Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии. L-треонин получают культивированием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обладающего способностью к продукции L-треонина. При этом указанная бактерия модифицирована с целью увеличения активности аспартатаминотрансферазы. Данное изобретение позволяет получать такую аминокислоту как L-треонин, с высокой степенью эффективности. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу получения L-аминокислот методом ферментации и более конкретно, к гену, полученному из бактерии Escherichia coli. Указанный ген является полезным для увеличения продукции L-аминокислот, например, L-треонина.

Предшествующий уровень техники.

Традиционно L-аминокислоты получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников или их мутантов, специально модифицированных для увеличения продукции L-аминокислот.

Для увеличения продукции L-аминокислот обычно используется, например, амплификация генов биосинтеза путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США 4278765). Подобные методики основаны на увеличении активностей ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или устранении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (смотри, например, выложенную заявку Японии №56-18596 (1981), заявку РСТ 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; европейский патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химическим реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ 0114525А1, европейская заявка 301572А2, патент США 5661012), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).

Наилучшим продуцентом треонина в настоящее время является известный штамм ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5705371). В ходе конструирования указанного штамма ВКПМ-3996 в его родительский штамм Е.coli К-12 (ВКПМ В-7) были введены несколько мутаций, а также описанная ниже плазмида. Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilv-4442) кодирует треониндезаминазу с низкой активностью, что приводит к уменьшению скорости биосинтеза изолейцина и образованию фенотипа с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что является очень эффективным при продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.

Ранее авторы настоящего изобретения получили, исходя из Е. coli K12, мутант, содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rbtA23) придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (Astaurova, О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21,611-616 (1985)). Мутация улучшала продукцию треонина (патент СССР 974817), гомосерина и глутамата (Astaurova, О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991, европейская заявка 1013765) соответствующего штамма - продуцента Е.coli, такого как штамм ВКПМ В-3996. Более того, авторы настоящего изобретения выяснили, что ген rhtA расположен в положении 18 min на хромосоме Е.coli рядом с опероном gInHPQ, кодирующим компоненты системы транспорта глутамина, и что ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (renybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и отрХ. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; европейская заявка 1013765).

В условиях, когда главный путь биосинтеза треонина изучен и в значительной степени оптимизирован, дальнейшее улучшение штамма - продуцента треонина может быть постигнуто путем повышения в бактерии количества дальних предшественников треонина, таких как аспартат.

Известно, что аспартат является донором углерода для синтеза аминокислот семейства аспартата (треонин, метионин, лизин) и диаминопимелата - одного из составляющих элементов клеточной стенки бактерий. Эти синтезы осуществляются в сложных метаболических путях с несколькими точками разветвления и чрезвычайно чувствительными схемами регуляции. В точке ветвления аспартата, полуальдегида аспартата, гомосерина столько изозимов, сколько и аминокислот, получающихся из этого биосинтетического этапа. Аспартокиназа-гомосериндегидрогеназа I, кодируемая частью оперона thrABC, осуществляет первую и третью реакции биосинтеза треонина. Треонин и изолейцин регулируют экспрессию аспартокиназа-гомосериндегидрогеназы I, а треонин ингибирует обе активности, катализирующие вышеупомянутые реакции (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Два гена вовлечены в образование аспартата - аспартатаминотрансфераза (аспартаттрансаминаза), кодируемая геном aspC и аспартаза, являющаяся продуктом гена aspA. Аспартатаминотрансфераза превращает оксалоацетат в аспартат. Аспартаза превращает фумарат в аспартат.

Описано влияние амплификации гена aspC на продукцию L-лизина -аминокислоты из семейства аспартата. Амплификации гена aspC использовалась в продукции L-лизина с помощью бактерии Е. coli (патент США 6040160). Коринеформные бактерии, содержащие аспартокиназу и повышенное количество ДНК, кодирующей несколько ферментов, включая аспартатаминотрансферазу, использовались для производства L-лизина (патент США 6004773).

Отмечалось, что аспартатаминотрансфераза может быть полезна для продукции L-треонина и L-лизина коринеформными бактериями (патент США 4980285).

