Способ изготовления вирус-вакцины против репродуктивно- респираторного синдрома свиней

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен способ изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), предусматривающий инфицирование перевиваемой культуры клеток Marc-145 вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма “БД-ДЕП” вируса РРСС. Последующее инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащего материала и дальнейшее добавление защитной среды в соотношении 3:5-5:7. Полученная таким способом вирусвакцина против РРСС содержит вирусный материал с биологической активностью не менее 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Изобретение расширяет арсенал вирусвакцин против РРСС, создающих напряженный и длительный иммунитет против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для изготовления вакцин против РРСС. 1 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).

РРСС - это новая болезнь вирусной этиологии, характеризующаяся нарушением функций воспроизводства у свиноматок, пневмонией у поросят на доращивании и увеличением их смертности в предотъемный период. Впервые болезнь была зарегистрирована и описана в 1987 году в США и Канаде, а с 1990 года болезнь регистрируется в странах Западной Европы и Юго-Восточной Азии. По официальным данным МЭБ, в 1996-1998 гг. заболевание регистрировали в 30 странах мира. В России РРСС был установлен в 1993 году и на сегодняшний день это заболевание диагностировано во многих областях и краях России. Впервые вирус РРСС был выделен и исследован учеными Центрального ветеринарного института в Нидерландах в 1991 году. Вирус был классифицирован как представитель семейства Arteriviridae и отнесен к роду Arterivirus. В организме животных вирус размножается в альвеолярных макрофагах легких и в дальнейшем в результате виремии он аккумулируется в матке и других органах. При циркуляции вируса в крови он легко преодолевает трансплацентарный барьер и поражает плод. В зависимости от срока супоросности свиноматки или иммунного ответа организма матери происходит гибель плода или рождение поросят, которые погибают в первые дни жизни. В некоторых хозяйствах гибель новорожденных поросят достигает 80-90%, что причиняет им значительный экономический ущерб (1, 2).

Важным средством предупреждения РРСС и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Специфическая профилактика РРСС проводится с помощью живых и инактивированных вакцин.

Преимущества вирусвакцин состоят в том, что живой антиген продолжает размножаться в организме иммунизированных животных, они являются более дешевыми в производстве и для их хранения требуется относительно мало места в холодильных установках.

Однако, в целях повышения экономической безопасности страны проблема усовершенствования технологии изготовления вирусвакцины против РРСС продолжает оставаться актуальной.

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1102 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (3).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1140 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (4).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1153 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (5).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1387 или CNCM №1-1388 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (6).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1642 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (7).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование культуры клеток почки зеленой мартышки вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма АТСС VR-2332 гомологичного вируса, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (8, 9).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование культуры клеток почки зеленой мартышки вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма АТСС VR-2402 гомологичного вируса, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (10).

Известен способ получения вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование культуры клеток CRL-12219 вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма АТСС VR-2509 гомологичного вируса, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (11).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма АТСС VR-2525 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (12).

Известен способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма ЕСАСС V-93070108 гомологичного вируса, инкубирование инфицированной системы, сбор вируссодержащего материала и получение целевого продукта (13).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления вирусвакцины против РРСС, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма CNCM №1-1102 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта (3).

Общим недостатком вирусвакцин против РРСС, изготовленных вышеописанными способами, в т.ч. и способом-прототипом, является неизученность их эффективности в отношении российских изолятов вируса РРСС, так как они никогда не применялись на территории Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входило разработать способ изготовления высокоиммуногенной и безвредной вирусвакцины против РРСС на основе нового производственного штамма гомологичного вируса, выделенного на территории России, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодного для изготовления вакцинных препаратов, создающих напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вирусвакцин против РРСС, создающих напряженный и продолжительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Указанный технический результат достигнут созданием способа изготовления вирусвакцины против РРСС, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:

1. Способ изготовления вирусвакцины против РРСС.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС.

3. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток Маrс-145.

4. Аттенуированный штамм "БД" вируса РРСС используют в эффективном количестве.

5. Для инфицирования перевиваемой культуры клеток Маrс-145 используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

6. Инкубирование зараженной системы.

7. Сбор вируссодержащего материала.

8. Добавление защитной среды.

9. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 5:7-3:5 соответственно.

10. Получение целевого продукта.

11. Целевой продукт получают с содержанием вируссодержащего материала из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Способ изготовления вирусвакцины против РРСС.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС.

3. Инкубирование зараженной системы.

4. Сбор вируссодержащего материала.

5. Добавление защитной среды.

6. Получение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток MARS-145.

2. Для инфицирования перевиваемой культуры клеток Магс-145 используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

3. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 3:5-5:7 соответственно.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Способ изготовления вирусвакцины против РРСС.

2. Инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса РРСС.

3. Инкубирование зараженной системы.

4. Сбор вируссодержащего материала.

5. Добавление защитной среды.

6. Получение целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является использование при изготовлении вирусвакцины против РРСС вируссодержащего материала из нового аттенуированного штамма "БД" гомологичного вируса в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Из чувствительных биологических систем используют перевиваемую культуру клеток Маrс-145.

2. Для инфицирования перевиваемой культуры клеток Маrс-145 используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "БД" вируса РРСС с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

3. Защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 3:5-5:7 соответственно.

Вирусвакцина, полученная предлагаемым способом, расширяет арсенал вирусвакцин против РРСС, создающих напряженный и длительный иммунитет против циркулирующих на территории России эпизоотических изолятов вируса РРСС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вирусвакцины против РРСС используют вируссодержащий материал из нового аттенуированного штамма "БД" гомологичного вируса, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Штамм "БД" является новым, ранее неизвестным, в нативном виде непатогенным.

Исходный вирус для получения штамма "БД" выделен из сыворотки крови свиней с клиническими признаками РРСС, полученной из СХП "Рассвет" Кировского района Ставропольского края в 1996 году. Производственный штамм получен путем многократных последовательных пассажей на 3-суточной культуре клеток Магс-145.

Штамм "БД" депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 25 мая 1998 года под регистрационным шифром "БД-ДЕП".

Штамм "БД" является безвредным и обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Штамм "БД" вируса РРСС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "БД" вируса РРСС относится к семейству Arteriviridae, роду Arterivirus, RNA-геномный, обладает морфологическими признаками, характерными для вируса РРСС: форма вириона шарообразная, размер вириона 45-75 нм с ядром, заполняющим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой.

Антигенные свойства

Вирус РРСС штамма "БД" стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не обладает гемагглютинирующими свойствами. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявлена геномная РНК вируса РРСС. Нуклеотидное секвенирование штамма "БД" вируса РРСС показало его значительное (около 40%) отличие от штамма CNCM №1-1102 и штамма АТСС №VR-2332, признанных эталонными в Европе и Северной Америке соответственно. Идентификацию и специфичность вируса РРСС определяли в ИФА (IDEXX, США) с контролем специфичности. Результат проведенной дифференциальной диагностики был отрицательным на вирус болезни Ауески, парвовирус свиней, вирус диареи КРС и вирус трансмиссивного гастроэнтерита.

Биотехнологические характеристики

Штамм "БД" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность. Штамм "БД" предназначен для приготовления диагностических и вакцинных препаратов. Штамм "БД" вируса РРСС репродуцируется в цитоплазме клеток 3-суточной культуры клеток Маrс-145 при температуре 37°С. Исходной суспензией из сыворотки крови, содержащей вирус, заражали культуру клеток Маrс-145. После проведения 7-10 пассажей в течение 40-48 часов инкубирования вирус накапливается до титра 4,0-4,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Инфекционность вируса повышали путем серийных быстро чередующихся пассажей, которая к 41 пассажу достигла 7,0-7,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Штамм "БД" является стабильным и безвредным.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "БД" является РНК-содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота содержит одну нить, поверхность вируса покрыта слоем гликопротеинов. Белковая оболочка обнаруживает следующие фрагменты:

М - трансмембранный протеин,

Е - мембранный протеин,

G_L - поверхностный гликопротеин,

G_S - поверхностный гликопротеин,

N - нуклеокапсидный протеин.

Физические свойства

Масса вириона от 49·10³ Да до 55·10³ Да. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,18-1,2 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "БД" не устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - через 14 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.

Реактогенность отсутствует.

Патогенность отсутствует.

Онкогенность отсутствует.

Контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации установлена при проведении 5 пассажей на подсвинках.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм “БД” вируса РРСС по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным штаммом вируса РРСС.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно - техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности “новизна”.

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности “изобретательский уровень” проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности “изобретательский уровень”.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Вирусвакцину против РРСС готовят из матрового вируса штамма “БД”, выращенного в перевиваемой культуре клеток Маrс-145 3-суточного возраста с концентрацией более 100 тыс. кл./см³. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Маrс-145 6,5 Ig ТЦД₅₀/см³, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. Для изготовления 50 тыс. доз вакцины необходимо получить 7,5 литров вируссодержащей суспензии РРСС. Для этого берут 60 матрасов емкостью 1,5 дм³ с культурой клеток. После слива ростовой среды и однократного отмывания ФБР или питательной средой в матрасы вносят по 5 см³ вируссодержащего материала матровой серии. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение часа. После этого в матрасы вносят среду Игла в объеме 150-200 см³ с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота с антибиотиками (гентамицин в концентрации 50 мкг/см³ или его аналоги).

