Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов



Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов

Владельцы патента RU 2250906:

Небольсин Владимир Евгеньевич (RU)

Изобретение относится к способам получения порфиринопептидов формулы I

где R1 и R2 - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2-15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы С1-С8алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R1=R2 или R1 ≠R2, в частности R1=-ArgOMe, R2=-ОН (III); R1=-LeuHisOMe, R2=-OH (IV); R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-OH (V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C1-C8 эфиром или физиологически приемлемой солью; Y- представляет собой Cl-; Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn; путем активации карбоксильной группы порфирина действием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидом при молярном соотношении исходных реагентов 1:1 и процесс ведут в присутствии N,N' – дициклогексилкарбодиимида, или действием дифенилфосфорилазида (DPPA) при эквимолярном соотношении порфирин:DPPA в присутствии основания, затем активированный по карбоксильной группе порфирин вводят в реакцию с аминокомпонентом - аминокислотой или пептидом, находящимся в виде соли с минеральной кислотой, которую нейтрализуют основанием; и к применению I в качестве нуклеолитических агентов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новому способу синтеза конъюгатов порфиринов, в частности гемина с олигопептидами и аминокислотами, и их применению в качестве нуклеолитических агентов, общей формулы I:

где R1 и R2 - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2-15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы C1-C8 алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R1=R2 или R1 ≠R2, в частности R1=-ArgOMe, R2=-OH(III); R1=-LeuHisOMe, R2=-OH(IV); R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-OH(V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C1-C8 эфиром или физиологически приемлемой солью;

Y- представляет собой Сl-;

Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn.

Известно, что одним из механизмов действия противовирусных препаратов является их способность разрушать ДНК. В связи с этим в настоящее время ведется поиск реагентов, способных эффективно и селективно деструктурировать ДНК и РНК. Соединения с такой активностью обнаружены, например, среди пептидов [Pierre J., Laval J. // J.Biol. Chem. 1981. V.256. Р.10217-10220] и их конъюгатов с олигонуклеотидами. Гемин обладает некоторой противовирусной активностью [Levere R.D., Gong Y.-F., Bucher D.J., Wormser C.P., Abraham N.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.1756-1759] и в особых условиях может стать причиной разрушения участков ДНК [Aft R.L., Mueller G.C. The hemin - mediated DNA strend scission. // J.Biol. 1983. V.258. P.19069-19079].

Учитывая вышеуказанное, геминпептиды могут представлять собой более совершенные реагенты для расщепления ДНК (РНК).

Порфиринопептиды, конкретнее геминпептиды, соответствующие формуле (I), а именно (IV), (V), ранее получали как методами классического синтеза в растворе, так и на твердой фазе. В обоих случаях в качестве активированного производного гемина использовался N-оксисукцинимидный эфир [Радюхин В.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П. // Журн. Общ. химии. 1980. Т.50. С.673-678.; Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева Л.К., Желтухина Г.А. // Биоорган. химия. 1993. Т.19. №6. С.664-669.; Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик И.И.// Авторская заявка на патент № 2002111028, дата подачи 25.04.2002].

Твердофазный метод синтеза геминпептидов позволяет целенаправленно с высоким выходом получать монопептидные производные гемина и имеет преимущества перед классическим синтезом в растворе при получении геминпептидов, содержащих достаточно длинные пептиды со сложной аминокислотной последовательностью. Однако синтез твердофазным методом геминпептидов, содержащих остатки аминокислот или коротких пептидов, неоправдано сложен и трудоемок по сравнению с синтезом в растворе.

Известные аминоацильные и пептидные производные гемина, соответствующие формуле I, а именно (III-V), ранее были получены путем взаимодействия аминосвободного эфира аминокислоты или пептида с N-оксисукцинимидным эфиром гемина [Евстигнеева Р.П., Рожкова Е.А., Немыкин В.Н., Воронов С.А., Желтухина Г.А. // ДАН. 1997. Т.356. С.642-644.; Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик Н.Н.// Авторская заявка на патент № 2002111028, дата подачи 25.04.2002].

