Штамм бактерий az d10 вкм в-2272 д, обладающий ростостимулирующими свойствами и устойчивый к дельтаметрину

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего урожайность сельскохозяйственных культур. Проводят адаптацию штамма бактерий Azotobacter chroococcum, выделенного из темно-серой почвы Томской области, путем многостадийного повышения концентрации дельтаметрина с целенаправленным инкубированием клеток. Получают новый штамм Az d 10 ВКМ В-2272, обладающий ростостимулирующими и фунгистатическими свойствами, что позволяет использовать его при получении эффективного бактериального препарата и применять в качестве стимулятора роста растений одновременно с инсектицидными химическими препаратами. 2 табл., 6 ил.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается получения нового штамма микроорганизмов, обладающего ростостимулирующими и фунгистатическими свойствами. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего урожайность сельскохозяйственных культур.

В агропроизводстве широко используются полезные свойства микроорганизмов, в частности азотобактера, для культивации почвы в целях повышения урожайности [1. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. Изд. АН УССР, Киев, 1960]. Известен штамм Azotobacter chroococcum Beijering 1901 В 3344 -Т12 Института цитологии и генетики АН БССР, обладающий ростостимулирующими свойствами, а также штамм Azotobacter chroococcum Beijering 1901 В 3721-3064 НПО "Биотехнология", культивируемый на среде Бэрка и используемый для повышения урожайности [2. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. Изд. "Наука". Москва, 1982]. Последний штамм принят за прототип.

Известные штаммы не обладают устойчивостью к дельтаметрину. Внесение в почву биопрепаратов на их основе совместно с инсектицидами, содержащими дельтаметрин, приводит к гибели живых бактериальных клеток, что не позволяет применять известные штаммы для почв, обработанных некоторыми химическими препаратами ("Децис" и ему подобные).

Задача изобретения - получение культурального штамма, обладающего ростостимулирующими и фунгистатическими свойствами и устойчивого к дельтаметрину.

Указанная задача решена путем получения неизвестного ранее штамма микроорганизмов, получившего название Az d10, и использованием его при производстве бактериального препарата. Новый штамм Az d10 получен в Томском государственном университете из известного штамма бактерий Azotobacter chroococcum, выделенного в 1997 году из темно-серой почвы Томской области, путем его постепенной адаптации к дельтаметрину. Адаптация проведена путем многостадийного повышения концентрации дельтаметрина при целенаправленном инкубировании клеток.

Полученный штамм Az d10 депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ИБФМ им. Г.К.Скрябина, г. Москва) 16.10.2001 г. под № ВКМ В-2272 Д. Штамм депонирован с научным описанием (паспортом).

Штамм Az dl0 ВКМ В-2272 Д характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки имеют овальную форму от палочковидных до кокковидных, размножаются простым делением, спор не образуют. Подвижны, жгутикование перитрихальное. Диаметр клеток колеблется от 1,5 до 2,0 мкм. При окраске по Грамму (окраска кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой раствором Люголя, спиртом и фуксином) клетки Az dl0 дают отрицательную реакцию.

Культуральные признаки: рост штамма проверен на селективной тест-среде Эшби (г/л): маннит - 20,0; К2 НРO₄ - 0,2; MgSO₄·7H₂O - 0,2; NaCl - 0,2; FeSO₄ - 0,1; СаСО₃ - 5,0; агар - 20,0. На вторые-третьи сутки штамм образует выпуклые мутно-белые колонии. На твердой питательной среде колонии клеток существуют в виде слизистых бесцветных или мутно-белых образований округлой выпуклой формы с гладкой поверхностью.

Физиологические признаки: штамм аэробный, микроаэрофильный каталозоположительный. Источники углерода при аэробном росте - глюкоза, маннит, сахароза. Пигментация колоний и среды отсутствует. Штамм растет при комнатной температуре при pН 4,8-8,5. При концентрации NaCl 20 г/л и более рост прекращается. Оптимальные условия роста - температура 29±31°С при рН 7,0-7,5, концентрация NaCl - 0,2 -0,3 г/л.

