Способ получения дисахарида

 

Изобретение относится к способу получения дисахарида клеточной стенки культуры Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus) (О-(-2-ацетамидо)-2-дезокси-бета-D-глюкопиранозил)-(1→4)-ацетамидо-3-О-(D-1-карбоксиэтил)-2-дезокси-D-глюкозы, используемого в качестве исходного сырья для получения биологически активных веществ. Способ включает культивирование штамма-продуцента Micrococcus lysodeikticus (luteus), обработку клеток водным раствором ацетона, ферментативный гидролиз клеток лизоцимом, ультрафильтрацию. Очистку дисахарида проводят на сульфокатионите, затем концентрируют обратным осмосом и проводят хроматографическую очистку на высокоосновном анионите до регистрации на выходе из колонки соединения, имеющего максимум поглощения при длине волны 260 нм, с последующим элюированием раствором хлорида натрия. Продолжают очистку на нейтральном гидрофильном сорбенте с последующей заменой противоиона на сульфокатионите и выделением целевого продукта упариванием и лиофилизацией. Способ упрощает технологию и повышает выход дисахарида.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения дисахарида клеточной стенки культуры Micrococcus lysodeikticus (luteus) (O-(-2-ацетамидо)-2-дезокси-бета-D-глюкопиранозил)-(1→4)-ацетамидо-3-O-(D-1-карбоксиэтил)-2-дезокси-D-глюкозы, используемого в качестве исходного сырья для получения биологически активных веществ.

Известен ряд способов получения дисахарида, заключающихся в выращивании биомассы Micrococcus lysodeikticus (luteus), последующих ферментативном гидролизе клеточных стенок лизоцимом, очистке на сульфокатионите и концентрировании дисахарида, его хроматографической очистке на высокоосновном анионите, обессоливании на сульфокатионите в Н-форме, окончательной очистке на нейтральном гидрофильном сорбенте и выделении целевого продукта упариванием и/или лиофилизацией.

Известен способ получения дисахарида, состоящий в том, что гидролизат, полученный в результате воздействия лизоцима на клеточную стенку, подвергают хроматографической очистке на колонках с активным углем и высокоосновным анионитом с функциональными триметиламмониевыми группами, после чего выделяют дисахарид (Sharon N., Osawa Т., Flowers H.M.. Jeanioz R.W., Isolation and Study of the Chemical Structure of a Disacchride from Micrococcus lysodeikticus Cell Walls, The Journal of Biological Chemistry, v.241, №1, 1966, 223-230). В этом случае десорбцию дисахарида проводят в градиенте концентраций уксусной кислоты, однако в этих условиях не удается добиться высокой степени очистки дисахарида от примесей и пигментов. Кроме того, получаемый по этому способу препарат содержит значительное количество сопутствующих пептидогликанов, что осложняет его последующую очистку с применением нейтрального сорбента и приводит к потерям целевого продукта.

Известен способ получения дисахарида, состоящий в том, что после энзиматической обработки клеточной стенки культуры Micrococcus lysodeicticus используют ионообменную хроматографию на ECTEOLA-целлюлозе, содержащей функциональные средне- и слабоосновные аминогруппы, проводя элюирование 0,01 М фосфатным буфером с рН 6,1, содержащим хлорид натрия в концентрации до 0,8 М, после рехроматографии выделенной фракции на ECTEOLA-целлюлозе ее подвергают обработке на сульфокатионите в Н-форме, после чего выделяют целевой продукт путем лиофилизации (Hase S., Matsushima Y., Structural Studies on a Glucose-containing Polysaccharide Obtained from Cell Walls of Micrococcus lysodeikticus, J. Biochem (Tokyo), 1972, 72 (5) 1117-1128). Недостатком способа является необходимость использования высоких концентраций хлорида натрия, что затрудняет последующую окончательную очистку целевого продукта. Таким образом, по этому способу также не удается добиться высокой степени очистки дисахарида от сопутствующих примесей.

Известен наиболее близкий к заявляемому способ, заключающийся в последовательных операциях культивирования продуцента Micrococcus lysodeicticus, на средах содержащих пептон и дрожжевой экстракт, гидролиза клеток лизоцимом, удаления белков ультрафильтрацией, фильтрации через сульфокатионит, концентрирования обратным осмосом, хроматографической очистки на высокоосновном анионите Purolite A860S, обессоливания полученного раствора на сульфокатионите, окончательной очистки на нейтральном гидрофильном геле Sephadex G-25 и выделения целевого продукта путем упаривания и лиофилизации (Косарев С.А., Гуляев В.А., Феденюк П.В., Баирамашвили Д.И. Хроматографическая очистка (O-(2-ацетамидо)-2-дезокси-β-D-глюкопиранозил)-(1→4)-2-ацетамидо-3-O-(D-1-карбоксиэтил)-2-дезокси-D-глюкозы из клеточного гидролизата, "Биотехнология", 2001, 4, с.59-65). По этому способу чистота целевого продукта составляет 96% при выходе 0,49% от веса влажной биомассы.