Последний представляет собой смесь моно- и бис-эфиров с гемином при соотношении приблизительно 2:1:1, который вводится в реакцию с аминокомпонентом без выделения. Вследствие этого для выделения моно-аминоацильных и моно-пептидных производных гемина оказалось необходимым применение трудоемкой двухстадийной очистки, предусматривающей использование колоночной и препаративной тонкослойной хроматографии. В результате выходы геминпептидов (III-V) составили соответственно 17, 47 и 41%.

Вышеуказанные недостатки делают известные способы малопригодными для препаративного синтеза низкомолекулярных геминпептидов, соответствующих общей формуле I.

Задачей заявленного изобретения является упрощение процесса, повышение выхода и качества целевого продукта.

Поставленная задача решается заявленным способом, согласно которому синтез порфиринопептидов, в частности геминпептидов формулы I, в растворе осуществляют путем ацилирования аминогруппы аминокислоты или пептида N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидным эфиром гемина или гемином, карбоксильная группа которого активирована действием DPPA [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова думка. 1992. 359 С.].

Активацию карбоксильной группы гемина осуществляют путем превращения в N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир DCC-методом (схема 1) с применением эффекта концентрационного разбавления. Последний заключается в медленном прибавлении в течение 5-6 часов раствора 1 экв. DCC в диметилформамиде к раствору протогемина IX и N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида (1:1) при 0° С и при интенсивном перемешивании. В результате соотношение гемин:моно-активированный эфир:бис-активированный эфир в реакционной смеси составляет приблизительно 2:4:1 соответственно. Таким образом, количество моно-активированного эфира в реакционной смеси увеличивается в два раза, а количество бис-активированного эфира соответственно уменьшается по сравнению с подобной реакцией с N-оксисукцинимидом.

Схема 1

Синтез 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX

Полученный моно-ONb-эфир гемина (II) без выделения вводят в реакцию с аминокомпонентами H-ArgOMe или H-Leu-HisOMe или H-Leu-Leu-Val-PheOMe. Реакции протекают с более высокой скоростью по сравнению с аналогичными реакциями с участием N-оксисукцинимидного эфира гемина. При этом наблюдается полная конверсия моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира и аминокомпонентов с преимущественным образованием моно-аминоацильного или монопептидного производных гемина; соотношение образующихся моно- и бис-аминоацильных или пептидных производных гемина в реакционной смеси составляет приблизительно 4:1.

Вышеуказанные факторы и значительное различие в Rf моно- и бис-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидными эфирами гемина, а также между N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидными эфирами и аминоацильными и пептидными производными гемина позволяют упростить процесс выделения и повысить выходы целевых моно-пептидных производных гемина (III, IV, V). Для очистки этих геминпептидов оказалось достаточной однократная колоночная хроматография на силикагеле, в то время как при использовании N-оксисукцинимидного эфира гемина для выделения соответствующих геминпептидов (III, IV, V) требовалась достаточно сложная очистка: колоночная хроматография в сочетании с препаративной ТСХ или двухкратная препаративная [Евстигнеева Р.П., Рожкова Е.А., Немыкин В.Н., Воронов С.А., Желтухина Г.А. // ДАН. 1997. Т.356. С.642-644], что усложняет весь процесс в целом и снижает выход продуктов.

Выходы геминпептидов (III, IV, V), полученных с использованием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидных эфиров гемина, были несколько выше, чем в случае N-оксисукцинимидных эфиров гемина, и составляют соответственно 36, 60 и 51%.

Кроме того, поставленная задача заявленного изобретения, заключающаяся в повышении выхода и качества моно-производных протогемина IX и упрощения процесса их выделения, решается и другим, альтернативным методом с применением дифенилфосфорилазида (DPPA) для активации СООН-группы гемина.

Активацию СООН-группы гемина действием DPPA проводят в целом в соответствии с методикой, применяемой в пептидном синтезе для активации аминокислот [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова думка. 1992. 359 С.], путем последовательного добавления к раствору гемина при охлаждении основания, DPPA и аминокомпонента. Преимуществом предлагаемого способа, как и в случае ONb-эфиров гемина, являются практически полная конверсия аминокомпонента, преимущественное образование моно-пептидного производного (соотношение образующихся моно- и бис-пептидных производных гемина составляет приблизительно 4:1).