Для культивирования штамма Az dl0 применяют питательную среду следующего состава (г/л): меласса - 30,0, К₂ НРO₄ - 0,2; MgSO₄·7H₂O - 0,3; NaCl - 0,3; K₂SO₄ - 0,1; FeSO₄ - 0,005; Mn SO₄ - 0,005; аммоний молибденовокислый - 0,005; СаСО₃ - 3,5; дельтаметрин - 0,01. Выращивание осуществляют в колбах методом глубинного культивирования на качалке при 200 об/мин.

Свойства штамма

Отличительным признаком заявляемого штамма является устойчивость к дельтаметрину. Штамм Az dl0 устойчив к дельтаметрину, сохраняя, в отличие от прототипа, способность синтезировать ростостимулирующие и фунгистатические вещества. Штамм Az d 10 не патогенен, не фитопатогенен. Свойства штамма стабильны при хранении на скошенной агаризованной среде при температуре +5°С в течение 3-х месяцев и сохраняют способность к многократной воспроизводимости. Поскольку заявляемый штамм получен впервые и ранее не использовался в промышленной технологии, можно сделать вывод о соответствии его критерию "новизна".

Дополнительные свойства

Для штамма Az d10 характерна повышенная способность к продуцированию ИУК - 7,3 мкг/мл.

Получение штамма

Штамм получили путем выделения бактерий из почвы на специфичной среде без азота (среда Эшби) и идентифицировали с помощью специальных методов и тестов. Изучили культуральные, морфологические и физиологические свойства штамма. Затем провели его адаптацию к повышенному содержанию дельтраметрина. При этом концентрацию дельтаметрина в питательной среде увеличивали с каждым пересевом микроорганизмов по специально разработанной методике.

Эвристические моменты теоретических и экспериментальных научных исследований позволяют сделать вывод о соответствии полученного технического решения критерию "изобретательский уровень".

Получение биомассы, выход полезного продукта

Штамм культивируется на питательной среде следующего состава (г/л): меласса - 30; КН₂РO₄ - 0,2; MgSO₄·7H₂O - 0,3; NaCl - 0,3; K₂SO₄ - 0,1; FeSO₄ - 0,005; MnSO₄ - 0,005; аммоний молибденовокислый - 0,005; СаСО₃ - 3,5; дельтаметрин - 10 мг/л. Штамм растет при рН от 4,8 до 8,5; оптимальный диапазон рН: 7,0 - 7,5. Оптимальная температура роста + 30±1°С. Штамм Az d10 следует хранить в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре + 5°С.

Для получения посевной культуры азотобактера колбу с жидкой питательной средой засевают смывом агара с пробирок. Выращивание посевного материала в колбах ведут на качалке при 200-240 об/мин при температуре +28±1°С в течение 24 часов. Для выращивания культуры азотобактера колбы засевают посевным материалом из расчета 3- 5% посевного материала от объема среды и культивируют бактериальную суспензию на качалке при 200-240 об/мин, температуре +28±1°С в течение 48 часов.

Изучение устойчивости к дельтаметрину

Устойчивость к дельтаметрину определяли в экспериментах, характеризуемых следующим примером/

Пример: В колбы со 100 мл жидкой питательной стерильной среды добавили по 5 мл суточной культуры Az d10 и по 0; 5; 20; 50; 100; 200 мкл “Дециса”, содержащего соответственно 0; 0,125; 0,5; 1,25; 2,5; 5 мг дельтаметрина. Через 24 часа культивирования на качалке (200 об/ мин, +28±1°С) определяли концентрацию бактерий в 1 мл среды методом разведении. Полученные результаты представлены в табл.1.

Действие штамма Az d10 на растения изучалось в ходе лабораторных, вегетативных и полевых экспериментов, в процессе которых штамм сравнивался с другими бактериальными культурами, изучалась его совместимость с различными бактериальными препаратами, гуматом и фунгистатическая активность. Условные обозначения: k - контроль, Az - азотобактерин, Ps - псевдомонады, Az-Ps - смесь бактериальных культур.

Фунгистатическая активность штамма

Результаты лабораторных опытов, в которых мицелий гриба фузариум высаживали на бактериальный газон, показали, что азотобактерин при нулевом разведении сильно подавляет рост фузариума и Е. coli по сравнению с контролем (без бактериальной обработки). Опытные данные представлены на фиг.1.

