Способ количественной оценки результатов иммунохроматографического анализа

 

Изобретение относится к иммунологии. Сущность изобретения заключается в том, что иммунохроматографический стрип помещают в фиксирующее приспособление, имеющее прорезь, соответствующую тест-зоне стрипа для прохождения и отражения светового потока, определяют оптическую плотность полученного отражения с разрешением от 400•600 до 600•600 dpi и по ее величине оценивают количество аналита. Технический результат - детектирование результатов исследований без использования специализированных приборов. 1 табл. , 3 ил.

Изобретение относится к иммунологии, в частности к оценке результатов иммунологических анализов.

Цель изобретения - обеспечение возможности детектирования колориметрических результатов исследований без использования специализированных приборов.

Предшествующий уровень техники.

Известны многочисленные устройства для количественной детекции стрипов и содержимого лунок плоскодонных плашек (патенты AU 7032794 A1, US 5408535, US 4710031, US 5671290, US 4810096, JP 10274624 A2).

Наиболее близкий аналог предлагаемого изобретения описан в патенте US 5408535 на "Video test strip reader and method for evaluating test strips". Предлагается ридер для стрипов, который позволяет проводить визуальную оценку хроматографических стрипов. В ридере использован блок формирования видеоизображений рассматриваемого поля стрипа, несущего интересующую информацию. Этот блок преобразует получаемый аналоговый сигнал в видеоизображение и сохраняет изображение в форме массива пикселей, содержащих информацию о видеоизображении. Каждый пиксель содержит информацию о цвете в трехцветном формате (красный, синий, зеленый). Массив анализируется процессором, который определяет местоположение и ориентацию контрольных и опытных поверхностей и дает возможность, сравнивая их, вычислять соответствующие результаты (например, концентрации компонентов реакции).

Однако все предлагаемые аппараты не являются универсальными и зачастую представляют собой закрытые или частично закрытые системы.

Сущность изобретения Предлагаемые способ и приспособление позволяют проводить количественную регистрацию оптического сигнала иммунохроматографических стрипов с любой геометрией тестируемых зон.

Считывание оптической информации с иммунохроматографических стрипов осуществляли с помощью планшетного сканера, вводящего оптическую информацию в компьютер, программного светофильтра и программ, измеряющих оптическую плотность полученного изображения.

Мы использовали планшетный сканер с оптическим разрешением от 400•600 до 600•600 dpi. Выбор данного диапазона разрешения был обусловлен двумя факторами: при меньшем оптическом разрешении для точной регистрации оптической плотности разрешение недостаточно, а при большем существенно увеличиваются системные требования к компьютеру и возрастает время анализа изображения из-за многократно большего размера файла со сканированным изображением. Сканирование изображений производили в различных режимах, подбирая оптимальный. Для фиксации стрипа на планшете сканера и минимизации оптических искажений полученного изображения, что приводит к искажению результатов, мы использовали специальное фиксирующее приспособление. Фиксирующее приспособление состоит из черного непрозрачного экрана, в котором вырезаны вдоль оси перемещения оптического датчика сканера фиксаторы для стрипов с прорезями для тест-зоны стрипа.

Изобретение поясняется чертежами, где: на фиг.1 показано фиксирующее приспособление для стрипов, вид сверху; на фиг.2 - фиксирующее приспособление, вид сбоку; на фиг.3 - фиксирующее приспособление, вид спереди.

На фиг.1 изображен один из конструктивных вариантов фиксирующего приспособления для стрипов. Приспособление состоит из черного непрозрачного экрана 1, в котором вырезаны вдоль оси перемещения оптического датчика сканера фиксаторы для стрипов 2 с прорезями для тест-зоны стрипа 3. Экран 1 имеет размер, равный размеру планшеты сканера, что предотвращает попадание света от внешних источников на зеркало оптической системы сканера и в дальнейшем на оптический датчик, что минимизирует оптические искажения полученного изображения тест-зоны стрипа. На фиг.2 и 3 изображено это же приспособление в разрезе по осевой линии, фронтальная и боковая проекции соответственно.

