Пробный носитель и способ быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции (варианты)

Изобретение относится к области исследования материалов путем определения их физических или химических свойств с помощью оптических средств и к системам, в которых материал возбуждают оптическими средствами, и он люминесцирует. Предложен пробный носитель в виде центрифужной пробки. Носитель разделен на верхнюю и нижнюю полости перегородкой. Объем нижней полости равен 0,1 от объема пробирки. В перегородке непосредственно у стенки выполнено отверстие. Конструктивное выполнение перегородки позволяет вытекать пробе из нижней полости с минимально необходимым преодолеванием сочетания сил смачивания и поверхностного натяжения. Предложены также способы-варианты быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции. Способы предусматривают использование флуоресцентной или фосфоресцентной измерительной установки и вышеуказанного пробного носителя. Способы позволяют повысить скорость и точность определения, использовать серийные измерительные установки и проводить измерение концентрации в субстрате частиц иного удельного веса, чем жидкость в субстрате. Изобретение может быть использовано в пищевой и биотехнологической промышленности для определения абсолютной концентрации бактерий в различных субстратах. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к химии, биохимии, биологии, промышленным биотехнологиям, способам измерения, использующим микроорганизмы, их количественным определениям, а именно к измерению абсолютной концентрации бактерий фотолюминесцентными измерительными установками.

В описании имеются только основные сведения, необходимые для с его понимания, остальные сведения, известные из уровня техники, в том числе из аналогов, а также непосредственно логично следующие из них и этого описания ниже изобретательского уровня, имеются ввиду, предполагаются известными и потому не обязательно имеются в описании.

Известен способ быстрого измерения относительной концентрации бактерий и продуктов их жизнедеятельности по их фотофлуоресценции, при котором используют лазерно-флуоресцентную измерительную установку "ЛЭСА-6" (далее кратко: "установка") в качестве концентратомера, освещают участок зуба лазерным пучком В, возбуждающим флуоресценцию Ф этого участка, высвечивают на экране компьютера график спектрального распределения интенсивности с кривой спектрального распределения интенсивностей частей этих потоков, попавших в установку (далее кратко: "кривая"), содержащая пик В_п, отображающий часть рассеянного участком пучка В, попавшую в установку, и горб Ф_г, отображающий часть флуоресценции Ф, попавшую в установку. Определяют значения интенсивностей В_п и Ф_г, измеряя площади под пиком В_п и горбом Ф_г в произвольных единицах, и рассчитывают измеренный коэффициент возбуждения флуоресценции (короче: "измеренный коэффициент флуоресценции") К_фи по формуле (1); т.е. косвенным измерением

Проделывают то же, освещая пучком В другие участки зуба; принимают наименьшее значение из всех измеренных значений К_фи за произвольную единицу относительной концентрации флуоресцента С_о, т.е. обозначают ее как К_фим, постоянную при упомянутых измерениях, а участок, с которого получен К_фим, - за отсчетный и рассчитывают, т.е. получают методом косвенного измерения значение относительной концентрации С_о флуоресцента на любом участке по формуле

Значение С_о правильно только при неизменных условиях измерения /1/.

Объяснение способа-аналога, поскольку он относится к передовой технологии измерений на основе оптоволоконной лазерно-люминесцентной техники, которая, как всякая передовая технология, еще мало известна, в том числе в тех областях, где она может успешно использоваться. В описании способа-аналога использованы новые и известные многозначные термины с их определениями, разработанными для данного изобретения:

"Бактерии" - микроорганизмы от одного вида до совокупности совершенно различных видов.

"Лазерно-люминесцентная измерительная установка" (краткий термин: "установка") - измерительное устройство, предназначенное для измерения отношения введенных в нее интенсивностей потока люминесценции измеряемого вещества (люминесцента) к отраженному люминесцентом потоку лазерного пучка, возбудившего люминесценцию. Установка содержит лазер, спектрометр, оптически соединенный с лазером через люминесцент, и компьютер, на экране которого отображается график спектрального распределения интенсивностей потоков, попавших в установку, с их спектральной кривой. Установка может быть настроена на отображение либо флуоресценции, как в способе-аналоге, тогда она называется "флуоресцентная установка" либо фосфоресценции, тогда она называется ″фосфоресцентная установка".

"Пик" В_п - левый остроконечный участок спектральной кривой, отображающий интенсивность части отраженного лазерного пучка, вошедшей в оптоволокна входных жгутов световода перпендикулярно их торцам и осветившей светоэлектронные датчики спектрометра установки, сигнал которых образовали этот пик (в /1/ на фиг.1 - левая остроконечная кривая, в тексте - I_з, отраженный от зуба).

"Горб" - правый неостроконечный участок спектральной кривой, отображающий интенсивность части потока люминесценции (флуоресценции, фосфоресценции), вошедшей также в те же волокна и осветившей другие светоэлектронные датчики, сигналы которых образовали этот горб, обозначенный как Л_г, если рассматривается люминесценция, Ф_г для флуоресценции (как в способе-аналоге, где на фиг.1 - правый участок, а в тексте он обозначен как I_ф), Фос_г - для фосфоресцентной установки.

"Коэффициент возбуждения люминесценции" (краткая форма: "коэффициент люминесценции") - отношение мощности потока всей люминесценции к потоку отраженного люминесцентом лазерного пучка, возбудившего эту люминесценцию. Также образованы "коэффициент флуоресценции″ и "коэффициент фосфоресценции". Эти коэффициенты этой установкой измерить невозможно.

"Измеренный коэффициент возбуждения люминесценции" (краткая форма: "измеренный коэффициент люминесценции″) К_ли - отношение измеренной интенсивности части потока люминесценции в виде площади горба Л_г к измеренной интенсивности отраженного люминесцентом лазерного пучка, который (отраженный поток) отображен в виде пика В_п. Также определены измеренные коэффициенты флуоресценции К_фи в описании аналога (в /1/ он назван "показатель флуоресценции" J_и и J_п) и фосфоресценции К_фос.и.