Но к настоящему времени нет сообщений об использовании бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, с увеличенной активностью аспартатаминотрансферазы для производства L-треонина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов продуцентов L-треонина и предоставление способа получения L-треонина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген aspC, кодирующий аспартатаминотрансферазу, клонированный в низкокопийный вектор, может увеличивать продукцию треонина.

Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент треонина, которая модифицирована с целью увеличения активности аспартатаминотрансферазы.

2. Бактерия в соответствии с 1, в которой активность аспартатаминотрансферазы увеличена за счет увеличения экспрессирующегося количества гена аспартатаминотрансферазы.

3. Бактерия в соответствии с 1, в которой активность аспартатаминотрансферазы увеличена за счет увеличения числа копий гена аспартатаминотрансферазы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

4. Бактерия в соответствии с 3, в которой число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген.

5. Бактерия в соответствии с 2-4, в которой ген аспартатаминотрансферазы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

6. Бактерия в соответствии с 5, в которой ген аспартатаминотрансферазы кодирует следующие белки (А) или (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартатаминотрансферазы.

7. Бактерия в соответствии с 5, в которой ген аспартатаминотрансферазы содержит следующую ДНК (а) или (b)

(a) ДНК, которая представлена последовательностью нуклеотидов с 1 по 1196, приведенной в списке последовательностей под номером 1;

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1196, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартатаминотрансферазы.

8. Бактерия в соответствии с 7, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0.1%SDS.

9. Бактерия в соответствии с 8, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

10. Бактерия в соответствии с 9, где указанная бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии мутантного гена thrA, генов thrB, thrC, rhtA.

11. Способ получения L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с 1-10 в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде; и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина, которая модифицирована с целью увеличения активности аспартатаминотрансферазы.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1) могут быть упомянуты.

Согласно настоящему изобретению “бактерия - продуцент треонина” означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-треонина в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-треонина может быть придана или улучшена путем селекции.

Термин “активность аспартатаминотрансферазы” означает активность по катализу реакции образования аспартата из оксалоацетата и L-глутамата с высвобождением α-кетоглутарата с использованием пиридоксаль-5’-фосфата.

Термин “модифицирована с целью увеличения активности аспартатаминотрансферазы” означает то, что удельная активность в пересчете на клетку становится выше, чем у немодифицированного штамма, например, природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул аспартатаминотрансферазы в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы аспартатаминотрансферазы увеличена и так далее. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности аспартатаминотрансферазы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-треонина.

Увеличение активности аспартатаминотрансферазы в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения экспрессируемого количества гена, кодирующего аспартатаминотрансферазу. В качестве гена, кодирующего аспартатаминотрансферазу, может быть использован любой такой ген, выделенный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, а также гены, выделенные из бактерий других видов, таких как коринеформные бактерии. Наиболее предпочтительными из них являются гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

В качестве гена, кодирующего аспартатаминотрансферазу из Escherichia coli, известен ген aspC (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16128895). Более того, ген aspC может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием затравок, приготовленных на основании последовательности нуклеотидов указанного гена. Гены, кодирующие аспартатаминотрансферазу, из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Примером гена aspC из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (А) и (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью аспартатаминотрансферазы.

Количество “нескольких” аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). Это происходит по следующим причинам. Некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия в таких аминокислотах не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка и его активности. Поэтому, белком (В) может быть белок, имеющий гомологию не меньше, чем 30-50%, предпочтительно 50-70%, по отношению к всем аминокислотным остаткам, составляющим аспартатаминотрансферазу, и обладающий активностью аспартатаминотрансферазы.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как описанная выше аспартатаминотрансфераза, может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей аспартатаминотрансферазу (SEQ ID NO:1), например, с помощью метода сайт-направленното мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенных местах содержат делеции, замены, вставки или добавки. ДНК, модифицированная как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработки с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ-излучения или реагентом, таким как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартатаминотрансфераза, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей клетке, и изучения активности экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как аспартатаминотрансфераза, также может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность №1 (SEQ ID NO:1), в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью аспартатаминотрансферазы, из геномной ДНК, кодирующей аспартатаминотрансферазу, содержащую мутации, или из клетки, содержащей ее. Термин “жесткие условия”, упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Трудно четко описать такие условия в каких-либо численных выражениях. Однако, например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие меньшей гомологией, не гибридизуются друг с другом. В качестве варианта, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1%SDS при 60°С.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0.1%SDS.

