологических побочных реакциях.

Таким образом, например, трансплантация спинного мозга ни с клинической, ни с биологической точек зрения невозможна и, следовательно, нет в наличии метода лечения пациентов, страдающих SCI, хотя только в Соединенных Штатах насчитывают 250000 пациентов-хроников, страдающих параличом, число которых возрастает ежегодно на 10000 новых пациентов с SCI.

С другой стороны, имплантация, трансплантация или инъекция клеток в организм с целью замены или восстановления утраченных клеток или части ткани органов не могут успешно закончить формирование новых тканей вследствие отсутствия поддерживающей экстраклеточной матрицы как каркасной ткани, необходимой для расширения и организации в интегрированную структуру при контакте с органом хозяина, кроме того, клетки необходимо помещать в физиологически эквивалентную среду, что облегчает распространение питательных веществ, кислорода, гуморальных и клеточных компонентов с целью поддержания высокой жизнеспособности и потенциального роста после имплантации.

В соответствии с настоящим изобретением пористые гидрогели представляют собой способные к деформации пористые полимерные матрицы, насыщенные внутритканевой жидкостью или водой, и таким образом создающие необходимый тканевый каркас, гидрированную зону, через которую клетки могут прорастать и собираться в суперклеточные тканевые образования в правильной гистологической структуре с целью получения функциональной новой ткани.

Различные экспериментальные стратегии по трансплантации в спинной мозг были описаны в литературе как попытки устранения повреждений спинного мозга (на животных моделях) с применением различных пересадочных материалов, которые могут быть сгруппированы по двум большим категориям имплантатов: (1) биологические ткани и (2) протезные материалы.

В категорию (1) включено применение донорских тканевых трансплантатов, или сингенического аутотрансплантата или гомотрансплантата, аллотрансплантата или ксенотрансплантата, с целью преодоления повреждений спинного мозга, таких как эмбриональная нервная ткань, или как (а) твердый трансплантат (например, Bregman, Dev. Brain Res., 34, 265, 1987; Houle и Reier, J.Comp. Neurol., 269, 535, 1988) или как (b) суспензионные трансплантаты, включающие смешанные клетки нервной ткани (например, Goldberg и Bernstein, J.Neuroscience Res. , 19, 34, 1988; Hoovler и Wrathall, Acta Neuropatol., 81, 303, 1991); шванновские клетки, перекомбинированные с культурой сенсорных нейронов (Kuhlengel et al., J.Comp.Neurol., 293, 74, 1990); недоразвитые астроциты (например, Bernstein и Goldberg, Res. Neurol. Neurosci. , 2, 261, 1991); предшественники клеток нервной ткани (Monteros et al., Dev.Neurosci., 14, 98, 1992) и иммортальные установившиеся клеточные ряды (Zompa et al., Int.J. Dev.Neurosci., 11, 535, 1993); сегмент периферического нерва, включающий культуру не нервных клеток (Wrathall et al., Acta Neuropathol., 57, 59, 1982), или с эмбриональной нервной тканью (Horvat et al., Res.Neurol.Neurosci., 2, 289, 1991). В категории (2) протезные материалы, которые были описаны выше, включают матрицы из чистого коллагена (de la Torre и Goldsmith, Brain Res., Bull. , 35, 418, 1994; Marchand и Woerly, Neurosci. 36, 45, 1990; Gelberg, Brain Res. 511, 80, 1990), содержащие нейроактивные вещества (Goldsmith и de la Torre, Brain Res. , 589, 217, 1992) или содержащие культуру нервных трансплантатов (Bernstein и Goldberg, Brain Res., 377, 403, 1986); обработанные нитроцеллюлозные имплантаты (Schreyer и Jones, Dev. Brain Res., 35, 291, 1987; Houle и Johnson, Neurosci.Lett. 103, 17, 1989); коллагеновые имплантаты (Piano et al., J. Neurocytol., 23, 433, 1991) и полимерные направляющие каналы из поли(акрилонитрил-винил хлорида) (Xu et al., J.Comp.Neurol. , 351,145, 1995), включающие шванновские клетки.

Такие подходы четко сфокусированы на стимулировании аксональной регенерации с применением различных тканевых субстратов как источников новых аксонов или с применением комплексных протезных субстратов для поддержания и направления растущих аксонов и не указывают соответственный клинический выход по восстановлению спинного мозга или мозговой ткани путем регенерации большой части ткани хозяина и по ремоделированию при залечивания раны, например после снятия омертвевшей или рубцовой ткани, следующего за повреждением.

Полимерные гидрогели полимера были описаны как имплантаты в нервной системе (Woerly et al., Biomaterials, 11, 97, 1990; Woerly et al., Biomaterials, 12, 197,1991; Woerly et al., J.Neural Transpl.Plast. 3, 21, 1992; Woerly et al., Cell Transpl., 2,229,1993; Woerly et al., J.Neural Transpl. Plast. , 5, 245, 1995). Эти гидрогели были получены методом свободной радикальной полимеризации в воде с применением персульфата аммония и метабисульфита натрия или персульфата и аскорбиновой кислоты в качестве инициаторов восстановления-окисления с гидроксиэтил-метакрилатом (рНЕМА), глицидил-метакрилатом (pGMA) или N-гидроксипропил-метакриламидом (рНРМА) или с композицией, включающей в себя вышеупомянутые мономеры со сшивающими агентами, которыми могут быть этиленгликоль и тетраэтиленгликоль-диметакрилат или метилен-бис-акриламид. Эти гели являются типично гомогенными и оптически прозрачными с двумодальной пористостью, включающей открытые (полость поры открыта) и закрытые поры, как об этом свидетельствуют данные ртутной порометрии и данные сканирующей электронной микроскопии; характерно, что пористая структура у этих гелей образована параллельными цилиндрическими капиллярами с круглым поперечным сечением, как это показано на фиг. 1, при среднем диаметре поры от 7 до 13 мкм. Фракционная пористость лежит в пределах от 50-85% для рНЕМА гидрогелей, 60-65% для pGMA гидрогелей и 70-94% для рНРМА гидрогелей. По крайней мере, 50% пористого объема гидрогеля занимают поры размером от 1,2 до 4 мкм для рНЕМА, от 6 до 13 мкм для pGMA и от 10 до 14 мкм для рНРМА. Было обнаружено, что их биологическая активность зависела от введения или сополимеризации коллагена в сшитую решетку. Заявитель проводил опыт с имплантацией в головной мозг, который показал, что некоторая степень восстановления ткани может быть достигнута в соответствии с определенной степенью врастании ткани в гомогенный гель матриц. Эта реакция может быть изменена в зависимости от состава мономера и введенных функциональных групп. Однако гомогенные гидрогели часто вызывают образование волоконной капсулы, что приводит к изоляции имплантата от организма. Это объясняется механическими свойствами этих гелей, которые являются не совсем такими, как у живой нервной ткани, а также небольшим фракционным объемом макропор. В спинном мозге эти гомогенные гидрогели не интегрируются в организм и очень быстро изолируются капсулой из соединительной ткани и глиальной рубцовой ткани без проникновения аксонов или компонентов ткани, как это показано на фиг. 2. Кроме того, есть физическая причина, которая ограничивает площадь участка, который может быть генерированным, являющаяся существенным параметром для успешного взаимодействия ткани, генерированной цилиндрическими порами в таких гомогенных гелях. Для определенного объема геля площадь участка достигает предела, который представляет собой максимальный радиус одиночной поры, занимающий весь объем геля. С другой стороны, увеличение площади участка за счет уменьшения размера пор приведет к уменьшению общего свободного объема, который несовместим с врастанием ткани и накоплением биомассы.