"Люминесцент" - вещество, способное люминесцировать в области рабочих частот установки, т.е. это краткий термин для люминофора применительно к изобретению, соответственно: "флуоресцент" и "фосфоресцент".

В способе-аналоге лазерный пучок В возбуждает флуоресценцию, т.е. происходит преобразование одного вида лучистой энергии в другой вид лучистой энергии, такие преобразования принято определять коэффициентом преобразования, по тематике изобретения - это коэффициент возбуждения люминесценции при общем рассмотрении (К_л), т.е. отношение мощности люминесценции Л к мощности ее возбудившего лазерного пучка В, т.е. К_л=Л/В или в способе-аналоге К_ф=Ф/В, т.е. коэффициент флуоресценции равен отношению всего потока флуоресценции к лазерному пучку, который пропорционален абсолютной концентрации С_а флуоресцента в объеме, освещенном пучком В, если частицы не затеняют друг друга. Значения Ф и В установкой измерить невозможно. Но при измерении по /1/ измеряют интенсивность отраженного пучка В_п и флуоресценции Ф_г и по ф.(1) рассчитывают таким образом измеренный косвенным методом К_фи. Значения В_п и Ф_г измерены на графике спектрального распределения в виде площадей под пиком и горбом спектральной кривой в произвольных одинаковых единицах, их отношение дает значение К_фи, который пропорционален С_а, но измерить его тоже невозможно, ибо не известен коэффициент пропорциональности между ними. Для аналога он не нужен, ибо для осуществления способа диагностики достаточно измерять К_фи различных участков и по ф.(2) получать относительную концентрацию С_о различных участков в ходе лечения. Ось ординат графика спектрального распределения интенсивностей потоков служит для откладывания значений интенсивностей в узких участках спектра в произвольных относительных безразмерных единицах, например в долях от наибольшего значения на оси ординат, принятого за 100%, поэтому, если измеряющий изменяет цену деления, чтобы ни горб, ни пик не вышли за пределы экрана, а занимали удобное для отсчетов положение, то их высота изменяется, но их отношение остается неизменным для каждого участка зуба при неизменившейся концентрации флуоресцента, но изменяется пропорционально концентрации при ее изменении. Более того, изменение В изменяет В_п и Ф_г, но не изменяет С_о, ибо В_п и Ф_г изменяются пропорционально В, поэтому при неизменной (но неизвестной) С_а участков значение С_о не изменяется. Способ-аналог дает правильные данные во время осмотра, что существенно повышает качество диагностики, т.е. он соответствует его назначению.

Недостаток способа-аналога: не предназначен для измерения абсолютной концентрации бактерий.

В качестве способа-прототипа принят способ быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции, при котором используют лазерно-люминесцентную измерительную установку в качестве концентратомера, пробу биосубстрата помещают в пробный носитель, одинаковый с тем, который использовали при градуировании установки, освещают пробу возбуждающим люминесценцию лазерным пучком, высвечивают на компьютере график спектрального распределения интенсивности, содержащий пик В_п, отображающий часть рассеянного пробой и пробным носителем возбуждающего пучка, попавшую в установку, и горб Л_г, отображающий часть люминесценции, попавшую в установку, рассчитывают измеренный коэффициент люминесценции по формуле К_ли=Л_г/В_п, его значение откладывают на оси абсцисс ранее выполненного градуировочного графика этой установки как концентратомера и на оси ординат отсчитывают абсолютную концентрацию бактерий с загрязнителями-люминесцентами в биосубстрате /2/.

Термины и их значения, использованные для способа-прототипа: "Биосубстрат" (краткий термин: "субстрат") - обобщающее название исследуемого органического вещества животного, растительного и биотехнологического происхождения.

"Пробный носитель" (кратко: "носитель") - обобщающее название сосудов, предназначенных для помещения в них пробы биосубстрата, подлежащего измерению.

"Проба биосубстрата" (краткий термин: "проба") - часть биосубстрата, помещенная в пробный носитель.

Описание способа-прототипа. Прототип описан кратко, ибо действия по прототипу основаны на флуоресценции и установке, описанной в аналоге, во многом совпадают с ним и повторяются при осуществлении способа-прототипа, поэтому для сокращения текста в описании не повторяются, как и градуирование установки, основанное на стандартизованных методах, основное внимание уделено причинам возникновение недостатков способа-прототипа. Биосубстракт (далее: субстрат) наливают в пробный носитель в виде известной биологической пробирки вида ПБ по /3/ с выпуклым дном, где субстрат называют пробой. Пробирку левой рукой опирают на стол, а правой рукой упирают плоский торец световода в цилиндрическую поверхность пробирки, освещая пробу возбуждающим флуоресценцию лазерным пучком, при этом пробирка непрерывно покачивается из-за того, что она оперта ее выпуклым дном, практически в точке, а не опорной плоскостью, и конец световода тоже покачивается из-за того, плоский торец уперт в образующую линию цилиндрической поверхности. Это изменяет интенсивность отраженного пробой и носителем потока и потока флуоресценции, попавших в установку, следовательно, изменяет формы пика В_п и горба Ф_г, что вызывает погрешности в измерениях их значений и значений К_фи. В субстрате всегда есть загрязнители-люминесценты, в том числе продукты жизнедеятельности бактерий, которые вносят погрешности, поэтому на практике всегда измеряют концентрацию бактерий с загрязнителями. Способ-прототип соответствует его назначению, дает действительные значения концентрации бактерий, но с погрешностями; по быстроте он на 4 порядка превосходит микробиологические способы, обеспечивая врача данными в ходе лечения без задержки для диагностики, ибо уменьшение даже общей концентрации в сочетании с изменением формы горбов с другими признаками позволяет врачу принимать обоснованные решения в ходе лечения немедленно, в данном примере - о правильности лечения.

