Питательная среда для выделения и выращивания микобактерий

 

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии, в частности к бактериологии туберкулеза у людей и животных. Питательная среда для выделения и выращивания микобактерий дополнительно содержит гликокол, в качестве источника минеральных солей - геотермальную воду с минерализацией 5,02 г/л и картофельный экстракт, приготовленный на геотермальной воде. Геотермальная вода благоприятно влияет на рост и размножение микобактерий, поскольку содержит значительное разнообразие анионов и катионов, гумусовых и битумных веществ. Изобретение позволяет повысить скорость роста и высеваемость микобактерий как лабораторных штаммов, так и из проб биоматериалов. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности для высевания патологического материала и выращивания микобактерий при диагностике туберкулеза у людей и животных.

Микобактерии туберкулеза (особенно первых генераций) для роста и размножения нуждаются в ростовых веществах, что объясняется недостаточной их выработкой бактериями. Поэтому на плотных питательных средах, содержащих фракции яичного желтка, аспарагин или гликокол, наблюдают значительно лучший рост, чем на средах, не содержащих этих компонентов [1].

В настоящее время, в практике ветеринарных и медицинских лабораторий для бактериологической диагностики туберкулеза наиболее широко применяют плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финна II, Гельберга, Мордовского (“Новая”), среды 6 и 9 В.А. Аникина и т.д. Следует отметить, что нет универсальной, простой в изготовлении питательной среды для выращивания микобактерий, в связи с чем для повышения результативности бактериологического исследования биоматериалов используют 2-3 различные среды.

Перечисленные среды по химическому составу и физическим свойствам мало отличаются одна от другой и состоят из солевой основы и желтков куриных яиц. Поэтому высеваемость и скорость роста микобактерий на разных средах незначительно расходятся в ту или иную сторону.

На широко известной плотной яичной среде Левенштейна-Иенсена микобактерии растут очень медленно, видимый рост появляется через 4-10 недель инкубации в термостате и не позволяет получить достаточное количество биомассы, необходимой для идентификации. Кроме того, ингредиенты, входящие в состав этой среды, являются дефицитными, а потому и дорогостоящими [2].

К недостаткам сухой питательной среды “Новая” (Мордовского) следует отнести плохую растворимость сухой желточной массы, недостаточную плотность готовой среды после свертывания. Кроме того, при хранении в холодильнике, длительном термостатировании среда быстро усыхает, в связи с чем рост микобактерий задерживается или вовсе прекращается [3].

Наиболее близкой к заявляемой среде является плотная яичная среда Гельберга, поскольку содержит ингредиенты (глицерин, куриные яйца, малахитовую зелень, картофельный отвар), входящие в состав предлагаемой среды. Однако среда Гельберга дополнительно содержит солевой состав (калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый), значительно отличающую ее от предлагаемой среды.

Состав среды прототипа следующий:

Калий фосфорнокислый двухзамещенный, г 1,0

Натрий лимоннокислый, г 1,0

Магний сернокислый, г 1,0

Пептон, г 6,0

Глицерин, мл 30,0

Молоко, мл 100,0

Картофельный отвар, мл 100,0

Яйца куриные, шт. 6,0

Желтки куриных яиц, шт. 4,0

Дистиллированная вода, мл 1000,0

Недостатками данной среды являются низкая высеваемость проб биоматериала от животных и мокроты людей, малая скорость роста микобактерий, кроме того, среда содержит 3 минеральные соли, что по нашему мнению не достаточно обеспечивает качественные потребности микобактерий в важных для жизнедеятельности макро- и микроэлементах. Изготовление среды осложнено предварительным приготовлением солевого раствора (взвешивание, растворение, автоклавирование, смешивание с яичным составом и т.д.), что сопряжено с дополнительными материальными и трудовыми расходами.

Целью изобретения является повышение эффективности бактериологической диагностики туберкулеза за счет оптимизации условий выращивания микобактерий на среде с измененным химическим составом.

Поставленная цель достигается тем, что среда Гельберга, содержащая глицерин, куриные яйца, желтки, малахитовую зелень, солевой раствор, приготовленный на основе дистиллированной воды, готовится на основе геотермальной воды в качестве источника минеральных солей, которой заменяется 87,5% добавляемой дистиллированной воды, дополнительно вносят картофельный экстракт, приготовленный на основе геотермальной воды.

Предлагаемая среда имеет следующий состав:

Гликокол, г 1,5

Глицерин, мл 3,0

Вода геотермальная, мл 56,25

Яйца куриные, шт. 6

Картофельный экстракт на основе геотермальной воды, мл 75,0

2%-ный раствор малахитовой зелени, мл 5,0

Дистиллированная вода, мл 18,75

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известной исключением солевого состава, заменой дистиллированной воды геотермальной и добавлением картофельного экстракта, приготовленного на основе этой же воды. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию “новизна”.

Анализ геотермальной воды фотометрией, комплексометрией, потенциометрией, капиллярной люминесценцией, атомно-абсорбционной и пламенно-эмиссионной спектрометрией показал, что она отличается от водопроводной и дистиллированной воды значительно большим разнообразием и количественным содержанием анионов NH₄, Na, К, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Сu и Ni, суммарное значение которых составляло 1,6771 г/л; катионов Fe, Cl, Br, J, SO₄, НСО₃, HPO₄, NO₃ - в сумме 3,4732 г/л. Кроме того, геотермальная вода содержит нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л), которые обогащают среду разнообразным органическим субстратом и ростовыми веществами. Комплекс микро- и макроэлементов, содержащихся в геотермальной воде, оказал более благоприятное влияние на рост и размножение микобактерий, чем внесение пяти минеральных солей в составе среды Финна II.

