Конденсированные производные тиоколхицина и баккатина в качестве противоопухолевых агентов

Настоящее изобретение относится к производным N-деацетил-тиоколхицина и 10-деацетилбаккатина III формулы (I)

где R и n имеют значения, определенные в описании, которые являются ценными противоопухолевыми лекарственными средствами. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, на основе соединений формулы 1. Технический результат - получение новых производных 10-деацетилбаккатина 111, обладающих ценным фармацевтическим действием. 3 н. и 2 з.п. ф-лы.

 

Данное изобретение относится к производным N-деацетил-тиоколхицина и 10-дезацетилбаккатина III формулы (I)

где:

n представляет целое число от 0 до 8;

R представляет остаток формулы а), b), с), d) или е):

где

R₁ и R₂, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют водород или группу формулы:

n предпочтительно целое число от 1 до 7, более предпочтительно 1.

Колхицины и тиоколхицины являются известными препятствующими росту соединениями, способными дестабилизировать микроканалы благодаря взаимодействию с тубулином.

Колхицин в настоящее время применяют в терапии подагры и родственных воспалительных заболеваний, но его применение ограничено острыми фазами из-за его высокой желудочно-кишечной токсичности.

Изучено большое число производных колхицина или тиоколхицина с точки зрения их возможного использования в качестве противоопухолевых медикаментов, но попытки исследований до сих пор были безуспешными, вследствие очень ограниченных терапевтических показателей таких соединений.

Только одно производное колхицина, демеколцин, применяли в прошлом в клинике для лечения лейкемии, но со слабым успехом.

Антипролиферативная активность производных таксана (паклитаксела и его производных) также относится к способности необратимого связывания альфа и бета-форм тубулина в микроканалах. Оксетановая и фенильная группы в изосериновой боковой цепи, как подтверждено, необходимы в отношении активности: баккатин фактически, при отсутствии изосериновой цепи, по существу не обладает антипролиферативной активностью в противоположность паклитакселу и другим С₁₃-эфирам изосерина, которые могут образовывать связи с двумя различными сайтами микроканалов, предотвращая деполимеризацию и, следовательно, сдерживая активность митотических веретенообразных структур.

Неожиданно обнаружено, что соединения формулы (I) оказывают антипролиферативное действие несмотря на отсутствие сродства к тубулину как в совокупности микроканалов, так и в несовокупных факторах.

Активность соединений формулы (I) таким образом вызвана неожиданным механизмом действия, который не может быть очевидным из современных знаний в области антитубулиновых лекарств.

Соединения изобретения обладают сильной антимитотической активностью и характеризуются благопрятным терапевтическим показателем, что делает их подходящими при терапевтическом лечении различных форм опухолей, также как и дегенеративного ревматоидного артрита, заболевания, характеризующегося избыточной пролиферацией и аномальной миграцией лейкоцитов.

Соединения (I) имеют цитотоксичность, сравнимую с таковой наиболее эффективных противоопухолевых лекарственных средств, в то же время имея заметно более широкий спектр действия, в частности, против клеток, резистентных к известным лекарствам.

Соединения (I) получают реакцией N-деацетилтиоколхицина с реакционноспособными производными дикарбоновых кислот в сухих растворителях в таких условиях, которые применяют для получения продукта N-моноацилирования, который в последующем реагирует с производным баккатина III, возможно защищенным в положениях 7, 13 или 10, в зависимости от желаемого соединения, в присутствии подходящего конденсирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК). Для непосредственного получения соединений (I) любые необязательно присутствующие защитные группы удаляют и/или гидроксигруппы остатка баккатина III селективно ацилируют.

Если в соединении (I) R означает группу формулы с), благодаря реактивности гидроксигруппы в изосериновой цепи реакция может быть проведена без предварительной защиты других гидроксигрупп, присутствующих в таксановом соединении.

Примерами подходящих реакционноспособных производных дикарбоновых кислот являются ацилгалогениды, хлорангидриды кислот, реакционноспособные ангидриды или сложные эфиры.

Альтернативно, производное таксана может также быть ацилировано дикарбоновой кислотой и полученный продукт может быть сконденсирован с N-деацетилтиоколхицином.

Соединения изобретения применимы для лечения пролиферативных патологий, в частности опухолей различных органов, ревматоидного артрита или других дегенеративных патологий, где показаны антипролиферативное и противовоспалительное действия.