Недостатки способа-прототипа:

1. Погрешности из-за покачивания торца световода относительно пробирки, увеличенные покачиваниями самой пробирки.

2. Погрешность из-за загрязнителей-флуоресцентов.

3. Не предусмотрено измерение концентрации бактерий по их фосфоресценции.

В качестве прототипа пробного носителя как части установки принят пробный носитель в виде центрифужной пробирки, прозрачной и не люминесцирующей в области рабочих частот лазерно-люминесцентной измерительной установки /4/.

Центрифужная пробирка содержит конусную часть для беззазорного скрепления с таким же гнездом держателя пробирки в центрифуге для предотвращения разрушения пробирки из-за ударных нагрузок при резком увеличении углового ускорения ротора центрифуги во время ее включения. Размеры центрифужной пробирки даны в /3/, где она названа "исполнение ПИК".

Недостатки центрифужной пробирки:

1. Отсутствие плоской поверхности для неподвижного упирания конца световода в пробирку для предотвращения покачиваний относительно пробирки, вызывающих погрешность при измерении.

2. Низкая производительность труда при осуществлении способа из-за медленного сливания из пробирки после центрифугирования объема с легкими загрязнителями-люминесцентами для предотвращения сливания части отмытого субстрата.

Техническим результатом изобретения пробирки является устранение указанных недостатков, т.е. отсутствие плоской поверхности для неподвижного упирания торца световода и низкая производительность труда.

Указанный технический результат достигается тем, что в пробном носителе в виде центрифужной пробирки, прозрачной и не люминесцирующей в области рабочих частот лазерно-люминесцентной измерительной остановки, согласно изобретению пробирка разделена на нижнюю и верхнюю полости поперечной перегородкой, причем объем нижней полости равен преимущественно 0,1 от номинального объема пробирки, часть наружной поверхности пробирки по ее образующей выполнена плоской, в перегородке непосредственно у стенки выполнено отверстие с возможностью вытекания пробы из нижний полости с минимально необходимым преодолеванием сочетания сил смачивания и поверхностного натяжения, верхняя поверхность перегородки выполнена с возможностью скатывания бактерий, а нижняя - с возможностью всплытия легких загрязнителей-люминесцентов к отверстию при центрифугировании согласно чертежу.

На чертеже изображен заявленный пробный носитель в виде пробирки. Названия частей пробирки (далее "пробирка" означает только заявленную пробирку, а все другие для отличения от нее имеют определения, например: "известная пробирка"), известные из уровня техники, понятные по описанию и рисунку, не обязательно обозначаются позициями, они даже могут отсутствовать на чертеже. Пробирка, прозрачная и не люминесцирующая в области рабочих частот установки, устойчивая к субстрату, разделена на нижнюю 1 и верхнюю 2 полости поперечной перегородкой 3, причем объем полости 1 равен преимущественно 0,1 от номинального объема пробирки, часть наружной поверхности пробирки по ее образующей выполнена плоской в виде, например, лыски 4, в перегородке 3 непосредственно у стенки выполнено отверстие 5 с возможностью протекания пробы с минимально необходимым преодолеванием сочетания сил смачивания и поверхностного натяжения, верхняя поверхность перегородки 3 выполнена с возможностью скатывания бактерий, а нижняя поверхность - с возможностью всплытия легких загрязнителей-люминесцентов к отверстию 5 при центрифугировании. Для этого перегородка выполнена точно поперечной, ее толщина уменьшается к отверстию 5, т.е. ее верхняя поверхность имеет вид, например, боковой поверхности перевернутого непрямого усеченного конуса, меньшую основу которого образует отверстие 5, расположенное ниже большей основы конуса, а нижняя поверхность перегородки 3 имеет такую же форму конуса, но с большей основой внизу. Номинальный объем пробирки по уровню отмечен пояском 6 в верху стенки пробирки, край пробирки над отверстием 5 переходит в сливной носик, чтобы жидкость не оставалась на наружной поверхности пробирки при ее сливании; отверстие 5 должно иметь проходное сечение приблизительно от 1 мм² до 0,1 от внутреннего поперечного сечения пробирки, обоснование этого условия и другие пояснения упомянутых признаков даны в "Описании способа", ибо они понятны при описании действий по этому способу. Место пояска 6 можно определить так: в мерный сосуд наливают в воду более объема полости 1, измеряют его, из сосуда наполняют полость 1, измеряют остаток в сосуде, разность между двумя измеренными значениями - объем полости 1, его принимают за 0,1 от номинального объема V_н пробирки, добавляя в нее по 0,1V_н воды, делают на ней риски 0,2; 0,3…0,9 и поясок при 1,0. Изготавливают затычку для отверстия 5 в виде тонкого стержня или трубки с закрытым концом несколько больше отверстия 5, но в виде конуса, длина затычки несколько больше длины пробирки.

Техническим результатом изобретения способа по 1-му варианту, т.е измерению по флуоресценции, является повышение точности благодаря постоянному положению конца световода во время освещения пробы и благодаря уменьшению количества загрязнителей-люминесцентов в ней, а по 2-му варианту, т.е. измерению по фосфоресценции, кроме того, возможность измерения концентрации бактерий благодаря высвечиванию спектральной кривой фосфоресценции.