Harvey et al., in Brain Res., 671, 119, 1995 описывает полимерную губку из поли(2-гидроксиэтил-метакрилата), которая применена в качестве имплантата головного мозга для регенерации ткани и выращивания аксона. Этот продукт целесообразнее применять с добавкой коллагена в сетку полимера в качестве биосвязующей ткани и после включения шванновских клеток.

В Пат. США 4,902,295 описан способ получения искусственной ткани из клеток ткани поджелудочной железы. Способ включает в себя полимеризацию матричных предшественников, гелевых предшественников и промоторов с жизнеспособными клетками в водной фазе. Все полимерные предшественники, также как и промоторы, представляют собой биологические вещества, обладающие способностью к быстрому разложению в организме и не обладающие длительной стабильностью после имплантации.

Bellamkonda, R; Ranieri, J.P.; Bouche, N.; Aebischer, P. ("Hydrogel-Based Three-dimensional Matrix for Neural Cells", J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 663-671) описывают технологию иммобилизации клеток нервной ткани в гелях агарозы и экстраклеточных эквивалентных гелях (Matrigel®). Эти материалы являются биологическими и биоразлагаемыми.

Krewson, C. E.; Chung, S.W.; Dai, W.; Saltzman, W.M. ("Cell Aggregation and Neurite Growth in Gels of Extracellular Matrix Molecules", Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 555-562) описывают технику, согласно которой клетки PC 12 находятся во взвешенном состоянии в гелях коллагена в чистом виде или в комбинации с фибронектином или ламинином и в гелях агарозы и коллагена. Эти гели обладают способностью к биоразложению.

Cascone, M.G.; Laus, M.; Ricci, D.; Sbarbati del Guerra, ("Evaluation of Poly(vinyl alcohol) Hydrogels as a Component of Hybrid Artificial Tissues", J. Mat.Sci.Mat.Med. 1995, 6, 71-75) описывают технологию применения гидрогелей поливинилового спирта, физически сшитого, в котором фибробластовые клетки введены с помощью одного цикла замораживание-оттаивание.

Wald, H.L.; Sarakinos, G.; Lyman, M.D.; Mikos, A.G.; Vacanti, J.P.; Langer, R. ("Cell Seeding in Porous transplantation", Biomat., 1993, 14, 270-278) описывают способ введения клеток гепатоцита в разлагаемые губчатые полимеры поли(L-молочной кислоты) методом микроинъекции. Эта технология не позволяет получить неразлагаемую матрицу и не позволяет однородное распределение клеток через полимерную матрицу.

Mikos, A. G.; Bao, Y.; Cima, L.G.; Ingber, D.E., Vacanti, J.P.; Langer, R. ("Preparation of Poly(glycolic acid) Bonded Fiber Structures for Cell Attachment and Transplantation", J.Biomed.Mat.Res., 1993, 27, 183-189) описывают способ образования сеток поли(гликолевой кислоты) со связанными волокнами с целью получения культуры гепатоцитов. Этот полимер является биоразлагаемым, а способ введения клеток в матрицу не походит на захват.

Puerlacher, W.C.; Mooney, D.; Langer, R.; Upton, J.; Vacanti, J.P.; Vacanti, C. A. ("Design of Nasoseptal Cartrilage Replacements Synthetized from Biodegradable Polymers and Chondrocytes", Biomat. 1994, 15, 774-778) и Freed, L. E. ; Marquis, J.C.; Nohria, A. Emmanual; Mikos, A.G.; Langer, R. ("Neocartilage Formation In Vitro and In Vivo Using Cells Cultured on Synthetic Biodegradable Polymers", J.Biomed.Mat. Res. 1993, 27, 11-23). В этих ссылках дано описание способа введения клеток хондроцитов в полигликолиевые (PGA) матрицы, или матрицы из полимолочной кислоты (PLLA), или матрицы из PGA-PLLA под действием капилляров. Этот способ позволяет получать биоразлагаемые полимерные материалы, поскольку клетки неравномерно распределены в полимере и не дают возможности контролировать плотность клетки.

Cao, Y. ; Vacanti, J.P.; Ма, X.; Paige, К.Т.; Upton, J.; Chowanski, Z.; Schloo, В. ; Langer, R. ; Vacanti, С.A. ("Generation of Neo-Tendon Using Synthetic Polymers Seeded with Tenocytes", Transpl.Proc. 1994, 26, 3390-3391) описывают способ посева теноцитных клеток в вогнутом нетканом сите из полигликолевой кислоты.

