Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба

 

Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным болезням. Способ обеспечивает упрощение и повышение доступности обнаружения антигенов туляремийного микроба. Проводят фиксацию исследуемого материала на твердой пористой подложке, обработку подложки 2% бычьим сывороточным альбумином, промывание подложки отмывающим раствором, обработку подложки раствором меченых специфических IgG, обработку "проявляющим" раствором, промывку, сушку и визуальную регистрацию полученных результатов, при этом исследуемый материал наносят на подложку с размером пор 0,17-0,6 мкм, высушивают при 20-25^oС в течение 20-30 мин, затем подложку дважды отмывают физраствором, содержащим 0,05% Твина-20, проводят обработку бычьим сывороточным альбумином в течение 10-20 мин, после чего подложку дважды отмывают физраствором, содержащим 0,05% Твина-20, обрабатывают раствором специфических IgG, меченных коллоидным серебром, в течение 20-30 мин при 20-25^oС, дважды промывают физраствором, содержащим Твин-20, и однократно дистиллированной водой, после чего обрабатывают в течение 5 мин "проявляющим" раствором, содержащим метол, лимонную кислоту и азотно-кислое серебро при следующем соотношении компонентов: метол - 0,2 г, лимонная кислота - 0,5 г, азотно-кислое серебро - 0,2 г, дистиллированная вода - 100 г.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования различного материала на наличие возбудителя туляремии или его антигенов.

Несмотря на то, что в практике здравоохранения используется ряд методов обнаружения корпускулярных или растворимых антигенов туляремийного микроба, все они не лишены тех или иных недостатков, поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных методов диагностики туляремии остается актуальной задачей.

В последнее время для обнаружения антигенов туляремийного микроба достаточно широко используется иммуноферментный метод, предполагающий применение в качестве твердой фазы полистироловых микротитровальных планшетов (Меринов С. П. , Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Меринова Л.В. // Методические рекомендации по обнаружению туляремийного микроба иммуноферментным методом. Иркутский н. -и. противочумный ин-т Сибири и Дальнего Востока МЗ СССР. - Иркутск, 1983, 7 с.). Этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако имеет ряд существенных недостатков. К их числу можно отнести необходимость привлечения квалифицированного персонала для выполнения методики, использование канцерогенных, токсичных для здоровья человека и вредных для окружающей среды ферментных субстратов, фоновое окрашивание в лунках при исследовании биологических объектов, содержащих эндогенную пероксидазу, нестабильность растворов субстратов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения антигенов туляремийного микроба в дот-иммуноанализе с помощью IgG, меченных пероксидазой хрена (Полунина Т.А. Разработка дот-иммуноферментного анализа для обнаружения клеток возбудителя особо опасных инфекций // Автореф. дис. канд. мед. наук. 03.00.07. - Саратов, 1990, 19 с.). Однако дот-иммуноанализ, являясь модификацией планшетного иммуноферментного метода, обладает всеми его преимуществами и недостатками. К числу последних относятся трудоемкость получения и очистки пероксидазных конъюгатов, необходимость использования дорогостоящих импортных реактивов, канцерогенность и токсичность для человека и вредность для окружающей среды некоторых ферментных субстратов.

Цель изобретения - упрощение и повышение доступности способа обнаружения антигенов туляремийного микроба, исключение из работы канцерогенных реагентов.

