Способ диагностики чувствительности штаммов mycobacterium tuberculosis к изониазиду с помощью полимеразной цепной реакции - конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов

 

Изобретение относится к медицине. Разработан способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к изониазиду посредством одновременного выявления мутаций в трех основных генах МБТ (katG, inhA, ahpC), обусловливающих в 90% случаев резистентность к этому препарату. Для этого были подобраны праймеры для ДНК трех исследуемых генов, отработаны условия амплификации, обеспечивающие наработку ампликонов ДНК трех генов при одних и тех же условиях, и отработаны условия электрофореза с возможностью выявления мутаций в трех генах на одной электрофореграмме. Изобретение позволяет быстро определить чувствительность МБТ к изониазиду (2 дня) с высокой специфичностью. Способ отличается несложными методическими подходами и может применяться в клинических фтизиобактериологических лабораториях.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis (MБT) к препарату первого ряда - изониазиду [по одновременному обнаружению мутаций в трех основных генах (katG, inhA, ahpC), обусловливающих в 90% случаев резистентность к этому препарату], путем анализа последовательностей ДНК МБТ вышеупомянутых генов с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

Туберкулез в данное время является одним из основных инфекционных заболеваний человека. Ежегодно заболевают 8-10 млн человек и 3 млн умирают от этого заболевания. Ситуация осложняется еще и тем, что увеличивается количество лиц, инфицированных штаммами МБТ, резистентными к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) - изониазиду и рифампицину.

Одним из общепринятых методов определения чувствительности МБТ к химиопрепаратам является их рост на среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) в присутствии ПТП, который очень длителен по времени (2-3 месяца). В связи с этим получаемые результаты часто не актуальны для назначения пациенту адекватного лечения и больной принимает препараты по общим схемам, независимо от индивидуальной чувствительности к назначаемым препаратам. Автоматизированные системы на жидких средах позволяют получить результаты по определению чувствительности к лекарственным препаратам уже через 30-40 дней, что значительно быстрее, чем на среде Л-Й, но также весьма долго. При этом автоматизированные системы ВАСТЕС MGIT (Becton Dickenson) и MB/BacT (Organon Teknika) импортного производства и очень дорогостоящие.

В последние годы в практику фтизиомикробиологических лабораторий все больше внедряются молекулярно-биологические методы детекции МБТ и определения лекарственной чувствительности к ПТП. В связи с расшифровкой генома МБТ для основных препаратов, применяемых в фтизиатрии (изониазид, рифампицин, эритромицин, этамбутол, канамицин), известны гены, мутации в которых, приводят к резистентности к лекарственным препаратам. В первую очередь были изучены мутации, связанные с резистентностью к рифампицину, поскольку основная их часть локализована в определенной последовательности одного гена. В случае изониазида, в ДНК МБТ имеются три основных гена: katG, inh A, ahpC, мутации в которых в 90% случаев обусловливают резистентность микобактерий.

Для детекции бактериальных мутаций разработан широкий спектр методов. Это: аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (ПЦР), достройка цепи меченым дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом, анализ полиморфизма рестрикционных фрагментов, секвенирование, дидезоксифингерпринтинг, метод несовершенного дуплекса, метод структурно-специфичного расщепления нуклеазой, метод "обратной" гибридизации ДНК иммобилизованными на твердой подложке зондами, гибридизация на микрочипах, метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов. Как правило, первым этапом основной части перечисленных методов, является полимеразная цепная реакция. Каждый из представленных методов имеет как свои достоинства, так и недостатки. Эти методы в настоящее время, главным образом, применяются в научно-исследовательских лабораториях для решения узких теоретических проблем (Delgado M.B., Telenti A. Detection of Fluoroquinolone Resistance Mutation in M.tuberculosis. In PCR Protocols for Emerging Infections Diseases. 1996, ASM press, Washington, P. 138-143; Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M., Matter L. , Schopfer K., Bodmer T. Detection of rifampin resistance mutation in M. tuberculosis. Lancet. 1993. 341, Р.647-650; Caugant D.A., Sandven P., Eng J. , Jeque Т. , Tonjum T. Detection of Rifampin Resistance Among Isolates of Mycobacterium tuberculosis from Mozambigue. 1995, 4, P.321-325).

Аналогом метода, обсуждаемого в данном изобретении, является комплекс, объединяющий в себе полимеразную цепную реакцию с дальнейшим анализом ампликонов методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (PCR-SSCP).