Mooney, D.J.; Park, S.; Kaufman, P.M.; Sano, K.; McNamara. К.; Vacanti, J. P.; Langer, R. ("Biodegradable Sponge for Hepatocyte Transplantation", J. Biomed. Mat. Res. , 1995, 29, 959-965) и Takeda, Т.; Kim, Т.Н.; Lee, S.K.; Langer, R. ; Vacanti, J. O. ("Hepatocyle Transplantation in Biodegradable Polymer Scaffolds Using the Baltimatian Dog model of Hyperuricosuria", Transpl. Proc. , 1995, 27, 635-636) описывают способ абсорбции гепатоцитных клеток в войлочных листах из полигликолиевой кислоты или в губчатых полимерах, полученных из полимолочной кислоты и поливинилового спирта и из полимолочной кислоты гликолевой кислоты с помощью адсорбции и капиллярного воздействия. Этот способ дает биоразлагаемые полимерные материалы, поскольку клетки неравномерно распределены в полимере и не позволяют контролировать плотность клетки.

Woerly, S.; Plant, G.W.; Harvey, A.R. ("Cultured Rat Neuronal and Glial Cells Entrapped within Hydrogel Polymer Matrices: A Potential Tool for Neural Tissue Replacement", Neurosci.Lett., 1996, 205, 197-201) описывают процесс захвата клеток нервной ткани в гомогенных прозрачных полимерных гелях из поли[N-(2-гидроксипропил)-метакриламида], который может содержать коллаген в качестве связующего субстрата. Этот процесс предполагает добавление клеточной суспензии в полимерную смесь и полимеризацию смеси клетка-полимер при комнатной температуре или в инкубаторе, с поддержанием температуры 37^oС. Получаемый при этом гель оптически прозрачен и клетки беспорядочно рассеяны в сшитом геле. Иммуноцито-химические испытания показали, что жизнеспособность клетки через 6 суток in vitro заключена в пределах от 0 до 6%.

Описание изобретения Цель настоящего изобретения состоит в устранении недостатков, упомянутых в вышеприведенных работах, путем применения небиологического протезного средства, такого как неразлагаемый полимерный гидрогель, который действует как заполняющий пространство материал и как каркас, что стимулирует регенерацию ткани, морфогенезис и ремоделирование в интегрированной структуре в органе.

Также предмет настоящего изобретения состоит в улучшении заживления ткани в тканевом образовании, которое может быть достигнуто благодаря контролю над разрастанием клетки, инфильтрацией клетки и организацией ткани в стабильной полимерной матрице.

Предмет настоящего изобретения состоит также в регенерации ткани с помощью полимерных матриц, которые могут быть весьма полезными, клинически важными и экономически эффективными для людей, страдающих поражением спинного мозга (SCI), поражением головного мозга или дефектом спинного мозга в растущем организме (spina bifida).

Кроме того, предмет настоящего изобретения состоит в получении полимерных матриц для регенерации зрительного нерва и периферических нервов.

Также предмет настоящего изобретения состоит в получении неразлагающейся синтетической матрицы из полимерного гидрогеля с анизотропной пористой структурой, с активной площадью области и хорошей адгезионной способностью и совместимостью с тканью, которая предназначена для имплантации в структуру мягкой ткани, и особенно в нервную систему, и которая постепенно становится частью органа.

Также предмет настоящего изобретения состоит в получении синтетических полимерных матриц для применения в области терапии с контролируемой пористой структурой и содержащей поверхностно-активные вещества.

Основной предмет настоящего изобретения состоит в получении полимерной матрицы, выполненной из нового водорастворимого полимерного гидрогеля, который применяют в набухшем состоянии в качестве протезных средств для регенерации ткани при лечении мягкого органа.

Также предмет настоящего изобретения состоит в методе получения гидрогельного продукта в форме, имеющей конфигурацию готового протезного средства.

Еще один предмет настоящего изобретения состоит в устранении одного или нескольких недостатков, указанных в вышеупомянутых работах, с целью создания полимерного нейропротеза, который можно имплантировать в головной мозг или в спинной мозг, используя стандартные хирургические процедуры.

Также предмет настоящего изобретения состоит в создании метода, согласно которому клетки или генетически модифицированные клетки могут быть введены в сетку полимера.

Предмет настоящего изобретения состоит в создании полимерной смеси, которую можно смешивать с живыми клетками, комбинируя при этом физические свойства полимерной матрицы с учетом поведения типового гидрогеля (пористость, стабильность, направляющие поверхности, проницаемость) и с учетом биологических факторов клеток (например, фактор роста).

Предмет настоящего изобретения состоит в создании биогибридных средств, которые могут быть использованы при замене части ткани в мягких органах.

Также предмет настоящего изобретения состоит в создании трехмерной системы культуры, которая может быть использована при получении культуры различных клеток in vitro на продолжительный период времени.

Следующий предмет настоящего изобретения состоит в создании поддерживающих матриц для присоединения биологически активных молекул к ткани или органам.

Далее предмет настоящего изобретения состоит в создании пористых гидрогелей, которые представляют собой деформирующиеся пористые полимерные матрицы, насыщенные внутритканевой жидкостью или водой, при этом образующие необходимый тканевый каркас и гидратное пространство, через которое клетки могут разрастаться и собираться в суперклеточные образования в правильной гистологической структуре с образованием функциональной ткани.

Предмет настоящего изобретения состоит в создании компонента для систем контроля выпускаемых лекарственных препаратов и макромолекул, и, особенно, противовоспалительных веществ как индометацин, стимуляторы цитокинов, таких как бактериальные липополисахариды, стероиды, такие как метил преднизолон, и нейроактивных факторов, таких как фибробластовые факторы роста.

Также предметом настоящего изобретения является создание материала, который обладает строгой биосоединяющей способностью и гемостатическими свойствами, необходимыми для размещения внутренней мягкой ткани, для быстрого присоединения и в то же время для гемостазиса.

Основной предмет настоящего изобретения состоит в создании полимерной матрицы, которая имеет механическую и химическую стабильность, позволяющие выдерживать длительное время имплантации в организме, без разложения, в противном случае возможно повреждение новой тканевой сетки, которая проросла в матрице вместо части органа.

Также предмет настоящего изобретения состоит в создании матрицы с механической податливостью, которая позволяет человеку резать, кроить и работать с полимерной матрицей, без изменения внутренней структуры и механических свойств матрицы.

Предметом настоящего изобретения является создание набухающего материала с высокой набухающей способностью в водной среде, который может адсорбировать значительные количества, представляющие интерес с биологической точки зрения, для достижения цели, поставленной в настоящем изобретении, а именно как адгезия молекул, таких как САМ и L1 молекулы, или проводящие молекулы, такие как семафорины или нетрины, растворенные в подходящем растворе, так что упомянутые молекулы впоследствии адсорбируются на поверхности сетки полимерной матрицы.