Поставленная цель достигается тем, что для проведения анализа используют твердую нитроцеллюлозную подложку с размером пор 0,17-0,60 мкм, на которую адсорбируют исследуемый образец, содержащий корпускулярные или растворимые антигены туляремийного микроба. Не связавшийся материал отмывают физраствором, содержащим 0,05% твина 20 ("отмывающий" раствор), а свободные сайты связывания на подложке инактивируют в течение 10-20 мин 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина с последующей двукратной промывкой "отмывающим" раствором, далее подложку обрабатывают в течение 20-30 мин при 20-25^oС противотуляремийными IgG, меченными коллоидным серебром, затем твердую фазу дважды промывают "отмывающим" раствором и один раз - дистиллированной водой. Конечную обработку подложки осуществляют в течение 5 мин реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду ("проявляющий" раствор) при следующем соотношении компонентов (г): метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем нитроцеллюлозную подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что используют твердую нитроцеллюлозную подложку с размером пор 0,17-0,60 мкм, на которую наносят исследуемый образец, высушивают в течение 20-30 мин при 20-25^oС. Удаление не связавшегося с подложкой материала проводят "отмывающим" раствором, свободные участки связывания на подложке инактивируют раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 10-20 мин. Далее подложку обрабатывают в течение 20-30 мин при 20-25^oС противотуляремийными IgG, меченными коллоидным серебром, после чего дважды промывают "отмывающим" раствором и один раз дистиллированной водой, а конечную обработку осуществляют в течение 5 мин "проявляющим" раствором, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду при следующем соотношении компонентов, (г): метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем нитроцеллюлозную подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ обнаружения антигенов туляремийного микроба, который осуществлялся бы на твердых пористых нитроцеллюлозных подложках с применением в качестве диагностикума противотуляремийных IgG, меченных коллоидным серебром. Предлагаемые режимы проведения анализа позволяют достичь поставленной цели - упростить и повысить доступность способа обнаружения антигенов туляремийного микроба, исключить из работы канцерогенные и токсичные реагенты. При этом способ экспрессен, прост в постановке и учете результатов реакции, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием, специальной квалификации персонала, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность получаемых результатов.

Данный способ обнаружения антигенов туляремийного микроба может быть использован как в клинических и научно-исследовательских лабораториях, так и полевых условиях при эпидемиологическом и эпизоотологическом надзоре в природных очагах данной инфекции.

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения антигенов туляремийного микроба соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ обнаружения антигенов туляремийного микроба выполняется следующим образом. Исследуемый материал, разведенный в физрастворе, предположительно содержащий корпускулярные или растворимые антигены туляремийного микроба, наносят в виде капель объемом 2 мкл на полоску твердой пористой подложки с размером пор 0,17-0,60 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, мембранные фильтры "Synpor", Чехия). После полного впитывания материала (высыхание при 20-25^oС в течение 20-30 мин) подложку помещают в чашку Петри и дважды промывают физраствором, содержащим 0,05% твина 20, для удаления не связавшегося материала. Свободные участки иммунологически активной твердой фазы "забивают" в течение 10 -20 мин инертным белком - 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в физрастворе, после чего дважды промывают физраствором, содержащим 0,05% твина 20. Иммунное проявление адсорбированного на подложке антигена осуществляют обработкой противотуляремийными IgG, меченными коллоидным серебром, приготовленными стандартным способом (Полтавченко А. Г. и др. // Журн. микробиол. - 1998. - 2. - С. 108-111), в течение 20-30 мин при легком покачивании. После двукратного отмывания физраствором, содержащим 0,05% твина 20, и однократного - дистиллированной водой подложку погружают на 5 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимых или корпускулярных антигенов туляремийного микроба) и в случае содержания в исследуемых образцах антигенов возбудителя туляремии формируются четкие, стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость, суспензии здоровых животных, не инфицированные объекты окружающей среды и т.п.) и при отсутствии антигенов туляремийного микроба в исследуемых образцах формирования окрашенных пятен не наблюдается, подложка остается чистой. После выдерживания твердофазного носителя в реактиве с метолом, лимонной кислотой и азотнокислым серебром допускается появление небольшого фонового окрашивания его поверхности в бледно-серый цвет, которое при последующем высушивании на воздухе полностью исчезает.