В варианте с азотобактерином (четвертое разведение) в течение первых трех суток отмечен активный рост гриба, затем наблюдалось постепенное замедление роста грибного мицелия. Подобная закономерность связывается с особенностями кинетики роста азотобактера, в которой отмечена длительная лаг-фаза. В этом случае воздушный мицелий гриба развивался плохо. В отличие от контрольных вариантов чашки Петри полностью не зарастали фузариумом даже по истечении четырнадцати суток.

Отмечена фунгистатическая активность азотобактерина в микровегетационном опыте, в котором семена кукурузы помещались в пробирки на субстрат из вермикулита с питательным раствором Кнопа и обрабатывались бактериальными суспензиями. Поражение растений фитопатогенными грибами в контроле (семена кукурузы с питательным раствором Кнопа без добавления бактерий) достигало 100%. В опытных вариантах симптомы инфицирования либо полностью отсутствовали, либо были слабо выражены. Полученные результаты представлены в табл.2.

Действие штамма на морфометрические показатели растений

Влияние азотобактерина на рост и развитие растений кукурузы (сорт Молдавский 245) изучали в ходе модельных экспериментов с помощью 3-компонентной экосистемы: "песок - Zea mays - бактериальные препараты". Растения инокулировали жидкими 3-суточными культурами микроорганизмов, содержащими 1·10⁹ кл/мл для каждого препарата. В микровегетационном опыте проростки кукурузы помещали в пробирки со стерильным крупным речным песком. Контролем служили растения, растущие на стерильной питательной среде Кнопа. В опыте проростки растений на четвертые сутки после посадки семян инокулировали ресуспендированными бактериальными суспензиями из расчета 1·10⁶ клеток на растение и выращивали на питательной среде Кнопа. В опыте было использовано 36 вегетативных сосудов, которые находились в помещении с температурой воздуха 22-24°С. Растения освещали люминесцентными лампами ЛД-36, расположенными по обеим сторонам сосуда, общая интенсивность составляла 60 Вт/м². Растения выращивали до 8-дневного возраста, затем извлекали из пробирок и измеряли морфометрические показатели. Результаты микровегетационных опытов позволили сделать выводы об увеличении скорости роста инокулированных бактериями растений кукурузы. В варианте с азотобактерином отмечена наибольшая длина растений, биомасса побегов и биомасса корневой системы. Данные представлены на фиг.2, 3, 4.

При изучении влияния на рост растений кукурузы культур азотобактера, псевдомонаса, Bacillus megaterium и смеси этих бактериальных культур наибольший эффект по биомассе и длине растений, а также числу боковых корней достигнут в варианте со смесью применяемых культур. Контролем служили растения, выращиваемые на воде и обработанные питательным раствором Кнопа. Данные представлены на фиг.5, 6.

Проверка эффективности штамма в полевых опытах отражена в прилагаемых актах испытаний. Приведенные данные позволяют говорить о промышленной применимости заявленного штамма Az d10.

Таким образом, получен новый штамм бактерий, преимуществом которого является устойчивость к дельтаметрину. В отличие от прототипа, штамм Az d10 ВКМ В-2272 Д сохраняет ростостимулирующие и фунгистатические свойства при концентрации дельтаметрина до 10 мг/л, что позволяет использовать его при получении эффективного бактериального препарата и применять в качестве стимулятора роста растений одновременно с инсектицидными химическими препаратами ("Денис" и ему подобные). Это дает значительный экономический эффект за счет возможности одновременной предпосевной обработки семян биологическими и химическими препаратами разнопланового действия, а также при экономии горючего для с/х техники во время профилактической обработки посевов.

Литература

1. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. Изд. АН УССР, Киев, I960.

2. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982, прототип.

Формула изобретения

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМ В-2272 Д, обладающий ростостимулирующими свойствами и устойчивый к дельтаметрину.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Государственое образовательное учреждение высшего профессионального образования "Томский государственный университет", Вайшля Ольга Борисовна

Вид лицензии*: ИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью "ПлантаПлюс"

Договор № РД0032161 зарегистрирован 04.02.2008

Извещение опубликовано: 20.03.2008        БИ: 08/2008

* ИЛ - исключительная лицензия        НИЛ - неисключительная лицензия

---