Недостатком способа является относительно невысокая степень очистки дисахарида на стадии хроматографии на высокоосновном анионите, резко уменьшающаяся при незначительном повышении концентрации дисахарида в целевой фракции. Так, при повышении концентрации дисахарида в целевой фракции с 2,40 до 2,65 мг/см³ его чистота существенно понижается и составляет не более 64%.

Изобретение решает задачу повышения чистоты дисахарида, содержащегося в целевой фракции на стадии анионoобменной очистки дисахарида и увеличения общего выхода дисахарида.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения дисахарида путем культивирования продуцента (выращивания биомассы) Micrococcus lysodeicticus с последующими гидролизом клеточной стенки этой культуры лизоцимом, получением концентрата дисахарида, хроматографической очисткой концентрата дисахарида на колонке с высокоосновным анионитом, элюирование раствором хлорида натрия, очистку на нейтральном гидрофильном сорбенте, замену противоиона на сульфокатионите и выделение целевого продукта упариванием и лиофилизацией, хроматографическую очистку на высокоосновным анионите проводят до регистрации на выходе из колонки соединения, имеющего максимум поглощения при длине волны 260 нм.

Именно проведение очистки концентрата дисахарида на колонке с высокосновным анионитом до регистрации на выходе из колонки соединения, имеющего максимум поглощения при длине волны 260 нм, приводит к неожиданному, не очевидному для специалиста результату - повышению чистоты целевой фракции и, как следствие, к повышению выхода дисахарида после окончательной очистки.

В качестве высокоосновного анионита используют аниониты с функциональными триалкиламмониевыми группами такими как триметиламмониевые, диметилгидроксиэтиламмониевые, тригидроксиэтиламмониевые и им подобные. Используемый высокосновный анионит может быть как на стирол-дивинилбензольной основе, так и акрилатной или другой полимерной основе.

Способ осуществляют следующим образом:

Проводят культивирование штамма-продуцента Micrococcus lysodeiklicus на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт, затем обрабатывают клетки водным раствором ацетона, гидролизуют клеточную стенку лизоцимом, после чего удаляют примесные белки ультрафильтрацией. Далее проводят фильтрацию через сульфокатионит, концентрирование обратным осмосом, хроматографическую очистку полученного концентрата на колонке с высокоосновным анионитом, элюирование раствором хлорида натрия, очистку на нейтральном гидрофильном сорбенте, замену противоиона на сульфокатионите и выделение целевого продукта упариванием и лиофилизацией. Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Выращивание биомассы Micrococcus lysodeikticus проводят в ферментере объемом 400 дм³, в котором содержится 300 дм³ предварительно стерилизованной питательной среды, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, хлорид натрия, синтетический пеногаситель “Пента-465” и 6 дм³ стерильного 50% раствора глюкозы.

Перед посевом в ферментере поддерживают следующий режим: температура 30°С, рН 7,35±0,05, расход воздуха 150 дм³/мин и скорость вращения мешалки 350-400 об/мин. Засев ферментера производят посевным материалом, предварительно выращенным в колбах в количестве 6 дм³ (2% по объему). В процессе культивирования в ферментере поддерживают следующий режим: температура 30°С, расход воздуха 125-300 дм³/мин, концентрация растворенного кислорода (рO₂) -40% от насыщения, рН 7,3-7,5. Для предотвращения ценообразования в процессе роста используют 10%-ный раствор пеногасителя “Пента-465”. Выращивание культуры осуществляют в течение 22±1 ч до достижения стационарной фазы роста. Охлажденную до 10-12°С культуральную жидкость подают на проточную центрифугу (12-14 тыс. об/мин ) со скоростью 120±10 дм³/ч. Выход биомассы составляет 4,7 кг со 100 л культуральной жидкости. Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре -30°С.

Далее проводят обработку биомассы водным раствором ацетона, для чего 33 кг пасты клеток суспендируют в 60 дм³ деминерализованной воды, к полученной суспензии добавляют 140 дм³ ацетона и перемешивают полученную суспензию в течение 1 ч. Полученную суспензию оставляют при комнатной температуре на 18 ч, после чего верхний слой объемом 100 дм³ декантируют и к полученной суспензии приливают 70 дм³ раствора ацетона в воде (объемное соотношение ацетон : вода 5:2). Суспензию перемешивают в течение 1 ч и оставляют на 18 ч, после чего осадок отфильтровывают и высушивают при комнатной температуре. Получают 14 кг ацетонового порошка.