Данный комплекс методов состоит из нескольких этапов: 1. Исследуемая последовательность ДНК изучаемого объекта клонируется методом ПЦР.

2. ПЦР-продукт подвергается термической денатурации в присутствии дестабилизирующих двойную спираль агентов, например формамида, и переносится на лед.

3. Смесь наносят на полиакриламидный гель и разделяют с помощью высоковольтного электрофореза.

4. Окрашивание геля производят с помощью красителя азотнокислого серебра или Sybr Green 2.

Исходные последовательности имеют различную электрофоретическую подвижность, связанную с геометрическими характеристиками надмолекулярных структур, образуемых данной последовательностью. Получаемая картина специфична для исследуемой последовательности, причем в случае замены одного нуклеотида в цепи происходит изменение картины, получаемой с помощью электрофореза, т. е. нити амплификационных денатурированных последовательностей с исследуемых участков ДНК расходятся на разное расстояние друг от друга. Степень расхождения денатурированных нитей выявляется с помощью окрашивания геля.

Таким образом, данный метод является достаточно доступным (метод полимеразной цепной реакции, методика электрофореза применяются сейчас во всех биохимических лабораториях), специфичным (работа проводится непосредственно с ДНК бактерий) и достаточно чувствительным (поскольку методом полимеразной цепной реакции выявляется ДНК единичных клеток).

Прототипом данного изобретения является применение этого метода для изучения мутаций в генах ДНК МБТ, ответственных за резистентность к изониазиду у больных туберкулезом (Pretorius G.S., van Helden P.D., Sirgel F., Eisenach K. D. Mutation in katG Gene Seguences in Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of M.tuberculosis Are Rare. Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39, 10, P.2276-2281; Bahrmand A., Bakaev V. Rapid detection of multidrug-resistant tuberculosis using molecular genetic metods. Int. J.Tubercl and Lung Disease. 1998. 2, 11, P.346; Gonzalez N., Torres J., Aznar J., Polomares J. C. Molecular analysis of rifampin and isoniazid resistance of M. tuberculosis clinical isolates in Seville. Tubercl and Lung Disease. 1999. 79, 3, P.187-190).

Названные авторы, в основном, изучали устойчивость к изониазиду, связанную с мутациями в одном гене katG, которые характерны только для 50-60% резистентных штаммов МБТ, тем самым получая почти в половине случаев ложноотрицательные результаты. Другие авторы, применяя другие праймеры, используя другую амплификационную систему, изучали резистентность к изониазиду, связанную с другими генами МБТ (Rinder Н., Thomschke A., Rusch-Gerdes S., Bretzel G., Feldman К., Rifai M., Loscher Т. Significanse of ahpC promoter mutations for the prediction of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1988. 17(7), P.508-501). Таким образом, работы представляют поисковые исследования по анализу роли какого-либа одного гена.

Отличия предлагаемого нами способа состоят в следующем. Исследования чувствительности к изониазиду проводятся одновременно по трем генам (katG, inhA, ahpC), которые определяют 90% резистентных к изониазиду штаммов МБТ. Для этих трех генов подобраны пары праймеров и одна программа амплификации, когда после электрофореза на одной электрофореграмме можно выявить резистентность к изониазиду сразу по трем генам. В результате, за короткий срок (два дня), используя один биологический образец, можно определить чувствительность к изониазиду по трем генам, обеспечивая вероятность выявления резистентности в 90% случаев.

Для решения проблемы были разработаны условия для каждого из этапов метода.

Для синтеза нужных фрагментов ДНК МБТ различных генов было подобрано несколько пар праймеров, которые затем проверяли на остальных этапах способа. Из нескольких пар праймеров для каждого гена были отобраны следующие: для гена katG: 1-й - 5^/ ССС CGA ACC CGA GGC TGC Т 3^/, 2-й - 5^/ ССА GCA TCG TCG GGG AGC G 3^/, для гена ahpC: 1-й- 5^/ ТСТ ССТ CAT CAT CAA AGC GG3^/, 2-й- 5^/ CTG CTG ААС САС TGC TTT GC 3^/, для гена inhA: 1-ый- 5^/ CGT ААС ССС AGT GCG ААА G 3^/, 2-й -5^/ACT GAA CGG GAT ACG AAT GG 3^/.