Делеции, замены, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, в виду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих аспартатаминотрансферазу.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей какой-либо белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами, для увеличения экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии гена относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. В качестве метода трансформации может быть использован любой описанный к настоящему времени метод. Например, может быть использован метод обработки клеток - реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосомы бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации.

С другой стороны, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, Irp промотор, trc промотор, pr, pl промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью увеличения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт кодоном, в значительной степени влияет на транслируем ость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. MicrobioL, 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Как описано выше, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, транспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена аспартатаминотрансферазы в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO 00/18935 или патентной заявке Японии №1-215280.

Увеличение числа копий гена аспартатаминотрансферазы может быть достигнуто путем введения множественного числа копий гена аспартатаминотрансферазы в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена аспартатаминотрансферазы в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК в множестве копий, в качестве мишеней. В качестве последовательностей, присутствующих в хромосомной ДНК в множестве копий, могут использоваться повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Так же, как это описано в патентной заявке Японии №1-109985, возможно ввести ген аспартатаминотрансферазы в транспозон, для последующей трансформации с введением множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-треонина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-треонина.

В качестве родительского штамма, в которым активность аспартатаминотрансферазы, кодируемой геном aspC, будет повышена, могут быть использованы штаммы - продуценты треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др. Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Штамм ВКПМ В-3996 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор RSF1010 оперона thrA*ВС, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов в дополнение к гену aspC:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

Также предпочтительно, чтобы в дополнение к увеличению экспрессии гена aspC, указанная бактерия была модифицирована для увеличения экспрессии гена rhtA, кодирующего, как предполагается, трансмембранный белок. Наиболее предпочтительное воплощение указанной бактерии заключается в увеличении экспрессии гена aspC, мутантного гена thrA, генов thrB, thrC и rhtA.

Способ получения L-треонина согласно настоящему изобретению включает стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде, и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-треонина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-треонин может быть выделен и очищен методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на Примеры.

Пример 1. Клонирование гена aspC из Е.coli в вектор pMW119.

Ген aspC, был получен из хромосомной ДНК штамма Е.coli К-12 методом ПЦР с использованием затравок, указанных в Списке последовательностей под номерами 3 и 4 (SEQ ID NOs: 3, 4). Полученный фрагмент ДНК, был обработан рестриктазами Pvull и EcoRI и лигирован под контроль промотора P_lac в стабильную низкокопийную плазмиду pMW119 (репликон pSC101), предварительно обработанную рестриктазами Hindi и EcoRI. Так была получена плазмида pMW-P_lac-aspC.

Также ген aspC был помещен под контроль сильного промотора pr из фага лямбда вместо промотора Piac. ДНК дуплекс, содержащий промотор p_r, был образован из химически синтезиров&нных 5’-фосфорилированных олигонуклеотидов, показанных в Списке последовательностей под номерами 5 и 6 (SEQ ID NO:5, 6). Затем ДНК дуплекс был лигирован в плазмиду pMW-P_lac-aspC, предварительно обработанную рестриктазами Pvull и Hindlll. Так была сконструирована плазмида pM-P_R-aspC.

С использованием этих плазмид может быть достигнут нерегулируемый высокий уровень экспрессии гена aspC. Плазмиды pMW-P_lac-aspC и pM-P_R-aspC совместимы с плазмидой pVIC40 (репликон pRSF1010), поэтому две плазмиды pVIC40 и pMW-P_lac-aspC или pVIC40 и рМ-Р_R-aspC могут поддерживаться в бактерии одновременно.