Культивирование ведут при 37°С в течение 48-72 часа. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых заменяют среду. Размножение вируса в культуре клеток Маrс-145 определяют по характеру ЦПД с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. В контрольных матрасах не должно быть каких-либо деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением до 60% клеточного монослоя (обычно через 48-72 часа), отбирают и замораживают при -20°С. Вирус для изготовления вакцины получают 2-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим сливом содержимого матрасов в одну емкость, соблюдая стерильные условия. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для лабораторно-производственного контроля на инфекционную активность и специфичность. Производственная серия вируса РРСС считается пригодной, если она соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток Маrс-145 не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. В полученную вируссодержащую жидкость добавляют защитную среду, в качестве которой можно использовать отдельно или в комбинации гидролизат лактальбумина (ГЛА), желатозу, сахарозу и др. Смесь расфасовывают во флаконы, промораживают при -60-(-80°С) и подвергают лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривают под вакуумом и подвергают контролю на иммуногенность (на 2-3 - месячных подсвинках) и на безвредность (на белых мышах и подсвинках). Вакцину считают иммуногенной, если при внутримышечном введении трем подсвинкам в дозе 2·10⁴ ТЦД₅₀/2 см³ вакцина предохраняет их при контрольном заражении. Вакцину считают безвредной, если при подкожном введении цельной вакцины пяти белым мышам массой 18-21 г в дозе 0,5 см³ и при внутримышечном введении двум подсвинкам массой 25-35 кг в дозе 3 см³ она не вызывает заболевания или гибели лабораторных животных в течении 10, а подсвинков в течение 15 суток наблюдения. На месте введения не должно быть никаких изменений подкожной клетчатки.

Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу желтовато-белого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. Вакцину применяют с профилактической целью в угрожаемых и неблагополучных по РРСС хозяйствах. Свиноматок, свинок и хряков-производителей прививают за две недели до случки (осеменения). В последующем ранее иммунизированных хряков-производителей ревакцинируют через каждые шесть месяцев. Поросят вакцинируют в 30-40 - дневном возрасте, а затем ревакцинируют через 2-3 месяца. В хозяйствах, где вакцину применяют в первый раз, иммунизируют всех животных с трехнедельного возраста. Ревакцинацию проводят через каждые шесть месяцев. Иммунитет у привитых животных наступает через 14 дней после вакцинации и сохраняется более 4 месяцев.

Полученная вакцина против РРСС имеет оптимальный компонентный

состав (рецептуру), маc.%:

Вируссодержащий материал 50,0-70,0

Защитная среда До 100,0

Содержание вируссодержащего материала в диапазоне 50,0-70,0 (мас.%) представляет собой эффективное количество антигена в предлагаемой вакцине.

Пример 2.

Проведены испытания вирусвакцины против РРСС, изготовленной так, как описано в примере 1.

Иммуногенная активность полученной вирусвакцины проверена на 7 серонегативных подсвинках в возрасте 4-6 недель, полученных из благополучного по инфекционным болезням хозяйства. Использовали вирус с титром 7,0 Ig ТЦД₅₀/см³, который вводили внутримышечно в иммунизирующей дозе 2×10⁴ TЦД₅₀/cм^з. В качестве контроля служили три серонегативных подсвинка, содержащихся в одном боксе с опытными животными. За животными вели клиническое наблюдение. У подсвинков после вакцинации каких-либо отклонений от физиологической нормы не отмечено. Через 14, 21 и 28 дней после вакцинации отобранные пробы крови и сыворотки исследованы в ИФА (IDEXX, США) с контролем специфичности. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Примечание:

значение IDEXX, равное 0,4 и выше - положительный результат,

значение IDEXX, равное 0,3-0,39 - сомнительный результат,

значение IDEXX, меньше 0,3 - отрицательный результат.

Эффективность полученной вакцины оценивали также по результатам контрольного заражения опытных и контрольных поросят вирулентным штаммом “Лелистад” через 28 дней после иммунизации. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Данные таблиц 1 и 2 свидетельствуют о том, что через 28 суток у всех иммунизированных подсвинков уровень поствакцинальных антител (s/p коэффициент) был высоким и составлял от 0,66 до 1,81. В это же время контрольные животные оставались серонегативными. После контрольного внутрилегочного заражения вирулентным штаммом “Лелистад” в дозе 2 см³ вируссодержащей жидкости с титром 4 Ig ТЦД₅₀/см³ у вакцинированных животных каких-либо клинических признаков РРСС не наблюдалось. Все контрольные подсвинки заболели с типичными признаками РРСС. Результаты титрования вирусвакцины представлены в таблице 3.