Согласно настоящему изобретению получены новые гидрофильные полимерные гидрогели, которые способны образовывать пористые, мягкие с высокой абсорбирующей способностью полимерные матрицы, которые обладают эластической деформирующей способностью и имеют равновесное содержание воды, равное, по крайней мере, 80%, предпочтительно, по крайней мере, 96%.

Согласно настоящему изобретению получены также полимерные смеси, которые можно смешивать с живыми клетками.

Настоящее изобретение относится к полимерному гидрогелю полимера для терапевтических областей применения, который представляет собой сополимер (а) N-замещенного метакриламида или акриламида, (b) сшивающего агента и (с) материала со способностью полимеризоваться, выбранного из группы, включающей в себя сахар, производные сахара, пептид, соединяющего ткань, тканевые протеины с дифференцированными молекулами, такие как костно-морфогенетические протеины, и сопряженный полимер с антителами против производных липида, который обладает эластической деформационной способностью и который имеет равновесное содержание воды, равное, по крайней мере, 80%, предпочтительно, по крайней мере, 96%.

Предпочтительно, чтобы N-замещенный метакриламид или акриламид (а) был выбран из группы, включающей в себя N-моноалкил и N,N-диалкил метакриламиды и акриламиды, сшивающий агент, (b) включал акриламид или прекурсоры из него и чтобы полимеризующийся материал (с) представлял собой сахар, выбранный из группы, включающей в себя глюкозамин, N-ацетил глюкозамин и N-ацетил производное нейраминиковой кислоты и их полимерные формы, такие как полисиаликовая кислота.

Настоящее изобретение относится также к методу получения полимерного гидрогеля для терапевтических целей, который включает в себя (а) растворение сшивающего агента в порообразующем растворителе с инициатором радикальной полимеризации с целью образования раствора, (b) добавление N-замещенного метакриламида или акриламида к раствору, полученному в п. (а) с целью образования смеси, и (с) добавление раствора сахара, производного сахара, пептида, соединяющего ткань, морфогенетических протеинов или производных биоактивных пептидов или сопряженного полимера с антителами против производных липида к смеси, полученной в п.(b).

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения метод включает в себя растворение азо-бис-изо-бутиронитрила и метилена бис-акриламида в растворителе с целью образования раствора, смешение раствора с N-2-(гидроксипропил)-метакриламидом, добавление к нему глюкозамина или N-ацетилглюкозамина или N-ацетилнеураминовой кислоты и вывод из него остаточных продуктов с низкой молекулярной массой и следов инициатора.

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения метод также включает введение клеток живой ткани или генетически модифицированных клеток к продукту, полученному в п.(с) и проведение полимеризации этих клеток вместе с упомянутым продуктом.

В соответствии еще с одним вариантом реализации настоящего изобретения полимерный гидрогель, соответствующий настоящему изобретению, содержит клетки или генетически модифицированные клетки, полимеризованные вместе с ним.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения данное изобретение относится к методу лечения поврежденных тканей головного мозга или повреждений спинного мозга, который состоит в снятии поврежденных тканей головного мозга или спинного мозга у человека или у животного и замене поврежденных тканей головного мозга или спинного мозга полимерным гидрогелем, предложенным в настоящем изобретении.

Согласно настоящему изобретению гидрогель представляет собой сшитый ковалентными связями, непрозрачный, гетерогенный материал, который предпочтительно обладает светлофазной разделенной структурой, образованной частицами полимера размером, примерно, от 1 до 10 мкм, предпочтительно от 3 до 5 мкм, так, чтобы обеспечить образование области с относительно крупной пористостью (макропоры), где гидрогель стремится вступить в контакт с тканью хозяина, и с относительно мелкой пористостью (мезопоры), где он стремится вступить в контакт с врастающей тканью.

В результате этого образуется предпочтительная губкоподобная структура с макропорами; фракционная пористость составляет, например, по крайней мере, от 80 до 90% (объем введенной ртути к общему объему геля); удельная площадь области заключена, предпочтительно, в пределах сотен квадратных метров/грамм геля; средний диаметр поры (объем) составляет, например, от 15 до 35 мкм; свободный объем пор равен или превышает 10 мкм, что составляет 90-95% фракционной пористости гидрогеля; гиперпористость (фракционная пористость геля составляет, по крайней мере, 50% от объема геля) составляет 20-30 мкм, хотя наибольшая фракция от общего объема пор геля составляет 10-50 мкм.

На макроструктуру и пористость гидрогеля можно воздействовать путем регулирования размера частиц и пористой структуры, которая зависит от состава и свойств применяемого порообразующего растворителя, фракционного объема полимера, от взаимодействия полимер-растворитель, температуры полимеризации и свойств применяемого сшивающего мономера. Успешное накопление биомассы и взаимодействие клетки являются результатом такого оптимального соотношения площадь/объем, как об этом свидетельствуют данные ртутной порометрии и что является следствием микро- и мезопористости частиц полимера.

Привлекательность материала в конечном итоге обусловлена его открытой природой и взаимосвязанностью, необходимой для накопления клеточной биомассы и для клеточного/молекулярного взаимодействия с живой тканью. Сканирующая электронная микроскопия, как это показано на фиг. 3, позволяет видеть эти гетерогенные гели, имеющие вид, характерный для коллоидального типа трехмерной структуры с некруглыми порами и стенкой пористой системы, которая образована смежными сторонами полимерных образований, как это показано на чертежах. Активная поверхность участка зависит от пористости и от поверхности частицы. В отличие от гомогенных гелей большое преимущество таких гетерогенных гелей состоит в том, что площадь области, образуемой частицами, фактически безгранична, поскольку размер образований (1) уменьшается так, что площадь области обратно пропорциональна 1. Также в сравнении с гомогенными гидрогелями гетерогенные гидрогели, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют значительно больший объем пор, и поэтому они более эффективны для клеточной инфильтрации и накопления биомассы. К тому же в сравнении с гомогенными гидрогелями гидрогели согласно настоящему изобретению имеют подобные механические свойства, похожие на свойства взрослой или развивающейся нервной ткани.