При экспериментальной проверке были испытаны 4 варианта среды, которые отличались количественным содержанием вносимой геотермальной воды взамен дистиллированной. Рецепты их приготовления приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, в варианты заявляемой среды вносилась геотермальная вода взамен дистиллированной в различных объемах (от 25 до 100%), а картофельный экстракт готовился только на геотермальной воде. Минеральные соли в эти варианты сред не вносились. Общее содержание геотермальной воды в различных вариантах составляло от 62,5 до 100%.

Для приготовления среды в стерильную колбу с бусами выливали 6 куриных яиц, встряхивали после добавления каждого яйца до образования однородной массы, доливали 5 мл 2%-ного малахитового зеленого, 1,5 г гликокола, 3 мл глицерина. В каждый вариант среды вносили соответствующее количество (18,75; 37,5; 56,25; 75,0 мл) геотермальной воды и добавляли недостающее до 75 мл дистиллированной воды (соответственно: 56,25; 37,5; 18,75; 0 мл), а затем вносили по 75 мл картофельного экстракта, приготовленного на основе геотермальной воды. Среды разливали по пробиркам и выдерживали в аппарате свертывания в наклонном положении при температуре 85°С в течение 45 минут. Готовые серии сред засевали микобактериями разных видов лабораторных штаммов M.bovis и M.avium, одновременно, из одного разведения бакмассы. Контрольными средами служили Левенштейна-Йенсена и Финна II, которые готовили по прописи авторов. Наблюдения за посевами вели до полного обильного накопления бакмассы. При этом регистрировали сроки первичного появления колоний и характер роста, изучали культурально-морфологические свойства колоний, ежедневным просмотром посевов наблюдали за степенью накопления бакмассы. Для сравнительного испытания модифицированной среды произвели серию параллельных посевов M.bovis и M.avium на 10 пробирок каждого варианта и на контрольную среду Финна II. Посевы делали по стандартной методике. Результаты исследований представлены в таблице 2.

При ежедневном просмотре посевов оказалось, что появление первичных колоний на средах разных вариантов происходит почти в одно и тоже время (на 4-е сутки M.avium и на 6-е сутки M.bovis), однако количество пробирок с ростом и обилие бакмассы на первом, втором и третьем вариантах значительно отличались от контрольной. Наилучший рост M.avium обнаружили на третьем варианте, a M.bovis на первом и третьем вариантах сред. Колонии микобактерий на них отличались массивностью выступающей над поверхностью среды бакмассой, которая образовывала “жгуты”. M.avium растет сплошным газоном, заметным невооруженным глазом через 4 сутки после посева. Цвет колоний и морфологические свойства культур не менялись.

На испытуемые варианты среды высеяли пробы мокроты, взятые от больных туберкулезом людей. Результаты этих исследований приведены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, первичный рост микобактерий на третьем варианте среды был обнаружен на 13-е сутки после посева, тогда как на всех остальных вариантах - на 16-е сутки, на среде Финна II - на 16-е и на среде Левенштейна-Йенсена - на 17-е сутки. Вместе с тем на 20-е сутки после посева на среде первого и третьего вариантов удалось выделить по 6 культур, на среде Финна II - 4 и на среде Левенштейна-Йенсена - 4. Число выделенных культур через 27 суток после посевов проб мокроты соответствовало: первый вариант - 5 (50%); второй - 3 (30,0%); третий - 6 (60,0%); четвертый - 3 (30,0%); Финн II - 4 (40,0%) и Левенштейна-Йенсена - 4 (40,0%).

Рост M.tuberculosis на средах первого и третьего вариантов отличался не только числом пробирок с ростом, но и характером колоний. Как размеры, так и число колоний на этих вариантах значительно превосходили роста на других вариантах и контрольных средах. Накопление бакмассы происходило за короткие сроки.

Таким образом, проведенные исследования показали, что среда, приготовленная на основе геотермальной воды без добавления каких-либо минеральных солей, приводит к ускорению роста, соответственно быстрому накоплению обильной бакмассы микобактерий, повышению частоты их выделения из проб мокроты, что в конечном итоге показывает значительно большую эффективность использования заявляемой среды. Наряду с этим уменьшаются материальные расходы (экономическая эффективность) и трудовые затраты, связанные с приготовлением солевого состава, упрощается схема изготовления среды, что делает ее доступной для любой бактериологической лаборатории.

Исследования показали большую предпочтительность для практического использования среды третьего варианта, поскольку скорость и массивность роста как лабораторных штаммов, так и выделенных из биоматериала микобактерий на ней выгодно отличались от остальных вариантов и контрольных сред.

Источники информации

1. Василев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. Медицина и физкультура. - София, 1971, - 382 с.

2. Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. - М.: Медгиз, 1963. - С. 94-99.

3. Чичибабин Е.С. Испытание питательной среды “Новая” (Мордовского) в практических условиях бактериологической лаборатории// Проблемы туберкулеза. - 1983. - № 1. - С. 67-68.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения и выращивания микобактерий, содержащая источник минеральных солей, приготовленный на дистиллированной воде, яйца куриные, глицерин, малахитовый зеленый 2%-ный, источник питательных веществ на основе картофеля, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гликокол, в качестве источника минеральных солей - геотермальную воду, а в качестве источника питательных веществ на основе картофеля - картофельный экстракт, приготовленный на геотермальной воде, при следующем количестве ингредиентов:

Яйца куриные, шт. 6

Гликокол, г 1,5

Глицерин, мл 3

Малахитовый зеленый 2%-ный 5

Картофельный экстракт, приготовленный

на геотермальной воде, мл 75,0

Геотермальная вода, мл 56,25

Дистиллированная вода, мл 18,75