Вышеуказанные факторы и отсутствие устойчивых активированных производных гемина после завершения реакции позволяют упростить процесс выделения и повысить выходы целевых моно-производных гемина. Для их очистки оказалось достаточно однократной колоночной хроматографии на силикагеле и выходы аминоацильного производного гемина и геминпептидов составили соответственно 63, 66 и 62%.

Ранее при получении геминпептидов (IV, V) использовались аминокомпоненты, полученные путем нейтрализации соответствующих трифторацетатов триэтиламином. Известно, что трифторуксусная кислота в присутствии основания и активированного карбоксильного компонента в безводной среде в ходе реакции образования различными методами пептидной связи между активированным карбоксильным и аминокомпонентами может служить источником побочных реакций [Гросс Э., Майенходер Н. Пептиды. Основные методы образования пептидной связи. // Москва. Мир. 1983].

Кроме того, трифторацетат может выступать в качестве противоиона по иону металла вместо Сl- в составе порфиринового остатка.

Вышеуказанное может изменять и ухудшать качество и выход геминпептидов, в том числе их устойчивость при хранении.

Так, геминпептиды (IV, V), полученные с использование трифторуксусной кислоты, неустойчивы в растворах DMSO, что подтверждается методами ТСХ, электронной и масс-спектрометрии, что может быть причиной плохой воспроизводимости результатов биологических и биохимических испытаний, проводимых в растворах, содержащих DMSO.

Поставленная в заявке на изобретение задача повышения качества и выходов геминпептидов решается путем замены трифторуксусной кислоты на минеральную, например соляную, при отщеплении N-защиты, например Воc, от N-защищенных пептидов - аминокомпонентов при синтезе геминпептидов формулы I. Полученные таким способом геминпептиды устойчивы в растворах, содержащих DMSO.

Заключение

Таким образом, способ активации СООН-групп гемина с применением моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира и DCC или DPPA в присутствии основания и использование аминокомпонентов - пептидов в виде солей с минеральной кислотой, например хлоргидратов, с последующей нейтрализацией основанием обеспечивают упрощение процесса, повышение выходов и качества геминпептидов.

Список сокращений

Воc - трет-бутилоксикарбонил

DCC - N,N’-дициклогексилкарбодиимид

DCU - N,N’-дициклогексилмочевина

DMF - N,N’-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DPPA - дифенилфосфорилазид

МеОН - метиловый спирт

ОМе - метиловый эфир

ONb - норборнендикарбоксиимидоокси

Трис-НСl - (гидроксиметил)аминометан-гидрохлорид

ТСХ - хроматография в тонком слое

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Экспериментальная часть

Синтез порфиринопептидов отражен в примерах 2-7.

Предлагаемые порфиринопептиды получают с высокими выходами и высокой степенью чистоты и характеризуют УФ-, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, ТСХ.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (фирмы "Merck", Германия) в системах: хлороформ - метанол 9:1 (1), хлороформ - метанол - уксусная кислота 5:3:1 (2), хлороформ - метанол 4:1 (3), на пластинах Alufol (нейтр., фирмы "Merck", Германия) - в метаноле (4), в системе хлороформ - метанол 9:1 (5).

Хроматограммы проявляют нингидрином, хлор-толидиновым реактивом и по свечению в УФ-свете, имидазолсодержащие производные - реактивом Паули.

Масс-спектры высокого разрешения получают на времяпролетном масс-спектрометре REFLEX™ III (BRUKER, Германия) методом матриксной лазернодесорбционной ионизации, в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидрооксибензойная кислота.

ИК-спектры регистрируют на приборах: Perkin ELMER FT-IR Spectrometer 1725X (Швейцария) и Magna 750 (Nicolet, США).

Электронные спектры снимают на приборе Jasco model UV/VS 7800 Spectrophotometer (Япония).

Пример 1. Синтез 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (II)

К раствору 0.7 г (1.08 ммоль) протогемина IX в 7 мл DMF и 0.20 г (1.08 ммоль) N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида при охлаждении до -10° С и перемешивании добавляют по каплям 0.22 г (1.08 ммоль) DCC в 3 мл DMF в течение 6 ч. Раствор оставляют на 48 ч при 0° С. DCU отделяют. Дополнительную очистку от DCU проводят переосаждением из DMF эфиром. В осадке получают смесь соединений с Rfocн.(II) 0.27(1), Rfминорн. 0.5(1), Rfгемина 0.15 (1).