Примечание: s/p меньше 0,3 - отрицательный результат;

s/p равно 0,3-0,4 - сомнительный результат;

s/p больше 0,4 - положительный результат.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что на протяжении периода исследования (62 суток) у животных, вакцинированных сухой культуральной вакциной против РРСС из штамма “БД”, уровень поствакционных антител оставался высоким. Вакцина в дозе 2×10² - 2×10⁴ ТЦД₅₀/см³ обеспечивает 100% защиту подсвинков.

Пример 3.

Проведены испытания вирусвакцины против РРСС, изготовленной так, как описано в примере 1, в условиях участка опороса комбината №1 ОАО “Ильиногорское” Нижегородской области на поросятах в количестве 55980 голов, привитых упомянутой вакциной в дозе 2 см³. После вакцинации осложнений не наблюдалось. Анализ проводили визуально и по результатам патологоанатомического вскрытия поросят-отъемышей. Установлено, что до вакцинации падеж поросят-отъемышей от бронхопневмонии составлял 55-60% от всего количества павших животных. После вакцинации отход поросят-отъемышей по причине бронхопневмонии составил 15-20%.

Пример 4.

Проведены испытания вирусвакцины против РРСС, изготовленной так, как описано в примере 1, в условиях спецхоза АО “Тихий Дон” Острогожского района Воронежской области на ремонтных свинках в количестве 20 голов, привитых упомянутой вакциной двукратно с интервалом 20 дней в дозе 2 см³. Опорос привитых свинок прошел благополучно, они опоросились на 114-116 день супоросности, получено 6,5 поросят на одну свиноматку. Поросята хорошо развиты, с массой тела 1,0-1,2 кг, с хорошим сосательным рефлексом. У двух свиноматок с пометами 12-14 поросят было по одному недоразвитому поросенку, которые погибли в первые 3 дня жизни.

Пример 5.

Проведены испытания вирусвакцины против РРСС, изготовленной так, как описано в примере 1, в условиях свинокомплекса “Кузнецовский” Наро-Фоминского района Московской области с оздоровительной и профилактической целями на поросятах-отъемышах в количестве 47113 голов. Вакцина применялась согласно действующему наставлению. После вакцинации общий падеж среди поросят-сосунов и отъемышей сократился до 11,9% по сравнению с 30,6% до применения упомянутой вакцины.

Оценка иммуногенной активности предложенной вирусвакцины, проведенной в лабораторных экспериментах и в условиях свиноводческих хозяйств России, показала, что вирусвакцина против РРСС из штамма “БД” является надежным и эффективным препаратом.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- способ изготовления вирусвакцины против РРСС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемого способа изготовления вирусвакцины против РРСС на основе штамма “БД” достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности “промышленная применимость”.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на “Способ изготовления вирусвакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней”

1. Wensvoort G. et al. Mystery Swine Disease in the Netherlands: The isolation of Lelystad virus. Vet. Quarterly, 1991, 13, 3, 121-130.

2. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. Москва, ВНИТИБП, 1998, 552-558.

3. РСТ №92/21375; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, С 12 N 7/00; 10.12.92 - (прототип).

4. РСТ №93/07898; А 61 К 39/12, G 01 N 33/569, С 12 N 7/00; 29.04.93 г.

5. Пат. Франции №2682966; С 12 N 7/02, 04; 30.04.93 г.

6. ЕР 0676467; С 12 N 7/00, А 61 К 39/12, С 12 Р 21/08, С 07 К 16/10; 11.10.95 г.

7. ЕР 835929; C 12 N 7/00, А 61 К 39/12, C 12 N 5/06, G 01 N 33/569; 15.04.98 г.

8. Пат. США №5476778, С 12 N 7/00, 19.12.95 г.

9. Collins J.E. et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest, 1992, 4, 117-126.

10. Пат. США №5587164; А 61 К 39/00, 39/12, 39/38, 39/193; 24.12.96 г.

11. Пат. США №5690940; C 12 N 15/38, 7/01; 25.11.97 г.

12. Пат. США №5866401; С 12 N 7/08, 7/01, 7/00, 7/02, 02.02.99 г.

13. Пат. Великобритании №2282811; C 12 N 15/40, А 61 К 39/12, С 07 К 14/18, C 12 N 7/02, 7/04; 19.04.95 г.

Формула изобретения

1. Способ изготовления вирус-вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление защитной среды и получение целевого продукта, отличающийся тем, что для инфицирования чувствительной биологической системы используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма “БД” вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, коллекция ВГНКИ “БД-ДЕП”, в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток Marc-145.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что для инфицирования перевиваемой культуры клеток Marc-145 используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма “БД” вируса РРСС с биологической активностью не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 3:5-5:7 соответственно.