Пример.

На нитроцеллюлозную мембрану наносили серийные разведения моноклональных антител класса lgG2a в концентрациях 1; 0,5; 0,25; 0,12; 0 мг/мл, полосой толщиной 1 мм. Антитела были растворены в 0,001М Трис-НСl буфере с рН 7,2. Мембрану высушивали в потоке теплого воздуха и монтировали таким образом, что снизу, параллельно нанесенной полосе антител, находилась полоса стекловолоконного фильтра, а сверху - параллельная нанесенной полосе полоса фильтровальной бумаги. И стекловолокно, и фильтровальная бумага были наклеены на пластмассовую подложку таким образом, что их край на 5 мм перекрывал нитроцеллюлозную мембрану. После монтирования полученный блок для иммунохроматографии разрезали перпендикулярно нанесенной полосе на стрипы шириной 5 мм. Стрипы погружали на 5 мм концом со смонтированным стекловолокном в раствор конъюгата коллоидного золота с диаметром частиц 25 нм с протеином А на 2% растворе казеина. После 10-минутной хроматографии стрипы высушивали в потоке теплого воздуха, помещали в фиксирующее приспособление таким образом, что их тест-зоны находились точно напротив сквозных прорезей и были обращены в сторону источника света и датчика сканера. Затем сканировали изображение тест-зон стрипов. Тест-зоной называют область стрипа, в которой происходят иммобилизация и визуализация продуктов иммунохроматографической реакции. В данном случае тест-зоной служила прямоугольная область на нитроцеллюлозе, в которой были иммобилизованы антитела. Полученное изображение анализировали при помощи программы "SigmaScan Pro 5" (Copyright 1987-1999 SPSS Inc.), используя для оценки изображения поверхностей тест-зон с применением синего программного светофильтра при разрешениях 400•600 и 600•600 dpi. Как параметр для оценки использовали среднюю оптическую плотность. Полученные данные по светоотражению преобразовали по формуле А=1/D, где А - оптическая плотность в относительных единицах, а D - среднее светоотражение в относительных единицах. После построения графиков выяснилось, что график равномерно монотонен и позволяет использовать его в качестве калибровочной кривой для оценки иммунохроматографического анализа. Причем графики, полученные при разрешениях 400•600 и 600•600 dpi, практически совпали. При попытке получения графиков при разрешении менее чем 400•600 dpi они утрачивали монотонность, а при разрешении более чем 600•600 dpi резко возрастали системные требования к обрабатывающим изображение устройствам без улучшения качества обработки.

Затем на три стрипа нанесли растворы иммуноглобулина с концентрацией 0,70; 0,30; 0,15 мг/мл. Оптическая плотность этих иммунохроматограмм, обработанная так же как и оптические плотности точек кривой, была нанесена на ординату графика калибровочной кривой. Полученные ординаты образцов были спроецированы на калибровочную кривую и из точек пересечения проекции с кривой были опущены перпендикуляры к оси абсцисс, на которой предварительно были отмечены концентрации точек кривой. Таким образом были получены абсциссы исследуемых точек, численное значение которых является аппроксимированным значением концентрации иммуноглобулинов в образце. В таблице представлены данные сравнения концентраций иммуноглобулинов в исследуемых растворах, измеренные с помощью предложенного нами метода и спектрофотометрически. Как видно из таблицы, различие концентраций, полученных этими двумя методами, не превышает 7%. Так как в аналогичных иммунологических методах допускается погрешность до 10%, полученные данные дают возможность считать предложенный метод пригодным для оценки иммунохроматограмм.

Таким образом, предложенный метод дает возможность количественной оценки иммунохроматограмм.

Формула изобретения

Способ количественной оценки результатов иммунохроматографического анализа с использованием иммунохроматографического стрипа, отличающийся тем, что стрип помещают в фиксирующее приспособление, имеющее прорезь, соответствующую тест-зоне стрипа для прохождения светового потока и его отражения, затем оценивают оптическую плотность полученного отражения с разрешением от 400×600 до 600×600 dpi и по ее величине оценивают количество аналита.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4