Для достижения указанного результата в 1-м варианте способа быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате: по их фотолюминесценции, при котором используют лазерно-люминесцентную измерительную установку в качестве концентратомера, пробу биосубстрата помещают в пробный носитель, одинаковый с тем, который использовали при градуировании установки, освещают пробу возбуждающим люминесценцию лазерным пучком, высвечивают на компьютере график спектрального распределения интенсивности, содержащий пик В_п, отображающий часть рассеянного пробой и пробным носителем возбуждающего пучка, попавшую в установку, и горб Л_г, отображающий часть люминесценции, попавшую в установку, рассчитывают измеренный коэффициент люминесценции по формуле К_ли=Л_г/В_п, его значение откладывают на оси абсцисс ранее выполненного градуировочного графика этой установки как концентратомера и на оси ординат отсчитывают абсолютную концентрацию бактерий с загрязнителями-люминесцентами в биосубстрате, согласно изобретению по 1-му варианту в качестве концентратомера используют флуоресцентную измерительную установку, пробу помещают в пробный носитель по п.1, при этом пробу отмывают от загрязнителей без изменения концентрации бактерий путем разведения пробы физиологическим раствором с последующей гомогенизацией, центрифугированием и измерением абсолютной концентрации бактерий с загрязнителями путем ее освещения возбуждающим флуоресценцию пучком, рассчитывают измеренный коэффициент флуоресценции по формуле К_фи=Ф_г/В_п, по градуировочному графику этой установки отсчитывают концентрацию бактерий с загрязнителями, повторяют упомянутые действия от отмывания до рассчитывания концентрации, заканчивают измерение при достижении заданной точности или заданной разности концентраций двух последовательных измерений, последнюю из них принимают за измеренное значение абсолютной концентрации бактерий; кроме того, при неизменных возбуждающем пучке В_п и цене деления на оси ординат графика спектрального распределения интенсивности измеряют интенсивность горба флуоресценции Ф_г, откладывают его значение на оси абсцисс градуировочного графика, выполненного как зависимость концентрации бактерий от интенсивности горба Ф_г, и отсчитывают значение концентрации на оси.

Для достижения указанного результата во 2-м варианте способа быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции, при котором используют лазерно-люминесцентную измерительную установку в качестве концентратомера, пробу биосубстрата помещают в пробный носитель, одинаковый с тем, который использовали при градуировании установки, освещают пробу возбуждающим люминесценцию лазерным пучком, высвечивают на компьютере график спектрального распределения интенсивности, содержащий пик В_п, отображающий часть рассеянного пробой и пробным носителем возбуждающего пучка, попавшую в установку, и горб Л_г, отображающий часть люминесценции, попавшую в установку, рассчитывают измеренный коэффициент люминесценции по формуле К_ли=Л_г/В_п, его значение откладывают на оси абсцисс ранее выполненного градуировочного графика этой установки как концентратомера и на оси ординат отсчитывают абсолютную концентрацию бактерий с загрязнителями-люминесцентами в биосубстрате, согласно изобретению по 2-му варианту в качестве концентратомера используют фосфоресцентную измерительную установку, до градуирования установки выполняют переходный график зависимости интенсивности горба Фос_гз от времени запаздывания с момента отображения пика В_п, содержащий кривые таких зависимостей для образцовых проб с известными абсолютными концентрациями бактерий, пробу помещают в пробный носитель по п.1, при этом пробу отмывают от загрязнителей без изменения концентрации бактерий путем разведения пробы физиологическим раствором с последующей гомогенизацией, центрифугированием, измеряют интенсивность горба Фос_гз, по переходному графику отсчитывают начальное значение горба Фос_гн, рассчитывают измеренный коэффициент фосфоресценции по формуле К_фос.и=Фос_гн/В_п, по его значению на градуировочном графике этой установки отсчитывают концентрацию бактерий с загрязнителями, повторяют упомянутые действия от отмывания до отсчитывания концентрации, заканчивают измерение при достижении заданной точности или заданной разности концентраций двух последовательных измерений, последнюю из них принимают за измеренное значение абсолютной концентрации бактерий; кроме того, при неизменных возбуждающем пучке В_п и цене деления на оси ординат графика спектрального распределения интенсивности измеряют интенсивность горба Фос_го с одинаковым запаздыванием, на градуировочном графике, выполненном в виде зависимости концентрации бактерий от интенсивности Фос_го, откладывают значение Фос_го и отсчитывают значение концентрации на оси ординат.

Описание способа по двум вариантам. Действия, известные из уровня техники, понятные из описания и чертежа, в том числе подготовительные, настроечные, заключительные и прочие, не упоминаются, но их выполнение подразумевается, например, на установке ЛЭСА-6 для наглядности, см. аналог способа /1/.

Описание способа по 1-му варианту (по флуоресценции). Градуирование установки. Полость 1 пробного носителя заполняют достаточно текучей простой суспензией с наибольшей известной из практики абсолютной концентрацией бактерий измеряемого вида без загрязнителей-люминесцентов (далее кратко "загрязнители″), т.е. образцовой пробой. "Простая суспензия" - это суспензия, содержащая только измеряемые бактерии в прозрачной нелюминесцирующей жидкости, например в физрастворе. "Бактерии" - это живые бактерии, мертвые бактерии - это загрязняющие частицы. Включают установку, упирают конец световода в лыску 4 на полости 1, сопрягая торец световода всей плоскостью с плоскостью лыски 4, что обеспечивает одинаковость условий измерения при последующих измерениях, если конец световода уперт также, измеряют пик В_п и горб Ф_г, как описано в "Описании способа-прототипа″, вычисляют измеренный коэффициент флуоресценции К_фи, наносят его значение на ось абсцисс бланка градуировочного графика, на оси ординат отмечают значение известной концентрации бактерий в пробе и по этим координатам ставят точку на графике, которая соответствует значению наибольшей концентрации бактерий, как было упомянуто. Готовят 1-ю разведенную суспензию: заполняют полость 2 до пояска 6 свежим физраствором, сливают все из пробирки в обычную пробирку, встряхивают ее, гомогенизируя содержимое, получается суспензия с концентрацией в 0,1 от наибольшей, заполняют ею полость 1, измеряют пик, горб и К_фи и старят 2-ю точку на градировочном графике, которая соответствует значению в 10 раз меньшей концентрации бактерий. Оставшуюся в обычной пробирке 1-ю разведенную суспензию сливают в сосуд для обезвреживания. Повторяют разведения и ставят точки на градуировочном графике до требуемой наименьшей концентрации или до нижней границы области измерения этой установки в качестве концентратомера, но не меньше трех, ибо между 2-х точек можно провести любую кривую, а между 1-й и 3-й через 2-ю - только определенную линию при плавном уменьшении измеряемой величины. Соединяют точки плавной линией, при правильных измерениях получается прямая (фиг.2 в /2/), градуировочный график готов, причем за короткое время, ибо не требовалось измерений объемов с помощью мерных сосудов, а только используя полость 1 и поясок 6, это повысило производительность труда и точность градуировочного графика, ибо бактерии не успели заметно размножиться. Разведение можно выполнять не в 10 раз, а в другой кратности, используя упомянутые риски на полости 2. Этот график можно использовать неограниченное время, пока сохраняются оптические свойства данного вида бактерий и данного концентратомера.