Пример 2. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (III)

К раствору 0.16 мл (1.2 ммоль) Еt3N в 2 мл DMF прибавляют 0.16 г (0.6 ммоль) гидрохлорида метилового эфира аргинина, оставляют на 15 мин при 0° С. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 20.8 мл (0.6 ммоль) 6(7)-моно-N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина (IX) в DMF, полученного по вышеуказанной методике. Реакционную смесь перемешивают 5 ч до полного исчезновения моно-активированного эфира гемина с Rf 0.27(1). Раствор концентрируют в вакууме до 2 мл и прибавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от раствора декантированием и сушат над безводным CaCl2. Вещество очищают на колонке (24× 1.2 см) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Фракции, содержащие вещество с Rf 0.78(2), объединяют. Растворитель удаляют в вакууме. Вещество растворяют в 8 мл бутанола и промывают водой (3× 3 мл). Растворитель из органического слоя удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl- геминпептид (III) в 10 мл смеси хлороформ-метанол (9:1) встряхивают с 6 мл 0.5 н соляной кислоты, 6 мл 2% водного раствора гидрокарбоната натрия и водой до нейтральной реакции. Органический слой сушат над безводным Na2SO4, растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат над безводным CaCl2 в вакууме. Выход 0.14 г (36%). Rf 0.78 (2). Электронный спектр, λ max, нм, СНСl3-МеОН (1:1), (ε · 10-3): 397.4 (101.5), 500.80 (4.49), 540.40 (2.63). 626.0 (1.14). ИК-спектр, ν , см-1, вазелиновое масло: 1745 (СО cл.эф.), 1650 (амид I), 1514 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]+ 786.41.

Пример 3. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-His-OMe (IV)

Раствор 0.14 г (0.36 ммоль) Boc-Leu-His-OMe в 3.25 н НСl в смеси диоксана и метанола выдерживают 25 мин при 20° С. Кислоту и растворитель удаляют в вакууме, остаток растирают с эфиром. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакууме над безводным NaOH. К раствору дихлоргидрата метилового эфира лейцилгистидина в 3.0 мл DMF при перемешивании и охлаждении до 0° С добавляют 0.1 мл (0.72 ммоль) Et3N. Оставляют на 15 мин при 0° С. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 8 мл (0.36 ммоль) 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (I), полученного ранее. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч до исчезновения аминокомпонента. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным CaCl2. Вещество очищают на колонке (19× 3.5 см) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Фракцию, содержащую смесь моно- и бис-(метилового эфира Nα -лейцилгистидил)-протогемина IX с Rf 0.4 (3) и Rf 0.38 (3) соответственно, и фракцию, содержащую индивидуальный продукт с Rf 0.38 (3), 0 (4) собирают отдельно. Растворитель удаляют в вакууме. Фракцию с Rf 0.4 (3) дополнительно очищают колоночной хроматографией, элюируют смесью хлороформ-метанол (9:1), отбирают фракции отдельно с Rf соответственно 0.38 (3), 0 (4) (соединение IV), 0.4 (3), 0.8 (4) (бис-производное). Растворитель удаляют в вакууме. Целевое вещество (IV) переосаждают эфиром из хлороформа. Для введения противоиона Сl- геминпептид (IV) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.19 г (60%). Rf 0.38 (3), Rf 0 (4), Электронный спектр, λ мах, нм, СНСl3-МеОН (8:2), (ε · 10-3): 401.00 (102), 497.40 (10.6), 575.80 (3.87), 630.20 (2.27). ИК-спектр, KBr, ν , см-1: 3274 (NH, ш.с.), 1744 (СО cл.эфир), 1663 (амид I), 1552 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 880.8.

Пример 4. Nα -[6(7)-(Протогемин IХ)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (V).