Пример 1. Образец водопроводной воды, искусственно контаминированный корпускулярным антигеном туляремийного микроба, наносят в виде капель на полоску нитроцеллюлозной мембраны с размером пор 0,60 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при 20^oС в течение 20 мин) мембрану помещают в чашку Петри и дважды промывают "отмывающим" раствором. Оставшиеся свободные активные участки "забивают" в течение 10 мин 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в физрастворе, после чего дважды промывают "отмывающим" раствором. Иммунное проявление адсорбированного на мембране антигена осуществляют при 20^oС обработкой противотуляремийными IgG, меченными коллоидным серебром, в течение 30 мин при легком встряхивании. После двукратного промывания "отмывающим" раствором и однократного дистиллированной водой, мембрану погружают на 5 мин в "проявляющий" раствор, состоящий из 0,2%-ного метола, 0,5%-ной лимонной кислоты и 0,2%-ного азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Далее мембрану промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом образце (водопроводная вода) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация корпускулярного антигена туляремийного микроба) формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, мембрана остается чистой. Чувствительность анализа составляет ≥4•10⁴м.к./мл корпускулярных антигенов туляремийного микроба.

Пример 2. Исследуемый раствор, содержащий липополисахарид туляремийного микроба, наносят в виде капель на мембранный фильтр "Synpor" с размером пор 0,17 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при 25^oС в течение 30 мин) фильтр помещают в чашку Петри и дважды промывают "отмывающим" раствором. Оставшиеся свободные активные участки "забивают" в течение 20 мин 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в физрастворе, после чего дважды промывают "отмывающим" раствором. Иммунное проявление адсорбированного на фильтре антигена осуществляют при 25^oС обработкой противотуляремийными IgG, меченными коллоидным серебром в течение 20 мин при легком встряхивании. После двукратного промывания "отмывающим" раствором и однократного - дистиллированной водой фильтр погружают на 5 мин в "проявляющий" раствор, состоящий из 0,2%-ного метола, 0,5%-ной лимонной кислоты и 0,2%-ного азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом растворе, содержащем липополисахарид туляремийного микроба, и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимого антигена туляремийного микроба) формируются четкие, стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательном контроле (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, фильтр остается чистым. Чувствительность анализа составляет ≥5 нг/мл растворимых антигенов туляремийного микроба.

Указанный способ обнаружения антигенов туляремийного микроба использован при анализе 100 проб (штаммы туляремийного микроба разных подвидов, имеющихся в лаборатории, искусственно контаминированные объекты внешней среды, растворимые антигенные фракции, изолированные из туляремийного микроба, материал от экспериментально зараженных животных).

Исследование материала, содержащего антигены туляремийного микроба, параллельно проводили дот-иммуноанализом с использованием пероксидазной метки. По чувствительности и специфичности предложенный способ обнаружения антигенов туляремийного микроба не уступает способу - прототипу. Однако предлагаемый способ проще, доступнее, безопаснее для здоровья персонала, экологически чище. Простота проведения анализа, независимость от сложного приборного обеспечения и дорогостоящих реактивов, высокая чувствительность и специфичность позволяют использовать его как в лабораторных, так и полевых условиях.

Формула изобретения

Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба, включающий фиксацию исследуемого материала на твердой пористой подложке, обработку подложки 2% бычьим сывороточным альбумином, промывание подложки отмывающим раствором, обработку подложки раствором меченых специфических IgG, обработку "проявляющим" раствором, промывку, сушку и визуальную регистрацию полученных результатов, отличающийся тем, что исследуемый материал наносят на подложку с размером пор 0,17-0,6 мкм, высушивают при 20-25^oС в течение 20-30 мин, затем подложку дважды отмывают физраствором, содержащим 0,05% Твина-20, проводят обработку бычьим сывороточным альбумином в течение 10-20 мин, после чего подложку дважды отмывают физраствором, содержащим 0,05% Твина-20, обрабатывают раствором специфических IgG, меченых коллоидным серебром, в течение 20-30 мин при 20-25^oС, дважды промывают физраствором, содержащим Твин-20, и однократно дистиллированной водой, после чего обрабатывают в течение 5 мин "проявляющим" раствором, содержащим метол, лимонную кислоту и азотнокислое серебро при следующем соотношении компонентов, г: Метол - 0,2 Лимонная кислота - 0,5 Азотнокислое серебро - 0,2 Дистиллированная вода - 100п