Измерение. Основной пример, ибо простой и потому наглядный. Жидким прозрачным субстратом, например слюной, содержащий бактерии того вида, для которых был построен градуировочный график, заполняют полость, измеряют В_п, Ф_г, К_фи, как описано в "Градуировании установки" до 1-го разведения, откладывают К_фи на оси абсцисс градуировочного графика и по градуировочной линии определяют концентрацию бактерий с загрязнителями, т.е. выполняют действия по прототипу, поэтому получают значение концентрации с большой погрешностью из-за загрязнителей в слюне.

Для уменьшения погрешности начинают отмывание бактерий от загрязнителей в пробе с приготовления 1-й отмытой суспензии: как при градуировании заполняют полость 2, разводят, гомогенизируют, возвращают все в пробирку, центрифугируют, при этом бактерии центробежными силами прижимаются к перегородке 3 и скатываются по ее наклонной поверхности как камни по склону холма к отверстию 5 и проваливаются в полость 1, а легкие загрязнители всплывают к перегородке и по ее нижней наклонной поверхности вплывают в полость 2. В полости 1 возник 1-й отмытый субстрат с прежней концентрацией бактерий (средней, ибо в полости 1 возник и градиент концентрации по ее оси, ведь бактерии прижимаются к дну полости 1), а концентрация загрязнителей ранее была уменьшена благодаря разведению в 10 раз. Возникшая разность концентраций между бактериями в полости 1 и загрязнителями в полости 2 приводит к уменьшению погрешности при последующих измерениях, для чего быстро наклоняют пробирку в сторону образующей, близкой к отверстию 5, можно даже ниже горизонтальной плоскости на короткое время, выплескивая раствор из полости 2, но не снижая уровень в полости 2 до отверстия 5, при этом положении суспензия из полости 1 не может выливаться в полость 2, этому препятствует атмосферное давление, которое противодействует появлению разрежение в полости 1. Когда почти весь раствор из полости 2 будет слит, его уровень опустится ниже отверстия 5, пузырек воздуха пробулькнет в полость 1, только тогда равная по объему капля вытечет в полость 2. Однако для этого воздух должен преодолеть силы поверхностного натяжения и смачивания в отверстии 5. Значения этих сил зависят от свойств поверхности материала пробирки, отложений в ней, свойств субстрата, формы отверстия 5, в том числе его площади, поэтому скоростью выливания из полости 1 можно управлять, исходя из противоречивых требований: для повышения производительности труда и повышения точности, чтобы не влияло размножение бактерий, скорость должна быть большой, а для четкого разделения выливающегося ручейка из отверстия 5 от остатков сливаемого раствора из полости 2 на стенке, скорость должна быть небольшой. Однако точной границы между значениями скоростей не требуется, поэтому можно принять приблизительно такие проходные сечения отверстия 5: менее 0,1 от сечения полости 2 и более 1 мм². При таких условиях сливание из полости 2 заканчивают так: при опускании уровня раствора до отверстия 5 опускают сливной носик несколько ниже горизонтальной плоскости, раствор беспрепятственно сливается, затем начинается пробулькивание воздуха в полость 1 и на стенке полости 2 появляется тонкий ручеек суспензии, когда он дойдет до носика, пробирку резко ставят вертикально. Заполняют полость 2 физраствором до пояска 6, выливают все в обычную пробирку, гомогенизируют, возвращают все в пробирку, центрифугируют, в полости 1 возникла 1-я отмытая суспензия, ее тоже гомогенизируют и опять в полости 1 измеряют В_п, горб Ф_г, К_фи; Ф_г и К_фи уменьшились благодаря уменьшению загрязнителей, по градуировочному графику определяют концентрацию бактерий с загрязнителями, которая тоже уменьшилась, т.е. приблизилась к концентрации бактерий. Готовят 2-ю отмытую суспензию, т.е. разводят, гомогенизируют, центрифугируют и далее повторяют описанные действия и получают еще более близкую к концентрации бактерий концентрацию 2-й отмытой суспензии. Повторяют отмывания и измерения до достижения заданной точности, а если это невозможно, до заданной разности концентраций 2-х последовательных измерений, последнюю из них принимают за измеренное значение абсолютной концентрации бактерий. Для ускорения разделения субстрата и раствора при отмываниях перед приготовлением следующей отмытой суспензии отверстие 5 затыкают упомянутой затычкой, раствор выплескивают, затычку вынимают, в этом случае отверстие 5 может быть больше, но есть опасность загрязнения из-за затычки. Разведение может быть меньше 10-кратного, если заполнять полость физраствором по рискам на полости 2. Отношение высоты конусной части к высоте пробирки равно 0,25…0,36 по /3/, поэтому для приготовления 10-кратного разведения перегородка 3 должна быть около середины конусной части по высоте. Перегородка увеличивает центробежную силу, действующую на нижнюю часть пробирки, но это не увеличивает вероятность разрушения пробирки, ибо перегородка 3 находится внутри посадочного конуса держателя центрифуги и приближает к нему центр масс пробирки, но сводит его с оси пробирки, поэтому необходимо предотвратить возможное нарушение уравновешенности ротора при закреплении пробирки, для этого перегородка 3 не должна быть, например, слишком толстой, а разница в толщине от отверстия 5 к стенке - слишком большой. Перегородка 3 затрудняет изготовление пробирки, но подобные пробирки известны: например, в фонде ЕПВ №0539141 (без отверстия) и 0021065 (с отверстием), а в фонде СССР - №1250302; это упрощает мытье и обеззараживание полости 1 (все в рубрике В 01 L 3/4).