Эти гидрогелевые матрицы имеют правильные, специфические для ткани, образования, поскольку клеточное взаимодействие проявляется в организованной тканевой сетке через гелевые структуры, так называемые органоидные гидрогели.

Полимерные матрицы могут быть образованы одновременным осаждением или осадительной полимеризацией и сшивающей сополимеризацией необходимого количества каждого из следующих компонентов: (i) N-замещенные метакриламиды, такие как N-моноалкилметакриламиды, или N-замещенные акриламиды, такие как N-моноалкилакриламиды или N,N-дизамещенные акриламиды, такие как N,N-диалкилакриламиды; (ii) замещенный сшивающий агент, такой как акриламид или его предшественники, или соединения дивинила и им подобные; (iii) свободный инициатор радикальной полимеризации, такой как азо-бис-изобутиронитрил, различные пероксиды, аскорбиновая кислота, пероксисульфаты, замещенные азосоединения и им подобные вещества, хорошо известные специалистам, в количествах от 0,01 до 2% по массе с учетом сополимера или терполимера; (iv) соединения сахара, такие как глюкозамин или N-ацетилглюкозамин, или N-ацетилгалактозамин, или N-ацетил-неураминовая кислота, или полисиаловая кислота или другие производные сахара или олигопептиды, соединяющие ткани, содержащие последовательности, такие как Arg-Gly-Asp, Ile-Lys-Val-Ala-Val, Ala His-Ala-Val-Ser-Glu, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ткань дифференцирующие молекулы-производные олигопептидов (например, костные морфогенетические протеины) или сопряженный полимер с антителами против миелина и аксон-ассоциированные липиды и их производные в растворителе, предпочтительно в ацетон/диметил-сульфоксиде, ацетоне или ацетон/этаноле.

Алкильные группы имеют, предпочтительно, два атома углерода, например C₁ и С₂ радикалы гидроксиалкила и амино-алкила. Термин "N-замещенный", используемый в данной работе, содержит C_1-8-заместители, которые могут содержать ОН, аминогруппу или их комбинацию.

Реакцию обычно проводят при температуре от 40 до 60^oС в емкостях для полимеризации, представляющих собой запаянные ампулы, в течение примерно 12 часов.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой вид под микроскопом гомогенного геля; фиг. 2 представляет собой вид под микроскопом гомогенного геля, имплантированного в спинной мозг; фиг. 3 представляет собой вид под микроскопом гетерогенного геля НРМА; фиг. 4 представляет собой вид под микроскопом геля с фиг. 3, имплантированного в нервную ткань.

Способы реализации изобретения Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

ПРИМЕР 1. AIBN (азо-бис-изобутиронитрил) (1,2 мас.%) и метилен-бис-акриламид (1% моль. ) растворены в сухом ацетоне. Раствор смешан с N-2-(гидроксипропил)метакриламидом в объемном соотношении 30% НРМА со смесью ацетон/диметилсульфоксид (93: 7 по объему). N-метакрилоил-глюкозамин (5% по массе) или 1-метил-2-метакрилоиламидоэтил-2-ацетамидо-2-деоксди-β-D-глюкозид (6,5% по массе) или 2-(1-метил-2-метакрилоиламидоэтил)-5-ацетамидо-3,5-дидеокси-D-глицеро-α-D-галакто-2-нонулопираносидоновая кислота (5,2% по массе) или метакрилоил-глицил-глицил-аргинилглицил-аспаратовая кислота (1,4% по массе) растворен в диметилсульфоксиде и добавлен в полимеризационную смесь. Смесь тщательно гомогенизируют, набирают в шприц и вводят в ампулы. Затем реакционную смесь продувают азотом и запаивают ампулы в пламени. В целях предотвращения испарения растворителя смесь сначала замораживают в смеси сухого льда с этанолом - до того, как запаивать ампулы в пламени. После этого запаянные ампулы погружают в водяную баню с температурой 50^oС на 24 часа.

Согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы остаточные продукты с низкой молекулярной массой, такие как не вступившие в реакцию мономеры, олигомеры, которые не были включены в сетку, и следы инициатора были удалены из гидрогельного продукта перед его применением. Это может быть сделано путем погружения ксерогелей в этанол на 20 часов, затем в смесь этанол/вода (1: 1 по объему) на 20 часов и в дистиллированную воду на одну неделю, часто меняя воду, до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное набухание, а степень экстракции станет низкой, предпочтительно нулевой. Другим важным аспектом настоящего изобретения является предупреждение загрязнения. Получение полимерного геля происходит, предпочтительно, в биозащищенной камере с потоком профильтрованного воздуха. Стадии промывки, предпочтительно, осуществляют с применением стерильных материалов, и гели хранят в стерильной дистиллированной воде при 4^oС.

В целях получения гибридного средства, которое содержит и полимерное средство, и донорские клетки ткани, клетки прививают в пористой структуре полимерного гидрогеля посредством микропунктур полимерной сетки с применением шприца Гамильтона, содержащего упомянутую клеточную суспензию. Введение клеток в упомянутый полимерный гидрогель можно осуществлять in vitro или in vivo в соответствии с адекватным временем после имплантации гидрогеля в пораженную область органа. Клетки могут быть выделенными из головного мозга человека или мускульной ткани или аутопсическим материалом.

ПРИМЕР 2. Прививка клетки в гидрогеле РНРМА in vitro Нервные клетки были выделены в DMEM из мозга головных полушарий эмбриона крысы без мозговой оболочки и без кровеносных сосудов и мелко измельчены на маленькие тканевые фрагменты. Фрагменты ткани были механически разъединены при помощи пипетки Пастера в центрифуге в трубке, содержащей DMEM. Всплывшее вещество было уловлено, а осевшие кусочки ткани были разъединены друг от друга при помощи пипетки Пастера, которая была отполирована на огне с целью сужения острого конца. После нескольких циклов повторения операции суспендирования/диссоциации клеток все уловленное выплывшее вещество было отцентрифугировано, и концентрация клеток составила 10⁶ клеток на 100 мкл среды. Фракцию хранили на льду до момента ее применения для захвата ее клеткой. С целью эффективного и правильного проникновения клеток в полимерный гидрогель клетки набирали в шприц Гамильтона, соединенный с механизмом микроманипулятора, и вводили их при минимальном повреждающем давлении при заданной концентрации в набухшие гидрогели РНРМА под бинокулярным микроскопом в асептических условиях. Гидрогели, содержащие клетки, хранили в минимальном объеме культивированной среды и держали в инкубационных условиях при температуре 37^oС и 5% СО₂ в увлажненной атмосфере. Как только клетки достигали определенной степени роста, гибридное средство можно было трансплантировать в головной мозг с целью облегчить реконструирование и заживление ткани.

