Способ оценки повреждения днк (варианты)

 

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и касается способа оценки повреждения ДНК. Представленный способ включает получение контрольной двухцепочечной ДНК-матрицы с первой и второй комплементарными цепями, каждая из которых имеет специфический для цепи праймерный сайт, и праймерные сайты разделены, по меньшей мере, 5000 парами оснований, соединение первой и второй комплементарной цепи с праймерами, осуществление количественной амплификации с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, повторение указанных выше стадий с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей, подвергнутой воздействиям ДНК-повреждающих условий, оценку повреждения ДНК путем определения снижения степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице. Способ по настоящему изобретению позволяет производить анализ ДНК длиной более 5000 п. о., а также производить контроль генетических повреждений, которые произошли вследствие самоиндуцированного воздействия генотоксинов. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 28 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Способ оценки повреждения ДНК в испытываемой двухцепочечной ДНК-матрице, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу в количестве 1-30 нг с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей ДНК имеет специфический для цепи праймерный сайт; соединяют первую и вторую комплементарные цепи в смеси с праймерами к специфическому для цепи праймерному сайту на каждой комплементарной цепи; осуществляют в смеси количественную амплификацию ДНК; повторяют указанные выше стадии с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей в количестве 1-30 нг, подвергнутой воздействиям ДНК-повреждающих или потенциально ДНК-повреждающих условий; оценивают повреждения ДНК путем определения снижения степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются, по меньшей мере, 5000 парами оснований.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что двухцепочечная ДНК-матрица является ген-специфической двухцепочечной ДНК-матрицей.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество контрольной и испытываемой ДНК одинаковое и составляет от около 5 до 15 нг ДНК.

4. Способ диагностирования эффективности противоопухолевой терапии у пациента, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу в количестве 1-30 нг от пациента до лечения химиотерапевтическими агентами, причем указанная контрольная ДНК-матрица имеет первую и вторую комплементарную цепи ДНК, и каждая комплементарная цепь ДНК имеет специфический для цепи праймерный сайт; соединяют первую и вторую комплементарные цепи ДНК в смеси с праймерами к специфическому для цепи праймерному сайту на каждой комплементарной цепи ДНК; осуществляют в смеси количественную амплификацию ДНК, повторяют указанные выше стадии с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей, полученной от пациента после или во время указанной терапии, причем пациент подвергался воздействию ДНК-повреждающих или потенциально ДНК-повреждающих условий; оценивают повреждение ДНК в контрольной и испытываемой ДНК-матрице путем определения более низкой степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, причем эффективность указанной терапии прямо пропорциональна повреждению ДНК, выявленной в испытываемой ДНК-матрице, отличающийся тем, что указанную амплификацию ДНК осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований.

5. Способ оценки повреждения ДНК, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей имеет специфический для цепи праймерный сайт и имеет такие повреждения, как 8-оксидезоксигуанозин или формамидопиримидин; обрабатывают часть контрольной ДНК-матрицы гликозилазой/эндонуклеазой или формамидопиримидин-ДНК-гликозилазой для превращения повреждения ДНК в разрыв цепи, в результате чего образуется испытываемая двухцепочечная ДНК-матрица; соединяют по отдельности первую и вторую комплементарные цепи контрольной и испытываемой ДНК-матрицы в количестве 1-30 нг с праймерами к специфическим для цепей праймерным сайтам на каждой из комплементарных цепей; осуществляют количественную амплификацию ДНК на контрольной и испытываемой ДНК-матрице; оценивают повреждение ДНК путем определения снижения степени амплификации ДНК испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, отличающийся тем, что амплификацию ДНК осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований.

6. Способ оценки повреждения ДНК, индуцированного цисплатином, включающий следующие стадии: получают испытываемый образец от пациента, подвергаемого цисплатиновой терапии, причем указанный испытываемый образец содержит двухцепочечную ДНК-матрицу с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей имеет специфический для цепи праймерный сайт; обрабатывают часть испытываемого образца количеством цианид-иона, вытесняющего цисплатиновые аддукты из ДНК, с образованием второй двухцепочечной ДНК-матрицы, включающей контрольный образец; соединяют по отдельности первую и вторую комплементарные цепи ДНК в количестве 1-30 нг испытываемого и контрольного образцов с праймерами для специфического для цепи праймерного сайта на каждой из комплементарных цепей; осуществляют количественную амплификацию ДНК на испытываемом и контрольном образцах, при этом пониженная степень амплификации испытываемого образца по отношению к контрольному образцу является мерой индуцированного цисплатином повреждения ДНК, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74