Более сложный случай: субстрат нежидкий и непрозрачный. Пробу взвешивают, разведением отмеренным количеством, например, физраствора уменьшают концентрацию суспензии в известное число крат до достаточной текучести и прозрачности, далее выполняют описанные действия, но измеренную концентрацию умножают на упомянутое число крат.

Бактерии непрерывно размножаются и загрязняют физраствор, а также умирают, поэтому измерения следует выполнять возможно быстрее, при перерывах суспензию следует охлаждать до температуры прекращения активного размножения бактерий, обычно до +10°С.

Отличия способа по п.3 формулы. Градуирование и измерения выполняют при неизменном возбуждающем пучке и неизменной произвольной цене деления на оси ординат градуировочного графика, для этого перед освещением пробы при градуировании и измерении концентрации интенсивность возбуждающего пучка измеряют измерителем мощности и настраивают на заданную мощность, если она изменилась, а установку настраивают на такую цену деления на оси ординат спектрального графика, которая позволяет выполнять все измерения при градуировании и измерении концентрации без изменения настройки при высотах пика и горбов, не выходящих за границу неискаженного отображения цены деления. При таких условиях Ф_г пропорционален абсолютной концентрации, поэтому на градуировочном графике на оси абсцисс откладывают Ф_г и при измерении концентрации измеренное значение горба Ф_ги наносят на эту ось и отсчитывают С_а.

Описание способа по 2-у варианту, т.е. по фосфоресценции. Действия по разведению и отмыванию практически не отличаются от таковых по первому варианту, поэтому они здесь не упоминаются. Отличия действий в том, что измеряют бактерии-фосфоресценты и загрязнители-фосфоресценты, фосфоресценция которых падает со временем экспоненциально, поэтому нужно измерить такое значение горба фосфоресценции (Фос_г), которое неизменно, при неизменной концентрации фосфоресцента. Если Фос_г падает практически до ноля при каждом разведении, то достаточно формально преобразовать ф.1 применительно к величинам при фосфоресценции

где К_фос.и - измеренный коэффициент фосфоресценции, Фос_г - интенсивность фосфоресценции, В_п - интенсивность отраженного лазерного пучка, и осуществлять способ. Но при более продолжительной фосфоресценции при измерениях Фос_г как по первому варианту при каждом последующем измерении Фос_г в его значении оказывается погрешность из-за того, что к только что возникшей фосфоресценции добавился остаток фосфоресценции от предыдущих возбуждений фосфоресценции. Для устранения (значительного уменьшения) этой погрешности строят переходный график, т.е. зависимость Фос_г от времени, для того чтобы перейти к начальному неизменному значению горба при данной концентрации бактерий и загрязнителей. Переходный график строят так: освещают пробу лазерным пучком, одновременно включают отсчет времени на экране компьютера, вершина горба вышла за экран, через некоторое время опять высвечивают горб (без освещения пробы!), вводят его и время запаздывания с момента освещения в память компьютера, горб уместился на спектральном графике, т.е. получилось значение горба при 1-м запаздывании (Фос_гз1) и засечено время запаздывания (З₁), повторяют эту операцию не менее 3-х раз. На бланке переходного графика на оси абсцисс отмечают соответствующие отсчеты запаздывания З₁, З₂, …, над ними ставят точки, соответствующие Фос_гз1, Фос_гз2, …, проводят по ним плавную кривую, начиная с последней, экстраполируют кривую до пересечения с осью ординат, точка их пересечения - измеренное значение начальной фосфоресценции (Фос_гн), которое неизменно при данной концентрации фосфоресцентов, например концентрация бактерий в неразведенной образцовой пробе. Разводят эту пробу и опять измеряют Фос_гз без освещения пробы, строят кривую для разведенной пробы, измеряют ее Фос_гн и строят градуировочную линию на градуировочном графике как зависимости концентрации бактерий от К_фос.ин, рассчитанного по формуле

где К_фос.ин - коэффициент фосфоресценции, рассчитанный по начальному значению интенсивности фосфоресценции. Если во время разбавлении Фос_гз приближается к нулю, то при очередном измерении горба пробу освещают пучком и начинают новый отсчет запаздываний. При измерении концентрации субстрата делают то же самое при отмывании и, как при 1-м варианте, принимают, например, последнее значение из двух последовательных близких значении за измеренную концентрацию бактерий в субстрате.