Полимерную смесь можно смешивать с живыми клетками, комбинируя при этом физические характеристики полимерной матрицы с поведением типового гидрогеля (пористость, стабильность, направляющие поверхности, проницающая способность) и биологическими факторами клетки (например, факторы роста).

Введение клеток в полимерную матрицу осуществляют методом гелевого улавливания при температуре ниже нуля, то есть методом криогенной полимеризации, в процессе которой получают пористую матрицу, с помощью которой иммобилизуются клетки и с помощью которой клетки могут быть реорганизованы, могут расти и/или дифференцироваться для последующей трансплантации. Растворитель должен быть изотоническим раствором или тканевой культурой такого типа, который часто применяют в клеточных или тканевых культурах в комбинации с подходящим криозащитным веществом (глицерин/диметилсульфоксид, или глицерин, или DMSO, или поливинилпирролидон, или гидроксиэтиловый крахмал, карбоксиметилцеллюлоза). Это процесс позволяет контролировать конечные плотности клеток от нескольких клеток до плотностей, приближающихся к клеточной плотности ткани, примерно 10⁹-10¹⁰ клеток/см³. Также этот процесс позволяет изменять и контролировать пористость матрицы путем изменения скорости охлаждения и температуры полимеризации смеси, содержащей клетки (жидкий азот или охлажденный изопентан). В результате этого процесса получают макропористую губчатую структуру, характерную для криогеля с порами, размер которых позволяет диффузию питательных веществ и макромолекул (например, факторы роста) к клеткам и от клеток, с объемом поры, необходимым для накопления активной биомассы, расширения (деления клетки) и организации (контакт клетки с клеткой) во время развития ткани и вызревания.

ПРИМЕР 3. Захват астроцитов гелем путем криополимеризации НРМА Астроциты были получены инкубацией коры головного мозга новорожденных двухдневных крыс в растворе, содержащем 0,1% трипсин-EEDTA, 0,001% DNAse в буфере Hepes DMEM в течение 30 мин, при 37^oС с механической диссоциацией. Клетки были помещены в пластмассовые колбы при концентрации 10⁶ клеток/10 мл, выдержаны при температуре 37^oC в DMEM, содержащем 10% Сыворотки Эмбриона Быка (iFetal Bovin Serum). Через 7 дней in vitro астроциты были собраны и суспендированы в соляном сбалансированном растворе Hank's (HBSS, рН 7,4), содержащем 20% глицерина, при концентрации 10⁶ на 100 мкл и хранили их при температуре 6^oС. Процесс введения осуществляли в шкафу с ламинарным потоком, с применением стерильных материалов.

Раствор для преполимеризации состоял из 0,69 г N-(2-гидроксипропил)метакриламида и 0,010 г метилен-бис-акриламида, растворенного в 2,3 мл HBSS, содержащего 20% глицерина, а в качестве инициаторов персульфат аммония (100 мг/мл HBSS; 4,3•10^-5) с N,N,N',N'-тетраметилендиамином, разбавленным HBSS (1: 1 по объему HBSS; 3,3•10^-5 M)•рН было доведено до 0,7 с помощью и НС1 0,1N, а преполимеризационный раствор был продут азотом и предварительно охлажден до температуры 4^oС перед его применением. Клетки были суспендированы в преполимеризационной смеси с высокой плотностью при плотности 10⁶ клеток/мл и смесь была тщательно перемешана и введена с помощью шприца Гамильтона между двумя предварительно охлажденными стеклянными пластинами, находящимися одна от другой на расстоянии 0,75 мм, с прокладкой из силиконового каучука, для конечного объема, равного 3 мл. Форма была охлаждена до температуры ниже -170^oС погружением, примерно через 1 мин, в жидкий азот; в жидком азоте ее выдерживали в течение 3 мин перед ее перемещением в водяную баню, охлажденную до температуры -15^oС. Реакция полимеризации проходила в течение 5 часов в охлажденной водяной бане, после чего формы оттаивали в 37^oС ледяной бане. После ледяной дезинтеграции гели вынимали из формы, промывали с помощью HBSS с целью удаления криогенозащитного вещества и продуктов, не вступивших в реакцию, и вставляли для придания формы круглые диски с диаметром 0,8 мм. Гелевые диски помещали для инкубации при 37^oС и содержанием CO₂ 5% в увлажненной атмосфере DMEM с дополнением 10% FBS и 1% антибиотиков (стрептомицин-пенициллин).

Такой подход к получению полимерного гидрогельного гибрида тканей имеет два основных преимущества по сравнению с процессом, описанным в 1996 году Woerly с соавторами: предупреждение мембранного повреждения клетки при полимеризации при низкой температуре и образование кристаллического льда вокруг клеток, которые являются следствием возросшей пористости, и фиксированная структура поры (гетерогенный гидрогель). В результате этого клетки улавливаются полимерной матрицей с поддерживающей конфигурацией для организации с большой внутренней поверхностью области с достаточным объемом пространства для расширения клетки и с повышенной проницаемостью. Кроме того, клеточную полимерную смесь можно держать и хранить в замороженном виде для последующей полимеризации, как это было описано выше.

На любой стадии развития клетки получаемая в результате гибридная матрица состоит из твердой фазы, включающей в себя пористую матрицу, клетки и клеточную экстраклеточную матрицу и жидкую фазу, которая соответствует клеточной культивируемой среде и экстраклеточным жидкостям.

Как это может быть оценено специалистом, предлагаемый процесс отличается от так называемого процесса "клеточной инкапсуляции", в которой применены методы микро- или макроинкапсуляции и согласно которым клетки просто окружены полимерной мембраной, имеющей сферическую форму разного диаметра.