Для указанной цели соединения (I) вводят в форме фармацевтических композиций, пригодных для перорального, парентерального, подкожного или чрескожного введения. Дозы соединений (I) находятся в интервале от 1 до 100 мг/м² площади тела в зависимости от пути введения. Соединения предпочтительно вводят перорально.

Примерами композиций являются капсулы, таблетки, ампулы, кремы, растворы, грануляты.

Следующие примеры более детально иллюстрируют изобретение.

ПРИМЕР 1

a) 100 мг Деацетилтиоколхицина (0,268 ммоля, мол. вес 373 г/моль) растворяют в 5 мл сухого диоксана, затем объединяют с 27 мг янтарного ангидрида (0,268 ммоля, мол. вес 100 г/моль) и реакционную смесь нагревают до 60°С за 5 часов. Контроль ТСХ:

AcOEt/MeOH 4:1. Диоксан упаривают и продукт используют без очистки для следующей реакции. Получено 130 мг продукта.

b) 126 мг продукта со стадии а) (0,268 ммоля, мол. вес 473 г/моль)растворяют в 8 мл сухого толуола. Прибавляют 187 мг 7-триэтилсилил(Tes)-баккатина (0,268 ммоля, мол.вес 700 г/моль), 66 мг ДЦГК (0,321 ммоля. мол. вес 206 г/моль) и 13 мг ДМАП (диметиламинопиридина) (0,1 ммоля, мол. вес 122 г/моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре около 12 часов до исчезновения исходного продукта. Контроль ТСХ: АсОН/МеОН 4:1. Смесь фильтруют через целит и упаривают досуха. Сырой продукт очищают на колонке (силикагель), используя AcOEt/гексан 9:1 в качестве элюента и получая 120 мг защищенного продукта конденсации и 80 мг продукта, уже со снятой защитой в 7-положении.

с) 120 мг продукта со стадии b) (0,103 ммоля, мол. вес 1155 г/моль) растворяют в 5 мл МеОН/AcCl (5 мл метанола и 35 мкл AcCl). Реакция заканчивается за 15 минут. Смесь объединяют с бикарбонатом и экстрагируют AcOEt, получая 100 мг продукта формулы (I), где n равно 1 и R означает остаток формулы а).

ПРИМЕР 2

a)100 мг 10-О-сукцинил-7-триэтилсилил-баккатина III (мол. вес 699 г/моль, 0,14 ммоля) и 54 мг N-деацетилтиоколхицина (мол. вес 373 г/моль, 0,14 ммоля) растворяют в 5 мл сухого толуола, соединяют с 2 мл метиленхлорида, 31 мг ДЦГК (мол. вес 206 г/моль, 0,15 ммоля) и 8,5 мг ДМАП (мол. вес 122 г/моль, 0,07 ммоля) при комнатной температуре. Через один день реакционную массу фильтруют через целит, промывают толуолом и упаривают досуха. Очистка на флэш-колонне (силикагель, элюент СН₂Cl₂; МеОН=25:1) дает 70 мг продукта.

b) 200 мг продукта со стадии а) (0,213 ммоля) растворяют в 14 мл сухого толуола. Прибавляют 183 мг производного оксазолидина формулы:

обозначаемого в дальнейшем как SHA-9 (0,426 ммоля), 88 мг ДЦГК (0,426 ммоля) и 26 мг ДМАП (0,213 ммоля) и смесь перемешивают при комнатной температуре. Контроль ТСХ: СН₂Cl₂; МеОН=25:1. Через 4 часа реакционную смесь фильтруют через целит и очищают колоночной хроматографией, получая 240 мг продукта.

с) 160 мг продукта со стадии b) (0.12 ммоля, мол. вес 1338) растворяют в 3,2 мл раствора, полученного растворением 70 мкл AcCl в 10 мл МеОН. Через полчаса реакционную смесь соединяют с 5% NaHCO₃, экстрагируют СН₂Cl₂, сушат и растворитель упаривают. Очистка флэш-хроматографией дает 97мг соединения (I), где n равно 1 и R означает остаток формулы b).

ПРИМЕР 3

70 мг паклитаксела (0,038 ммоля, мол. вес 1824) растворяют в 5 мл сухого диоксана. Прибавляют ДЦГК (1,5 экв.), ДМАП (5% в молях) и продукт примера 1а. Смесь перемешивают при 110°С 2 ч, затем прибавляют еще 10 мг продукта примера 1а и 11 мг ДЦГК. После этого реакционную массу оставляют при комнатной температуре на 48 часов, затем нагревают при 110°С следующие 24 часа. Растворитель упаривают и остаток очищают флэш-хроматографией (AcOEt:МеОН=99:1), получая 21 мг соединения (I), где n равно 1 и R означает остаток формулы с).