Измерение по п.5. Отличия от предыдущего таковы: предыдущими исследованиями установили, что Фос_г загрязнителей велик, но спадает значительно быстрее, чем Фос_г бактерий, например через 10 мин его можно приравнять к нулю, а Фос_г бактерий еще измерим. При таких условиях действуют так: принимают время запаздывания, например, в 5 мин за общее время запаздывания, составляют переходный график, при измерении Фос_гз, кривые графика доводят до ординаты запаздывания в 5 мин и отсчитывают Фос_го, т.е. фосфоресценцию при общем запаздывании. Таким образом, при неизменном В_п ордината при общем времени запаздывания выполняет роль оси ординат переходного графика, а Фос_го - роль Фос_гн; по известным концентрациям бактерий в образцовых пробах и Фос_го строят градуировочный график с учетом неизменности цены деления оси ординат переходного графика. Для переходного графика можно приготовить отдельно образцовые пробы и каждую из них осветить один раз для повышения точности градуировочного графика. Измерения проб субстрата выполняют тоже с общим запаздыванием, точнее с приведением измеренных Фос_гз к Фос_го. Если при измерении концентрации фосфоресценция загрязнителей станет близкой к нулю, то отмывать далее не надо, значение Фос_гз или Фос_го откладывают на соответствующем градуировочном графике, отсчитывают концентрацию только бактерий в субстрате при соответствующем разведении и приводят ее к концентрации до разведений.

Практическое доказательство уменьшения погрешностей при измерении по 1-му варианту. Измерение концентрации относится к косвенным измерениям, в основе которых - прямое измерение интенсивности люминесценции, например, с помощью лазерно-люминесцентной измерительной установки. Наибольшее доверие вызывают прямые измерения, поскольку они - наиболее объективны. Основной причиной уменьшения погрешностей при измерениях этим способом является отмывание проб, оно изменяет мощность люминесценции, которую измеряют прямым измерением, следовательно, сравнение значений измеренных интенсивностей флуоресценции после основных действий, т.е. отмывании проб, в ходе измерения концентрации - наиболее убедительно, а представление в виде таблицы 1 - наиболее наглядно, поэтому непосредственно измеренные значения интенсивностей даны в таблице 1 на примере отмывания 4-х проб с различными совокупностями бактерий, где три пробы - субстраты с бактериями различных видов, выращенных на специальных известных питательных средах, а 4-я - гной с совокупностями бактерий.

Таблица 1

Сопоставительная таблица данных измерения интенсивностей флуоресценции в ходе отмывания проб

№	Интенсивность флуоресценции в произвольных относительных безразмерных единицах в ходе отмывания бактерий
	Ассоциация бактерий	1	2	3	4	5	6
1	С. acidovorans	588±6,5	750±4,l	499±7,9	153±7,9	424±3,8	59±5,0
2	Р. vulgaris	91±4,9	134±4,7	168±3,7	61±1,4	80±2,1	31±1,4
3	P.acnes	181±8,5	278±7,6	164±3,1	76±2,1	122±1,0	31±1,3
4	Гной	1200	2192	1632	512	800	211

Номер столбцов таблицы обозначает состояние вещества, в котором возбуждают флуоресценцию:

Ст.1. Ассоциация бактерий в виде пробы в полости 1.

Ст.2. Суспензия, т.е. разведенная и гомогенизированная проба в полости 2.

Ст.3. 1-я отмытая суспензия в полости 1.

Ст.4. Раствор, оставшийся после 1-го отмывания в полости 2.

Ст.5. 2-я отмытая суспензия в полости 1.

Ст.6. Раствор, оставшийся после 2-го отмывания в полости 2.

Данные таблицы свидетельствуют, что только после отмывания проб от экзогенных порфиринов и других загрязнителей можно более точно измерять интенсивность флуоресценции именно бактерий, ее значение уже после повторного отмывания снижается более чем на 30%, следовательно, приблизительно также повышается точность измерения абсолютной концентрации бактерий, поэтому точность измеренных им значений выше, чем в способе-прототипе.

Практическое доказательство уменьшения погрешностей при измерении по 2-му варианту, т.е. по фосфоресценции, при основной последовательности действий при отмывании. т.е. по п.4 формулы изобретения. Эти доказательства соответствуют доказательствам по 1-му варианту, т.е. по флуоресценции, при основной последовательности действий при отмывании тех же субстратов, но установка настроена на измерение бактерий-фосфоресцентов с загрязнителями-фосфоресцентами. Результаты измерений представлены в таблице 2.

Таблица 2

Сопоставительная таблица данных измерений интенсивности фосфоресценции в ходе отмывания проб

Номер субстрата	Интенсивность фосфоресценции в произвольных относительных единицах в ходе отмывания бактерий
	1	2	3	4	5	6
1	178±2,1	248±1,3	158±2,5	48±2,5	131±1,2	19±1,5
2	29±1,5	42±3,1	53±1,2	19±0,4	25±0,4	9±0,5
3	57±2,7	89±2,4	52±0,9	24±0,7	38±0,3	9±0,4
4	382	660	510	165	353	66

Номер столбца в таблице обозначает состояние субстрата в ходе отмывания, в котором возбуждают фосфоресценцию:

Ст. 1. Совокупность бактерий в виде пробы в полости 1.

Ст.2. Суспензия, т.е. разведенная и гомогенизированная проба в полости 2.

Ст.3. 1-я отмытая суспензия в полости 1.

Ст.4. Раствор, оставшийся после 1-го отмывания в полости 2.

Ст.5. 2-я отмытая суспензия в полости 1.

Ст.6. Раствор, оставшийся после отмывания в полости 2.

Данные таблицы 2 свидетельствуют, что после повторного отмывания можно более точно измерять интенсивность фосфоресценции бактерий, уже после повторного отмывания снижается более чем на 30%, следовательно, приблизительно также повышается точность способа по сравнению со способом-прототипом. Это доказывает нижеследующие преимущества предложенного способа измерения абсолютной концентрации бактерий в субстрате.

Преимущества предложенного способа:

1. Сочетание повышения быстродействии на 4 порядка, что позволяет вести более точную непрерывную диагностику в ходе лечения, с заметным повышением точности способа.

2. Возможность использования серийных фотофлуоресцентных и фотофосфоресцентных установок для измерения абсолютной концентрации бактерий в ходе лечения.