В настоящей работе под клеткой (клетками) следует понимать фрагменты ткани, группы клеток, простые клетки из эмбриона, новорожденного или взрослого происхождения, генетически модифицированные клетки, первичные или иммортализованные клетки, ряды иммортализованных клеток или из существующих рядов опухолевых клеток или из иммортализованных предшественников рядов клеток, родовых или клеток прародителей, рядов клеток селекционного предшественника с фактором роста любой ткани и любого органа. Процесс и продукт, предлагаемые в настоящем изобретении, подходят для приготовления большой разновидности искусственных тканей или органов для трансплантации или трехмерных систем культур.

В заключение напомним, например, что клеточная суспензия в сбалансированном растворе Hank (стерильный HBSS, рН 7,4), содержащая 10-20% глицерина в качестве криозащитного вещества, получена в инкубаторе в течение 10 мин при температуре 4^oС. Преполимеризационный раствор, включающий полимеризующуюся композицию, как описано в примере 1, растворен в HBSS, содержащем от 10 до 20% глицерина. Раствор профильтрован через пористый стеклянный фильтр, деаэрирован в вакууме и предварительно охлажден во льду. Радикальная полимеризация инициирована персульфатом аскорбиновой кислоты или персульфатом тетраметилендиамина, растворенного в HBSS. Значение рН раствора отрегулировано до нейтрального с помощью НСl 1N. Клетки суспендированы в полимеризационном растворе с переменной плотностью, предпочтительно равной 10⁶ клеток/мл полимеризационной смеси. Смесь тщательно перемешана, набрана шприцом и введена впрыском в ампулы или в форму, образованную двумя стеклянными пластинами, разделенными прокладкой из силиконового каучука разных размеров, или в ампулы. Форму или ампулы быстро замораживают путем погружения в жидкий азот и направляют в водяную баню, охлажденную до температуры от -10 до -30^oС. Реакция криополимеризации проходит в течение, по крайней мере, 5 часов, предпочтительно 12 часов. После полимеризации формы или ампулы оттаивают в водяной бане с температурой 37^oС и затем гели вынимают, промывают с помощью HBSS, сортируют по определенным формам. Гели поступают в инкубатор с содержанием CO₂ 5% с предпочтительной средой культуры, содержащей антибиотики и антифунгицидные препараты. Процесс проходит в шкафу с потоком и с применением стерильных инструментов.

Иcпытание 1
Согласно настоящему изобретению биологическая толерантность полимерных гидрогелей была изучена методом имплантации в поврежденные поперечным надрезом спинной мозг и головной мозг крыс. Образцы для испытания были взяты через 1-10 недель после имплантации. Биологическая толерантность была отличной. На макроскопическом уровне гели интегрируются в ткань организма, показывая хорошую стабильность, и в некоторых случаях орган в организме оказывается нетронутым. Изучение под микроскопом показало, что эта композиция полимерного гидрогеля способствует реструктуризации ткани и аксональной регенерации в месте имплантации в полушарие головного мозга и поперечно надрезанный спинной мозг крысы, таким образом достигая 100% целостности восстановления ткани (фиг. 4). Полученные данные можно описать следующим образом: (i) интеграция гидрогеля и восстановление целостности органа; гидрогель сохраняет объем повреждения постоянным так, что новая ткань может развиваться и заменять повреждение путем адгезии ее пористой поверхности к ране; (ii) равномерный контакт со всей имеющейся поверхностью полимера; (iii) минимальное рубцевание и отсутствие пузырьковой пустоты в прилегающей ткани организма; (iv) врастание тканевой сетки основной нервной ткани в полимерную сетку, усиливающее соединение имплантата с организмом; (v) врастание клеток гетерогенного происхождения; (vi) врастание капилляров; (vii) отложение экстраклеточных матричных молекул (коллаген, фибронектин и ламинин) на поверхности полимерной сетки, как об этом свидетельствует иммуногистохимия, и (viii) аксональное прорастание через биоимплантат. Изучение эксплантированных гидрогелей с помощью инфракрасной спектроскопии показывает, что инфракрасный спектр природного гидрогеля (неимплантированного) был замещен инфракрасным спектром, характерным для композиций липида и протеина, подобных прилегающей ткани спинного мозга, что подтверждает то, что элементы ткани спинного мозга интегрированы в пористую сетку гидрогеля.

Испытание 2
Процесс криополимеризации позволил формировать гетерогенные гели с фиксированной макропористой структурой, в которой иммобилизованы клетки. Исследования с применением метода меченой клетки, такого как меченая клетка или иммуноцитохимия, показали, что клетки равномерно распределены через полимерную сетку и на разных уровнях в гелях или как отдельные изолированные клетки, или как маленькие пучки из нескольких клеток. Клетки, которые выживали, были положительно иммуностойкими после трехнедельной инкубации с антигенными профилями развивающихся клеток нервной ткани. Следовательно, астроциты, выделенные из головного мозга новорожденных крыс, могут быть захваченными гидрофильными гидрогелями при реакции криополимеризации с высокими уровнями удерживания, и захваченные клетки могут выживать и нормально дифференцироваться, как это бывает в условиях однослойной культуры: через 10 суток in vitro жизнеспособность захваченных клеток равна 90% с применением методов меченой клетки. Кроме того, клетки являются функциональными, поскольку они синтезируют ламинин и фиброцетин в полимерной матрице так же, как они это делают в однослойных культурах.

Полимерный гидрогель может быть применен, главным образом, как расширительная ткань и шаблон для образующейся ткани с целью замены дефектной ткани или недостающей ткани мягких органов в организме, являющихся результатом или травмы, или хирургического вмешательства, или врожденного порока, стимулируя образование новой ткани, функционально интегрированной в орган. Также он может быть применен для инженерного залечивания раны, ремоделирования ткани, регенерации ткани, для развития ткани мягких органов, таких как печень, поджелудочная железа, кожа, мускульная ткань. Также он может быть применен в комбинации с другими материалами для регенерации и лечения костей.