Ферментативный гидролиз проводят следующим образом:

Ацетоновый порошок суспендируют в 250 дм³ 0,05 М раствора ацетата аммония (рН суспензии 6,7-6,8 ). Температуру суспензии доводят до 37°С и при перемешивании в суспензию вносят раствор 50 г лизоцима (акт. 25000 ед/мг) в 4 дм³ 0,05 М раствора ацетата аммония. Суспензию перемешивают в течение 6 ч при 37°С, после чего добавляют к ней 2,5 дм³ ледяной уксусной кислоты. Далее получают концентрат дисахарида, для чего раствор с предыдущей стадии отделяют от коагулированных балластных примесей на сепараторе, после чего проводят ультрафильтрацию на полисульфоновых волокнах.

Полученный раствор пропускают через колонну, содержащую 40 кг сульфокатионита IR-120 со скоростью 25 дм /ч, и концентрируют на установке обратного осмоса до объема 50 дм³. Полученный раствор содержит 200 г дисахарида.

Операции получения раствора повторяют и суммарный раствор объемом 100дм³, содержащий 400 г дисахарида, направляют на хроматографическую очистку.

Хроматографическую очистку дисахарида проводят, нанося 100 дм³ концентрата дисахарида (от двух операций на предыдущей стадии) с концентрацией 4,0 г/дм³ на колонну с 35 кг анионита А-860 S в ацетатной форме со скоростью 24 дм³/ч. Введение концентрата дисахарида продолжают до появления на выходе из колонки дисахарида (пептидогликана с максимумом поглощения в области около 260 нм). Появление дисахарида (указанного пептидогликана) на выходе из колонки контролируют, измеряя оптическую плотность при λ=260 нм (для пептидогликана λ=254 нм), которая на момент прекращения введения концентрата дисахарида не должна составлять более 0,7 (что соответствует концентрации дисахарида на выходе из колонки 0,1 мг/см³). Далее колонну промывают деминерализованной водой в количестве 100 дм³. Дисахарид элюируют 0,15 М раствором хлорида натрия со скоростью 12 дм³/ч. Собирают фракции, содержащие не менее 78% дисахарида, при этом чистота суммарных фракций составляет не менее 90%. Фракции упаривают на роторном испарителе до объема 1,5 дм³.

Концентрированный раствор дисахарида наносят на колонну с нейтральным гидрофильным сорбентом Sephadex G-25 m (40 дм³ сорбента) со скоростью 3 дм³/ч четырьмя порциями. Дисахарид элюируют 0,1 М раствором уксусной кислоты со скоростью 1,2 дм³/ч. Собирают фракции, содержащие не менее 96% дисахарида. Полученный раствор пропускают через колонку, содержащую 2 дм³ сульфокатионита Дауэкс 50 Wx2 (200-400 меш) в H⁺-форме, после чего его упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Выход дисахарида с содержанием основного вещества 96% составляет 360 г (1,28% от массы ацетонового порошка). Пример 2 (сравнительный)

Биомассу Micrococcus lysodeikticus культивируют и последовательно обрабатывают в соответствии с примером 1, с тем лишь отличием, что на стадии хроматографической очистки на колонну с анионитом Purolite A860S наносят концентрат дисахарида в количестве 50 дм³. Дальнейшую обработку проводят в соответствии с примером 1, собирая фракции, содержащие не менее 78% дисахарида, при этом чистота суммарных фракций составляет не менее 80%. Далее полученный раствор пропускают через колонку, содержащую 2 дм³ сульфокатионита Дауэкс 50 Wx2 (размер гранул 200-400 меш) в Н⁺-форме. После упаривания и лиофилизации получают белый аморфный порошок с содержанием дисахарида 80%. Окончательную очистку дисахарида проводят на нейтральном гидрофильном сорбенте, как указано в примере 1, предварительно растворяя его в 6 дм³ 0,1 М уксусной кислоты и нанося двумя порциями по 3 дм³, и далее собирая фракции, содержащие не менее 96% целевого продукта. После упаривания и лиофилизации получают дисахарид с содержанием основного вещества 96% в количестве 160 г (1,14% от массы ацетонового порошка).

Формула изобретения

Способ получения дисахарида (О-(-2-ацетамидо)-2-дезокси-бета-D-глюкопиранозил)-(1→4)-ацетамидо-3-О-(D-1-карбоксиэтил)-2-дезокси-D-глюкозы, включающий культивирование штамма - продуцента Micrococcus lysodeikticus (luteus), обработку клеток водным раствором ацетона, ферментативный гидролиз клеток лизоцимом, ультрафильтрацию, очистку на сульфокатионите, концентрирование обратным осмосом, хроматографическую очистку на высокоосновном анионите, элюирование раствором хлорида натрия, очистку на нейтральном гидрофильном сорбенте, замену противоиона на сульфокатионите и выделение целевого продукта упариванием и лиофилизацией, отличающийся тем, что хроматографическую очистку на высокоосновном анионите проводят до регистрации на выходе из колонки соединения, имеющего максимум поглощения при длине волны 260 нм.