Способ получения ферментных препаратовлизоцил\ов

 

О П И С А Н И Е 22О92О

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскиа

Социалистикескик

Республик ;:;»,. со, ф...»..„ —. -., .:.„у-, с

: — -. .,:, в ф, с Ф ° .-МГ

Зависимое от авт. свидетельства №,1, л, »

T с" Кю 6и 22 10

1 ба ало;: о i -. -.-:. :— сЩ " - =

Заявлено 07.f.1967 (Л 1124352/28-13) с присоединением заявк:i ¹

Приоритет

Опубликовано 01 VI1.1968. Бюллетень ¹ 21

Дата опубликования описания 7.Х.19б8

"i!IIV С 12k

Комйтет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР х ДК 663.18:576.8.093..383 (088.8) Авторы изобретения

И. А. Черкасов и Н. А. Кравченко

Институт органической химии имени H. Д. Зелинского

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

ЛИЗОЦИМОВ

Известен способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем приготовления из этого сырья солевого раствора, содержащего хлористый натрий в концентрации от 0,5 до 1,0 и имеющего рН от 5 до 5,5, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором для удаления несорбирующихся примесей, содержащихся в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов дистиллированной водой.

Полученный известным способом лизоцим представляет собой гомогенный белковый препарат, содержащий примеси около 5% хлористого натрия и следы углеводов.

Для освобождения лизоцима от этих примесей проводят сорбцию лизоцима из раствора, полученного .после первичной сорбции, причем в этот раствор добавляют фосфаты натрия или калия, доводя рН до 8. Примеси удаляют водой, а лизоцим затем десорбируют 0,5—

1,0с о -ной уксусной кислотой.

Для упрощения процесса получения очищенных ферментных препаратов лизоцимов согласно, предлагаемому способу хитин пред варительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой при температуре, предпочтительно равной от 2 до 4, и рН раствора or 2 до 3 С.

По предлагасмому способу солсвой раствор, содержащий лизоцимы, следует приготоьляп путем смешивания исходного сь:рья с бикарDcHHTo;I натрия или со смесью бикарбопата и карбоната аммония до получения раствора с концентрацией солей or 0.5 до 1,0 о и рН 7,9—

8,4.

Кроме того, целесообразно хитин после промывки соленым раствором промывать дистил10 лированной водой для удаления солсй, после чего лизоцим дссорбировать 3 — 5Яо-ной уксуcной кислотой.

Предлагаемый способ заключается в следующем. Получаемый из природного сырья известным способом хитин содержит свободные аминогрулпы, придающие ему свойства анионоооменни"a и снижающие его специфичность как сорбента лизоцимов.

Для устранения этих свойств целесобраз20 но обработать такой хитин азотистой кислотой, в результате чего аминогруппы заменяются гидроксильными группами, не обладающими ионообменными свойствами.

Модификацию хитина ведут в 0„3 — 0,5%ном растворе азотистой кислоты при 2 — 4 С.

По механическим и физико-химическим свойствам полученный при этом хитин не от",è÷àårñÿ от исходного. 1 г модифицированного хитина со средним диаметром частиц от 150

30 до 200 нк сорбирует около 15 яг лизоцпма.

220920

Составитель М. Андреева

Редактор Т. Павлова Текред А. А. Кагпышникова Корректор В. В. Крылова

Заказ 2830/1 Тираж 530 Подписное

ЦНИИПИ Коьиитета по делам нзоорстс пй и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр, Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2

Выделение лизоцима из содерткащего его сырья с помощью полученного .вышеуказанным способом сорбента проводят следующим способом. В исходный раствор (сок, экстракт, биологическую жидкость) вносят бикарбонат натрия (или смесь бикарбоната и карбоната аммония) до концентрации 0,5 — 1,0о/в и устанавливают pII!B интервале от 7,9 до 8,4.

Полученный раствор пропускают через слой хитина. Лизоцим при этом полностью сорбируется на хитине. Несорбиру1ощиеся,примеси, содержащиеся в исходном сырье, удаляют путем промывания сорбента раствором бикарбо ната натрия (или смеси бикарбоната и карбоната аммония) с теми же значениями рН и концентрации.

После этого сорбент промывают водой, удаляя таким образом соли. Лизоцим десорбируют 3 — 5о/о-ной уксусной кислотой. После отмывки его от уксусной кислоты дистиллированной водой хитин может быть использован для очередной операции извлечения лизоцима.

Пример 1. В качестве исходного сырья использовали белок одного куриного яйца (25 мл). Elo разбавляли до 250 мл .1в/0-ным раствором NaHCO3. Полученный раствор пропускали через колонну (2Х30 см) с хитином, диаметр частиц которого составлял от 150 до

200 ик (в колонку предварительно промывали

1 /о-ным раствором NaHCO;). Отмыли 1o/р-ным раствором NaHCO3, контроль за отмывкой проводили путем измерения оптической плотности вытекающего из колонки раствора при

280 ммк на спектрофотометре СФ-4.

Затем колонку промывали водой до удаления NaHCO>, контролируя отмывку, пробой на окрашивание пламени газовой горелки. Лизоцим десорбировали 5 /о -ным раствором

СНзСООН и леофильно высушивали. Выход лизоцима составил около 120 мг.

Ферментативная активность его совпадала с активностью стандартного препарата лизоцима, полу.ченного методом прямой кристаллизации.

П р и м с р 2. В качестве исходного сырья использовали сок (около 400 мл), отжатый из

1 кг неочищенной репы. К соку добавляли сухой КаНСОа до концентрации 1о/о и центри5 фугировали для удаления механических частиц. Затем из этого очищенного раствора выделяли лизоцим так же, как в примере 1. Выход лизоцима составил около 10 мг, ферментативная активность его равнялась 60в/о от ак.

10 тивности лизоцима из белка куриных яиц в расчете на единицу веса лиофильно сухих препаратов.

Предмет изобретения

15 1. Способ получения ферментных препарато|в лизоцимов из содержащего их сырья путем,приготовления из этого сырья солевого раствора, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина соле20 вым раствором для удаления несорбирующихся примесей, содержащихся в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов, отличаюи1ийся тем, что, с целью упрощения процесса получения очищенных ферментных,пре25 паратов, хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификацию хитина проводят при температу30 ре от 2 до 4 и рН раствора от 2 до 3 С.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что солевой раствор, содержащий лизоцимы, приготавливают путем смешивания исходного сырья с бикарбонатом натрия или со смесью

35 бикарбоната и карбоната аммония до получения их концентрации 0 5 — 1>/, и рН раствора

7,9 — 8,4, а в качестве солевого раствора, применяемого для промывки хитина, используюг

1в/о-ный раствор бикарбоната и карбоната

40 аммония.

4. Способ по п. I, отличающийся тем, что хитин после промывки солевым раствором промывают дистиллированной водой, а десорбцию лизоцимов проводят 3 — 5в/,-ной уксусной

45 кислотой.