Каждая из плазмид pMW-P_lac-aspC и рМ-Р_R-aspC была введена в устойчивый к стрептомицину штамм Е.coli B-3996 - продуцент треонина (патент США%, 175,107). Так были получены штаммы B-3996(pMW-P_lac-aspC) и B-3996(pM-P_R-aspC).

Пример 2. Влияние амплификации гена aspC на продукцию треонина.

Штаммы Е.coli B-3996(pMW-P_lac-aspC) и В-3996(рМ-Р_R-аsрС) выращивались в течение 18-24 часов при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим стрептомицин (100 мкг/мл). Затем одна петля клеток была перенесена в 50 мл L-бульона следующего состава: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л. Клетки (50 мл, OD₅₄₀ - 2 опт.ед.), выросшие на качалке при 37°С в течение 5 часов были использованы для засева 450 мл среды для ферментации. Ферментация в периодическом режиме ("batch fermentation") осуществлялась в лабораторном ферментере емкостью 1 л с аэрацией (1/1 vvm) с перемешиванием со скоростью 1200 об/мин при 37°С. Значение рН поддерживалось автоматически при 6.6 с использованием 8% раствора аммиака. Результаты представлены в Таблице 1. Состав среды для ферментации (г/л):

Состав среды для ферментации (г/л):

Сахароза 100.0

NH₄Cl 1.75

K₂HPO₄ 1.0

MgSO₄7H₂O 0.8

FeSO₄7H₂O 0.01

MnSO₄5H₂O 0.01

Mameno(TN) 0.15

Бетаин 1.0

L-изолейцин 0.2

Сахароза и сульфат магния стерилизовали раздельно. Значение рН соответствовало 6.6.

Таблица 1.
Штамм	Дополнительный ген aspC	Время, часы	OD540	Треонин, г/л
В-3996	-	19.1	34.6	45.0
		18.4	33.8	43.8
В-3996	+	17.5	29.8	45.2
(pMW-Plac-aspC)		18.5	30.6	45.8
18.5	30.8	45.9
		18.3	30.0	46.2
18.2±0.5	30.3±0.5	45.9±0.4
В-3996	+	16.0	32.0	45.4
(PM-PR-aspC)		18.0	30.8	46.5
17.8	29.4	45.8
		18.3	30.0	45.2
17.9±1.0	30.4±1.1	45.6±0.6

1. Способ получения треонина, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней треонина, отличающийся тем, что используют бактерию Escherichia coli, в которой активность аспартатаминотрансферазы увеличена.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активность аспартатаминотрансферазы увеличена за счет увеличения экспрессирующегося количества гена аспартатаминотрансферазы.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что активность аспартатаминотрансферазы увеличена за счет увеличения числа копий гена аспартатаминотрансферазы или модификации последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что число копий гена увеличено за счет трансформации бактерии с помощью низкокопийного вектора, содержащего указанный ген.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что ген аспартатаминотрансферазы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что ген аспартатаминотрансферазы кодирует белки, выбранные из группы (А) белок, состоящий из последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2; (В) белок, состоящий из последовательности аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и обладающий активностью аспартатаминотрансферазы.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что ген аспартатаминотрансферазы содержит следующую ДНК (а) или (b): (а) ДНК, состоящую из последовательности нуклеотидов с 1 по 1196, приведенной в списке последовательностей под номером 1; (b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1196, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью аспартатаминотрансферазы, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С, а концентрация соли соответствует 1×SSC и 0,1% SDS.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что в такой бактерии усилена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи; гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу; гена thrC, кодирующего треонинсинтазу; гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в такой бактерии экспрессирующееся количество мутантного гена thrA, генов thrB, thrC и rhtA повышено.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-треонина используют штамм Escheriсhia coli В-3996 (рМW-P_lac-aspC) или В-3996(pM-P_R-aspC).

11. Штамм Escherishia coli В-3996 (рМW-P_lac-aspC) - продуцент треонина.

12. Штамм Escherishia coli В-3996(pMW-P_R-aspC) - продуцент треонина.