Соединение (V) получают аналогично соединению (IV) из 0.105 г (0.18 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe и 4.5 мл (0.18 ммоль) 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (II), полученного ранее. Целевое вещество выделяют на колонке (35× 1.2 см) с Kieselgel 60, элюируя смесью растворителей хлороформ-метанол (9:1). Для введения противоиона Сl- геминпептид (V) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.190 г (51%). Rf 0.5 (1), Rf 0 (5). Аминокислотный анализ: Leu 1.9 (2), Val 1.07 (1), Phe 1.02 (1). ИК-спектр, ν , см-1, KBr: 3248 (NH-), 1730 (СО сл.эф.), 1640 (амид I), 1540 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M+] 1102.8.

Пример 5. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (IIIa)

К раствору 0.05 г (0.20 ммоль) H-ArgOMex2HCl и 0.13 г (0.20 ммоль) протогемина IX в 2 мл DMF при охлаждении до -10° С и перемешивании прибавляют 0.044 мл (0.20 ммоль) DPPA и 0.084 мл (0.6 ммоль) Et3N. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при -10° С и 15 ч при 20° С. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным СаСl2. Соединение очищают на колонке с Kieselgel 60 F254 (12× 31.5 см) (Merck). Целевое вещество с Rf 0.78 (2) элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Растворитель удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl- геминпептид (IIIa) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.100 г (63%). Rf 0.78 (2). Электронный спектр, λ max, нм, СНСl3-МеОН (1:1), (ε · 10-3): 398.4 (97.5). 495.80 (5.8), 542.40 (2.54), 630.0 (1.1). ИК-спектр, ν , см-1, вазелиновое масло: 1745 (СО сл.эф.), 1635 (амид I), 1560 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]+ 786.0.

Пример 6. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-His-OMe (IVa)

Раствор 0.10 г (0.26 ммоль) Boc-Leu-His-OMe в 3.25 н НСl в смеси диоксана и метанола выдерживают 25 мин при 20° С. Кислоту и растворитель удаляют в вакууме, остаток растирают с эфиром. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакууме над безводным NaOH. К раствору полученного аминокомпонента и 0,17 г (0.26 ммоль) протогемина IX в 3 мл DMF, при охлаждении до -10° С и перемешивании прибавляют 0.056 мл (0.26 ммоль) DPPA и 0.11 мл (0.8 ммоль) Et3N. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при -10 С и 15 ч при 20° С. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным CaCl2. Соединение (IVa) очищают на колонке с Kieselgel 60 F254 (35× 1.2 см) (Merck). Растворитель удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl- геминпептид (IVa) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.156 г (65.6%). Rf 0.38 (3), Rf 0 (4). Аминокислотный анализ: Leu 1.12 (1), His 1.07 (1). ИК-спектр, ν , см-1, KBr: 3400 (NH-), 1741 (СО сл.эф.), 1660 (амид I), 1534 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]+ 880.2

Пример 7. Nα -[6(7)-(Протогемин IХ)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (Va)

Деблокирование аминокомпонента и синтез геминпептида (Va) осуществляют в соответствии с условиями, описанными для соединения (IVa), исходя из 0.075 г (0.12 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe, 0.078 г (0.12 ммоль) протогемина IX в 3 мл DMF, 0.03 мл (0.12 ммоль) DPPA и 0.033 мл (0.24 ммоль) Еt3N. Целевое вещество выделяют на колонке (40× 1.2 см) с Kieselgel 60, элюируя смесью растворителей хлороформ-метанол (9:0.5). Для введения противоиона Сl- геминпептид (Va) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.084 г (62%). Rf 0.5 (1), Rf 0 (5). Аминокислотный анализ: Leu 2.01 (2), Val 1.06 (1), Phe 0.9 (1). ИК-спектр, ν , см-1, KBr: 3250 (NH-), 1726 (СО сл.эф.), 1642 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 1103.0

Исследование нуклеолитической активности геминпептидов

Другим объектом изобретения является применение геминпептидов общей формулы I в качестве нуклеолитических агентов.