Далее был подобран состав амплификационного буфера, где важными составляющими являются тип буфера, концентрация ионов магния, концентрация трифосфатов. После подбора концентраций ингредиентов состав амплификационной среды в отличие от имеющихся аналогов был следующим: в 30 мкл среды содержалось 10 мМ Трис-НСl рН 8,8, 50 мМ KCl, 0,5% Твин 20, 2,5 мМ MgCl₂, 5% формамида, по 200 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 3 мкл образца. Этот состав буфера позволил одновременно амплифицировать ДНК трех генов с последующим выявлением продуктов амплификации с помощью электрофореза.

Далее был подобран режим амплификации, варьируя температурами отжига для каждой пары праймеров, временем каждого цикла и количеством циклов. Важным этапом исследования было подобрать условия амплификации, которые были бы оптимальными для достаточного синтеза изучаемых фрагментов ДНК МВТ для трех исследуемых генов. Выбранные условия представляют из себя следующее: 1-й этап: 95^o - 5 мин, 60^o - 2 мин; 2-й этап: 72^o - 1 мин, 95^o - 40 с, 60^o - 1 мин (35 циклов); 3-й этап: 72^o - 10 мин.

Далее подбирали условия для изучения конформационного полиморфизма одноцепочечных ампликонов, полученных в результате предыдущего этапа, которые включали в себя: условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида с глицерином и состав буфера); условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура). Подобранные условия следующие: денатурация проводится при 95^o - 10 мин, для денатурации 3 мкл образца смешивают с 3 мкл денатурирующего раствора, разделение денатурированных ампликонов проводят в 8%-ном полиакриламидном геле с 5%-ным глицерином при температуре 8^oС, напряжение 450 вольт, 5 часов, в ТВЕ буфере.

Окраску электрофореграмм проводили красителем Sybr Green 2.

Детекция результатов. После окраски электрофореграмму помещают под УФ (трансиллюминатор), длина волны - 254 нм. Окрашенные денатурированные ампликоны представляют собой по две белые светящиеся полоски для каждого образца. Для определения мутаций в каждом гене, наряду с ампликонами исследуемого образца, исследуют и ампликоны ДНК МБТ чувствительного штамма. Если штамм МБТ резистентен к изониазиду, расстояние между денатурированными нитями амплифицированных фрагментов ДНК резистентных штаммов отличается от расстояния между нитями амплифицированных фрагментов ДНК чувствительного штамма, и так для трех генов.

Изучение чувствительности метода, проведенное предлагаемым способом по выявлению минимального количества ДНК МБТ в пробе показало, что с помощью отработанного метода удается выявить ДНК, содержащееся примерно в трех клетках МБТ.

Исследования по выявлению резистентности к изониазиду проводили на клинических образцах и клинических изолятах от этих образцов, выращенных на жидких средах и среде Л-Й. Образцы получали от больных с разными формами туберкулеза, находящихся на лечении в МНПЦБТ. Исследования демонстрировали одинаковую электрофоретическую картину как для клинического образца, так и клинического изолята для трех исследуемых генов.

Формула изобретения

Способ диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis к изониазиду, включающий применение полимеразной цепной реакции и анализа полученных ампликонов с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, отличающийся тем, что производится анализ ДНК Mycobacterium tuberculosis одновременно по трем генам с использованием праймеров для katG: 5' ССС CGA АСС CGA GGC TGC Т 3' и 5' ССА GCA TCG TCG GGG AGC G 3', для гена inhA: 5' CGT AAC ССС AGT GCG AAA G 3' и 5' ACT GAA CGG GAT ACG AAT GG 3' и для гена ahpC: 5' TCT CCT CAT CAT CAA AGC GG 3' и 5' CTG CTG AAC CAC TGC TTT GC 3', с использованием одной программы амплификации для всех трех генов (1-й этап: 95^o-5 мин, 60^o-2 мин; 2-й этап: 72^o-1 мин, 95^o-40 с, 60^o-1 мин (35 циклов), 3-й этап: 72^o-10 мин), после чего продукты амплификации разделяют в 8%-ном полиакриламидном геле с 5%-ным глицерином при напряжении 450 В, 5 ч, при 8^oС, и денатурированные ампликоны от разных генов после окраски выявляются на одной электрофореграмме в виде двух белых светящихся полосок с расстоянием между ними, отличном от расстояния между двумя полосками денатурированных ампликонов ДНК чувствительного к изониазиду штамма Mycobacterium tuberculosis.