3. Возможность использования способа для измерения концентрации в субстрате частиц иного удельного веса, чем жидкость в субстрате.

Список ссылок

1. Александров М.Т. и др. “Способ диагностики твердых тканей зуба и его отложений”, пат. РФ №2112426, МКИ А 61 В 6/00, 1997/98 г.

2. Александров М.Т. и др. “Способ обнаружения и оценки концентрации анаэробных бактерий в биологическом субстрате”, патент РФ №2121143, МКИ G 01 N 33/48, 1997/98 г. (прототип способа).

3. Пробирки стеклянные, ГОСТ 10515-63.

4. Большая медицинская энциклопедия, т. 12, стр.273, табл., рис. 39 (прототип пробного носителя).

1. Пробный носитель в виде центрифужной пробирки, прозрачной и не люминесцирующей в области рабочих частот лазерно-люминесцентной измерительной установки, отличающийся тем, что пробирка разделена на нижнюю и верхнюю полости поперечной перегородкой, причем объем нижней полости равен преимущественно 0,1 номинального объема пробирки, часть наружной поверхности пробирки по ее образующей выполнена плоской, в перегородке непосредственно у стенки выполнено отверстие с возможностью вытекания пробы из нижней полости с минимально необходимым преодолеванием сочетания сил смачивания и поверхностного натяжения, верхняя поверхность перегородки выполнена с возможностью всплытия легких загрязнителей-люминесцентов к отверстию при центрифугировании согласно чертежу.

2. Способ быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции, при котором используют лазерно-люминесцентную измерительную установку в качестве концентратомера, пробу биосубстрата помещают в пробный носитель, одинаковый с тем, который использовали при градуировании установки, освещают пробу возбуждающим люминесценцию лазерным пучком, высвечивают на компьютере график спектрального распределения интенсивности, содержащий пик В_п, отображающий часть рассеянного пробой и пробным носителем возбуждающего пучка, попавшую в установку, и горб Л_г, отображающий часть люминесценции, попавшую в установку, рассчитывают измеренный коэффициент люминесценции по формуле К_ли=Л_г/В_п, его значение откладывают на оси абсцисс ранее выполненного градуировочного графика этой установки как концентратомера и на оси ординат отсчитывают абсолютную концентрацию бактерий с загрязнителями-люминесцентами в биосубстрате, отличающийся тем, что в качестве концентратомера используют флуоресцентную измерительную установку, пробу помещают в пробный носитель по п.1, при этом пробу отмывают от загрязнителей без изменения концентрации бактерий путем разведения пробы физиологическим раствором с последующей гомогенизацией, центрифугированием и измерением абсолютной концентрации бактерий с загрязнителями путем освещения пробы возбуждающим флуоресценцию пучком, рассчитывают измеренный коэффициент флуоресценции по формуле К_фи=Ф_г/В_п, по градуировочному графику этой установки отсчитывают концентрацию бактерий с загрязнителями, повторяют упомянутые действия от отмывания до рассчитывания концентрации, заканчивают измерение при достижении заданной точности или заданной разности концентраций двух последовательных измерений, последнюю из них принимают за измеренное значение абсолютной концентрации бактерий.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при неизменных возбуждающем пучке В_п и цене деления на оси ординат графика спектрального распределения интенсивности измеряют интенсивность горба флуоресценции Ф_г, откладывают его значение на оси абсцисс градуировочного графика, выполненного как зависимость концентрации бактерий от интенсивности горба Ф_г, и отсчитывают значение концентрации на оси ординат.

4. Способ быстрого измерения абсолютной концентрации бактерий в биосубстрате по их фотолюминесценции, при котором используют лазерно-люминесцентную измерительную установку в качестве концентратомера, пробу биосубстрата помещают в пробный носитель, одинаковый с тем, который использовали при градуировании установки, освещают пробу возбуждающим люминесценцию лазерным пучком, высвечивают на компьютере график спектрального распределения интенсивности, содержащий пик В_п, отображающий часть рассеянного пробой и пробным носителем возбуждающего пучка, попавшую в установку, и горб Л_г, отображающий часть люминесценции, попавшую в установку, рассчитывают измеренный коэффициент люминесценции по формуле К_ли=Л_г/В_п, его значение откладывают на оси абсцисс ранее выполненного градуировочного графика этой установки как концентратомера и на оси ординат отсчитывают абсолютную концентрацию бактерий с загрязнителями-люминесцентами в биосубстрате, отличающийся тем, что в качестве концентратомера используют фосфоресцентную измерительную установку, до градуирования установки выполняют переходный график зависимости интенсивности горба фосфоресценции от времени запаздывания Фос_гз с момента отображения пика В_п, содержащий кривые таких зависимостей для образцовых проб с известными абсолютными концентрациями бактерий, пробу помещают в пробный носитель по п.1, при этом пробу отмывают от загрязнителей без изменения концентрации бактерий путем разведения пробы физиологическим раствором с последующей гомогенизацией центрифугированием, измеряют интенсивность горба Фос_гз, по переходному графику отсчитывают начальное значение горба Фос_гн, рассчитывают измеренный коэффициент фосфоресценции по формуле К_фос.и=Фос_гн/В_п, по его значению на градуировочном графике этой установки отсчитывают концентрацию бактерий с загрязнителями, повторяют упомянутые действия от отмывания до отсчитывания концентрации, заканчивают измерение при достижении заданной точности или заданной разности концентраций двух последовательных измерений, последнюю из них принимают за измеренное значение абсолютной концентрации бактерий.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что при неизменных возбуждающем пучке В_п и цене деления на оси ординат графика спектрального распределения интенсивности измеряют интенсивность горба Фос_го с одинаковым запаздыванием, по градуировочному графику, выполненному в виде зависимости концентрации бактерий от интенсивности Фос_го, откладывают значение Фос_го и отсчитывают значение концентрации на оси ординат.