Исследование нуклеолитической активности геминпептидов (III, IV, V) проводят по типичной методике [Maniatis Т., Fritish E., Sambrook J. Molecular Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982] с применением ДНК плазмиды pGem, а также ДНК плазмиды pUKB244, несущей полноразмерный вирусный ген Gag-P24 (ВИЧ), выделенных из E.coli. Геминпептиды в концентрации 10-4-10-8 М инкубируют с 0.5 мкг плазмидной ДНК в течение 1 ч при 37° С в 10 мкл реакционной смеси. Продукты расщепления анализируют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере (0.04 М Трис-ацетат (рН 8.0), 0.02 М ЭДТА) при напряжении 10 В/см. Продукты реакции визуализируют путем окрашивания их флуоресцирующим красителем бромистым этидием. Полосы ДНК детектируют с помощью источника УФ-света длинноволновой области с λ 300 нм и фотографируют с помощью цифровой камеры фирмы “Canon”.

Активность соединений исследуют при кислых и нейтральных значениях рН в следующих буферных растворах:

буфер I:100 мМ AcONH4 (рН 4.5), 10 мМ MnCl2;

буфер II: 100 мМ AcONH4 (pH 4.5), 20 мМ ZnOAC2;

буфер III: 100 мМ AcONH4 (pH 4.5), 10 MM MgCl2;

буфер IV: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 20 мМ МnСl2;

буфер V: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 20 мМ ZnOAC2;

буфер VI: 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2;

буфер VII: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 2 мМ FeSO4;

буфер VIII: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ КСl, 0.1 mg/ml BSA, 200 мМ ЭДТА;

буфер IX: 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 10 мМ MgCl2, 0.1 mg/ml BSA, 200 мМ ЭДТА.

Геминпептиды прибавляют к реакционной смеси в виде раствора в DMSO, причем концентрация DMSO в конечной пробе составляет 10%.

Исчезновение полос, соответствующих различным формам ДНК, свидетельствуют о расщеплении ДНК по окислительному типу.

Результаты

Введение в реакционную среду геминпептидов вызывает исчезновение полос (расщепление) ДНК в различных условиях (рН, ионы металлов и др.) (см. таблицу).

Таблица 1

Нуклеолитическая активность геминпептидов
№ соединенияФормулаБуфер (), расщепление ДНКБуфер (), отсутствие расщепления ДНК
IIIHeminArgOMe(I-III, VIII, IX)

+		(IV-VII)

-
IVHeminLeuHisOMe(I, II)

+		(III-IХ)

-
VHeminLeuLeuValPheOMe (I, IV)

-
+ расщепление ДНК

- отсутствие расщепления ДНК

Заключение

Порфиринопептиды, полученные заявленным способом, можно применять в качестве нуклеолитических агентов, например для биомедицинских исследований, или в качестве потенциальных лекарственных средств для химиотерапии вирусных и онкологических заболеваний.

1. Способы получения порфиринопептидов общей формулы I или их фармацевтически приемлемых солей

(I)

где R1 и R2 - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2÷ 15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы С1-С8 алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R1=R2 или R1≠R2, в частности R1=-ArgOMe, R2=-OH (III); R1=-LeuHisOMe, R2=-OH (IV); R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-OH (V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим С1-С8 эфиром или физиологически приемлемой солью;

Y- представляет собой Cl-;

Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn;

включающие активацию карбоксильной группы порфирина и последующее взаимодействие активированного производного порфирина с аминокислотой или пептидом, отличающиеся тем, что карбоксильную группу порфирина активируют действием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида при молярном соотношении исходных реагентов 1:1 и процесс ведут в присутствии DCC, или действием DPPA при эквимолекулярном соотношении порфирин: DPPA в присутствии основания, затем активированный по карбоксильной группе порфирин вводят в реакцию с аминокомпонентом - аминокислотой или пептидом, находящимся в виде соли с минеральной кислотой, которую нейтрализуют основанием.

2. Способы получения порфиринопептидов по п.1, отличающиеся тем, что в соединениях общей формулы I остаток порфирина представляет собой гемин; остатки аминокислоты или пептида представляют собой -Arg-OMe, -Leu-HisOMe, -Leu-Leu-Val-PheOMe, а основание для активации СООН группы гемина действием DPPA и нейтрализации аминокомпонента, находящегося в виде хлористоводородной соли, представляет собой триэтиламин.

3. Применение порфиринопептидов общей формулы I в качестве нуклеолитических агентов.