Другое использование полимерного гидрогеля состоит в разработке процедур для создания терапии для человека со специфическими невралгическими расстройствами, а упомянутый полимерный гидрогель можно применять двумя различными способами в соответствии с типом расстройства и степенью функционального дефекта. Предпочтительно, его можно использовать как шаблон при регенерации ткани или как клетку-носитель после введения клетки трансплантата. Согласно настоящему изобретению полимерный гидрогель можно, например, применять для лечения повреждения или врожденного дефекта в специфических областях головного мозга и спинного мозга на стадии роста или на зрелой стадии (например, повреждение спинного мозга). Характерно, что процедура состоит в удалении поврежденной ткани, или рубцовой ткани, или любой плохо функционирующей части нервной ткани и в замене мозговой ткани или ткани спинного мозга вышеописанным полимерным гидрогелем. Согласно настоящему изобретению полимерный гидрогель можно также применять для переустройства нейронных систем, которые ассоциированы с аксональными проходами в центральной нервной системе на стадии развития или на зрелой стадии. Например, контуры септогиппокампала, которые вовлечены в функцию запоминания, ослабевающую при болезни Альцгеймера, или нигростриатальные системы, которые связаны с болезнью Паркинсона или частично со стриатумом при болезни Хантингтона, или при гормонально-репродуктивных дисфункциях, связанных с гипофизогипоталамо анатомической системой. Это осуществляют путем хирургического удаления дефектной части ткани головного мозга и имплантированием геля, являющегося предметом настоящего изобретения, предпочтительно с прививаемой нервной клеткой в целях стимуляции образования новых функциональных аксональных систем. Таким же путем неправильные образования как результат неправильной функции областей спинного мозга (например, spina bifida) можно лечить, удаляя неправильно образовавшуюся часть органа и заменяя дефектную часть нейрогелем, соответствующим настоящему изобретению, предпочтительно с трансплантируемой нейронной клеткой. Следующее возможное применение гидрогеля согласно настоящему изобретению состоит в лечении зрительного нерва и периферических нервов путем стимулирования, таким же образом, прорастания аксонов через полимерный гидрогель в соответствии с настоящим изобретением.

Очевидно, что настоящее изобретение не ограничено вышеописанными предпочтительными вариантами реализации настоящего изобретения и что возможны его модификации, при условии, что они будут в духе настоящего изобретения и не будут выходить за его рамки.

Формула изобретения

1. Полимерный гидрогель для терапевтического применения, отличающийся тем, что гидрогель представляет собой сополимер (а) N-замещенного метакриламида или акриламида, (b) сшивающего агента и (с) материала, имеющего способность к сополимеризации, выбранного из группы, состоящей из соединения сахара, производного сахара, пептида, соединяющего ткань, и полимера, сопряженного с антителами против производных липида; причем полимерный гидрогель является гетерогенным, эластически деформируемым и имеет равновесное содержание воды, по крайней мере, порядка 80%.

2. Полимерный гидрогель по п.1, отличающийся тем, что (a) N-замещенный метакриламид или акриламид выбран из группы, включающей N-моноалкил и N-диалкил метакриламиды и акриламиды, (b) сшивающий агент, содержащий акриламид или его предшественники и (с) полимеризационный материал, представляющий собой сахар, который выбран из группы, состоящей из глюкозамина, N-ацетил глюкозамина и N-ацетил производного неураминовой кислоты.

3. Полимерный гидрогель по п.2, отличающийся тем, что алкил содержит от 1 до 2 атомов углерода.

4. Полимерный гидрогель по п.3, отличающийся тем, что алкил представляет собой гидроксиалкил или радикал аминоалкила.

5. Полимерный гидрогель по п.1, отличающийся тем, что имеет равновесное содержание воды, по крайней мере, порядка 96%.

6. Полимерный гидрогель по п.1, отличающийся тем, что представляет собой ковалентно сшитый, по существу, непрозрачный, гетерогенный материал.

7. Полимерный гидрогель по п.6, отличающийся тем, что имеет вид светлофазной структуры с разделенной фазой, образованной частицами полимера от 1 до 10 мкм, обеспечивающей область с относительно крупными порами, где гидрогель стремится взаимодействовать с тканью организма, и относительно мелкими порами, где он должен взаимодействовать с врастающей тканью.

8. Полимерный гидрогель по п.1, отличающийся тем, что имеет макропористую структуру с фракционной пористостью, составляющей, по крайней мере, от 80 до 90%, удельную площадь зоны, равную, по крайней мере, 100 м²/г, средний диаметр поры примерно 15-35 мкм, свободный объем пор определяется, по крайней мере, величиной 10 мкм, равной 100% фракционной пористости гидрогеля, и гиперпористость, заключенную в пределах 20-30 мкм.

9. Способ получения полимерного гидрогеля для терапевтического применения, отличающийся тем, что включает (а) растворение сшивающего агента в растворителе со свободным радикалом инициатора полимеризации с целью образования раствора, (b) добавление N-замещенного метакриламида или акриламида к раствору, полученному в (а) с целью образования смеси, (с) добавление раствора полимеризационного материала, соединения сахара, производного сахара, пептида, соединяющего ткань, или сопряженного полимера с антителами против производных липида к смеси, полученной в (b) в условиях, обеспечивающих образование полимерного геля.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что включает растворение азо-бис-изобутиронитрила и метилена бис-акриламида в растворителе с целью образования раствора, смешение раствора с N-2-(гидроксипропил)-метакриламидом, добавление к нему глюкозамина или N-ацетил-глюкозамина или N-ацетил-неураминовой кислоты и удаление остаточных продуктов с низкой молекулярной массой и следов инициатора.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что сшивающий агент выбирают из группы, включающей акриламид, его предшественники и дивиниловые сшивающие агенты.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что инициатор полимеризации выбирают из группы, включающей азо-бис-изобутиронитрил, пероксиды, аскорбиновую кислоту, пероксисульфаты и замещенные азасоединения, и применяют в количестве от 0,01 до 2% по массе с учетом образующегося полимерного гидрогеля.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что раствор полимеризующегося материала содержит соединение сахара.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что соединение сахара выбирают из группы, включающей глюкозамин, N-ацетил глюкозамин, N-ацетил производные неураминовой кислоты, полисиаловой кислоты и галактозу.

15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что раствор полимеризующегося материала содержит пептид, соединяющий ткань.

16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что раствор полимеризационного материала содержит сопряженный полимер с антителами против производных липида.

17. Способ по п.12, отличающийся тем, что процесс проходит при температуре между 40 и 60^oС в течение 12 ч.

18. Способ по п.9, отличающийся тем, что добавляют живые клетки ткани или генетически модифицированные клетки к полученному в (с) продукту и полимеризуют эти клетки с полученным продуктом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4