4. Применение порфиринопептидов по п.3, отличающееся тем, что соединения общей формулы I проявляютнуклеолитическую активность по отношению к вирусной ДНК.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу получения синтетического производного хлорофилла (Chl) или бактериохлорофилла (BChl) общей формулы I: где X=0путем взаимодействия в анаэробных условиях производных Chl, BChl, имеющих в положении С-132 группу СООСН3, а в положении С-172 - группу COOR 2, в присутствии тетраэтилортотитаната, при этом для получения соединений I, где R1 R2, процесс ведут в апротонном растворителе, таком как свободный от пероксида тетрагидрофуран и диметилформамид, а при получении соединений I, где R1=R2 , в качестве растворителя используют R1 OH.

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к получению новых производных металлопорфиразинов, которые могут найти применение в качестве красителей, катализаторов различных процессов, материалов чувствительных элементов (ЧЭД) газов и т.д.

Изобретение относится к новым производным металлопорфиразинов, которые могут примененяться в качестве пигментов, катализаторов, материалов чувствительных элементов газов.

Изобретение относится к получению металлокомплексов мезо-тетраарилзамещенных тетрабензопорфина, которые могут быть использованы в качестве жирорастворимых красителей, а также в качестве исходных соединений для получения водорастворимых красителей.

Изобретение относится к производным гемина или их фармацевтически приемлемым солям - ингибиторам протеолитических ферментов и представляющим собой соединения общей формулы (I) где R1 и R2 - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты, производные аминокислот, пептиды, состоящие из 1-15 аминокислотных остатков, производные пептидов, состоящих из 1-15 аминокислотных остатков, а -карбоксильная группа аминокислот или пептидов и боковые группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы, причем возможно, что R1=R2 или R1 R2=OH; карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C2-C8-эфиром или физиологически приемлемой солью; Y- представляет собой Cl-, СН3СОО-; Me представляет собой Fe, за исключением соединений, гдеМе=Fe3+, Y-=Cl-,R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-OH; R1=-ValPheOMe, R2=-OH; R1=-LeuHisOMe,R2=-OH; R1=-LeuHisAlaOMe, R2=-OH; R1=-LeuHisNHC10H20COOMe, R2=-ОН;R1=-LeuHisNHC10H20COOH, R2=-OH; R1=-LeuHisNHC10H20COOMe,R2=-LeuHisNHC10H20COOMe; R1=-Lys(Tfa)AlaAlaOMe, R2=-OH;R1=-ValPheOMe, R2=-LeuHisOMe; R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-LeuHisOMe;R1=-LeuLys(Tfa)LeuOMe, R2=-OH; R1=-LeuLys(Tfa)LeuOMe, R2=-LeuHisOMe;R1=-Lys(Tfa)AlaAlaOMe, R2=-AlaHisLys(Cbz)LeuOMe; R1=-GlyOBzl,R2=-GlyOBzl; R1=-HisOMe, R2=-HisOMe; R1=-LeuHisOMe, R2=-LeuHisOMe;R1=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R2=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl;R1=-LeuHisOMe, R2=-OEt; R1=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R2=-OEt; R1=-OBzl,R2=-OBzl; R1=-OBzl, R2=-OH; R1=-AlaOMe, R2=-OBzl; R1=-HisOMe, R2=-OBzl;R1=-LeuHisOMe, R2=-OBzl; R1=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R2=-OBzl;R1=-LeuHisAlaLys(Cbz)GlyCys(Bzl)OBzl, R2=-OBzl; R1=-LeuHisLys(Cbz)OMe,R2=-OH; R1=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe, R2=-OH; R1=-LeuHisOMe, R2=-OMe;R1=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe, R2=-OMe; R1=-AlaLeuAlaPheAlaCys(Bzl)OMe,R2=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R1=-AlaLeuAlaPheAlaCys(Bzl)OBzl,R2=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R1=-LeuHisAlaLys(Cbz)Cys(Bzl)OBzl,R2=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R1=-LeuHisOMe, R2=-OMe;R1=-GlyProArgGlyGlyOMe, R2=-OH;R1=-ArgProProGlyPheSer(Bzl)PheArgGlyGlyOMe, R2=-OH,двум способам получения производных гемина общей формулы I, фармацевтической композиции, обладающей способностью ингибировать протеолитические ферменты и применению производных гемина формулы I, ранее известных, обозначенных выше, в качестве ингибиторов протеолитических ферментов: протеиназы ВИЧ, пепсина, трипсина, химотрипсина.

Изобретение относится к новым соединениям, металлкомплексам карборанилпорфиринов общей формулы I, обладающим противоопухолевой активностью и низкой токсичностью, которые могут быть использованы в борнейтронзахватной терапии рака.

Изобретение относится к палладийзамещенным производным бактериохлорофилла формулы I, I' или I" где А представляет собой ОН, OR1, -O-(CH2)n-Y, -S-(CH2)n-Y, -NH-(CH2)n-Y, -O-(СН2)2-ОН, -NH-(CH2)2-NH-BOC или -N(CH2-CH=CH2)2, где R1 представляет собой Na+, K+, (Са2+)0,5, (Mg2+)0,5, Li+, NH+4, +NH3-C(CH2OH)3,+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, +NH2(СН3)-СН2-(СНОН)4-СН2OH или +N(Cn'H2n'+1)4; R2 представляет собой Н или C1-C12 алкил для соединения формулы I', и R2 представляет собой Н, ОН или COOR4 для соединения формулы I, где R4 представляет C1-C12 алкил или С3-С12 циклоалкил; R3 представляет собой Н или C1-C12 алкил для соединения формулы I', и R3 представляет собой Н, ОН или C1-C12 алкил или алкокси для соединения формулы I; n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, Y представляет собой -NR'1NR'2 или -+NR'1R'2R'3X-, где R'1, R'2 и R'3 каждый независимо от другого представляет собой -СН3 или -С2Н5; Х представляет собой F, Cl, Br или I, n' равно 1, 2, 3 или 4, и где * обозначает асимметричный атом углерода и --- обозначает одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь фармацевтической композиции, обладающей способностью детектирования или лечения опухолей, содержащей, по меньшей мере, одно соединение формулы I, I' или I", трем способам получения соединения формулы I.

Изобретение относится к новому замещенному фталоцианину, который может найти применение в качестве красителя, катализатора различных окислительно-восстановительных процессов.

Изобретение относится к фталоцианинам формулы (I), применяемым в качестве средств для маркировки жидкостей, например минеральных масел. .

Изобретение относится к ингибиторам тирозинкиназ типа бис-индолилсодержащих соединений формулы I где Z означает группу общей формулы II где A, B, X, Z, R1-R10 имеют значения, указанные в формуле изобретения, а также к способу их получения и лекарственному средству на основе этих соединений.

Изобретение относится к области медицины и органической химии и касается терапевтического средства против гепатита С, содержащего соединения формулы I, фармкомпозиции, содержащей указанные соединения, и ингибитора полимеразы вируса гепатита С.

Изобретение относится к медицине и касается противовирусного средства для наружного применения, обладающего противогерпетической активностью, ранозаживляющим и противовирусным действием.

Изобретение относится к области способов лечения заболеваний, вызванных вирусом гепатита B (называемым также HBV и вирусом Эпштейна-Барра (называемым также EBV, которые включают введение эффективного количества одного или более из активных соединений, раскрытых здесь, или их формацевтически приемлемых производных или пролекарств одного из этих соединений.

Изобретение относится к медицине. .

Изобретение относится к биологически совместимым переносчикам кислорода для введения пациентам в качестве добавки или частичного замещения цельной крови. .

Изобретение относится к медицине и касается заменителя эритроцитов, а также способа его получения. .

Изобретение относится к медицине, а именно к производству кровезамещающих препаратов. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу хроматографического выделения гемоглобина. .

Изобретение относится к получению полигемоглобина, который может представить основу кровезамещающих растворов с функцией переноса кислорода. .

Изобретение относится к производству лечебно-профилактических препаратов при заболеваниях, связанных с кроветворением, может быть использовано в пищевой промышленности, медицине и ветеринарии.

Изобретение относится к технологии выделения биологически активных соединений, а именно к выделению гемоглобина из крови сельскохозяйственных животных. .
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2003-07-10 2013-03-23T07:11:30
Наверх