ПРИМЕР 4

а) Раствор 7-сукцинил,10,13-ди-триэтилсилил-баккатина III (390 мг, 0,479 ммоля, мол. вес 814) в 10 мл ТГФ соединяют с раствором TBAF (тетрабутиламмоний фторида) (1М в ТГФ, 0,96 ммоля) при 0°С. Смесь оставляют на 1 ч 30 мин при 0°С, затем на 2 ч при комнатной температуре. После этого добавляют 1 экв. TBAF и реакцию продолжают до полного отщепления защитных групп. Реакционную смесь соединяют с водой и экстрагируют AcOEt; водную фазу подкисляют 1н. HCl и экстрагируют AcOEt, получая 350 мг продукта.

b) Соединение со стадии а) (0,479 ммоля) реагирует с TIO-NH₂ (0,479 ммоля), ДЦГК (1,5 экв.) и ДМАП (50% в молях) в толуоле-ТГФ 1 час. Реакционную смесь фильтруют через целит и очищают колоночной хроматографией (CH₂Cl₂:MeOH=25:1), получая соединение (I), где n равно 1 и R означает остаток формулы d).

ПРИМЕР 5

200 мг соединения примера 4 (0,206 ммоля) растворяют в 14 мл толуола-сухого ТГФ. Прибавляют 177 мг SHA-9 (2 экв.), 84 мг ДЦГК (2 экв.) и 26 мг ДМАП (0,206 ммоля), смесь перемешивают при комнатной температуре. Контроль ТСХ: CH₂Cl₂:MeOH=25:1. Через 4 часа реакционную смесь фильтруют через целит и очищают на хроматографической колонке. Полученный продукт растворяют в 4,8 мл раствора 70 мкл AcCl в 10 мл МеОН. Через полчаса реакционную массу объединяют с 5% NaHCO₃ и экстрагируют СН₂Cl₂. Экстракт сушат и растворитель упаривают. Остаток очищают флэш-хроматографией, получая 110 мг соединения (I), где n равно 1, R означает остаток формулы е), где R₁ и R₂ являются группами формулы

ХАРАКТЕРИСТИКИ СОЕДИНЕНИЙ

Соединение формулы (I), имеющее следующую структурную формулу

было полностью охарактеризовано обычными спектроскопическими методами. Его FAB - масс-спектр показал псевдомолекулярный ион при 1263,4952 Da, в значительном соответствии с молекулярной формулой C₆₇H₇₉N₂O₂₀S) ([М+Н]⁺; расчетн. 1263,4947).

¹H-ЯМР спектр был достаточно сложным, но, тем не менее, можно было легко различить сигналы двух структурных доменов молекулы и ограничивающего сукцинилового линкера. Диагностические сигналы оксиметинов баккатина были обнаружены при δ 6,50 (s) (ацилированный H-C(10)), 6,17 (ацилированный Н-С(13)) и 4,59 (Н-С(7)). Химический сдвиг Н-С(2') и Н-С(3') боковой цепи фенилизосерина (соответственно δ 4,65 и δ 5,27) был совершенно аналогичен величинам, наблюдавшимся у паклитаксела⁶). Все сигналы тиоколхициновой части можно было определить при сравнении с данными литературы [17], при мультиплете при δ 4,62 для Н-С(7"), ясно указывающем на замещение ацилом экзоциклического атома N. Наконец, присутствие сукцинилового линкера было подтверждено сложными мультиплетами в области между 2,78 и 2,46, показывая корреляцию HMQC с двумя метиленовыми атомами С при δ 30,0 и 30,3.

Соединение формулы (I), имеющее следующую структурную формулу

характеризовалось молекулярной формулой (HR-FAB-MS (C₇₁H₇₇N₂O₃₀S): m/z 1309,4805; расчетн. 1309,4790), но его ¹H-ЯМР спектр показал отчетливые сдвиги для сигналов Н-С(2'), смещался вниз по полю к δ 6,04 (d, J = 10,2) от типичной области δ 4,65-4,70, и Н-С(7) сдвинулся вверх по полю при δ 4,42 в обычную область Н-С(7)-ОН незамещенные баккатины. Остающиеся сигналы тарпеноидной и тиоколхициновой частей были по существу идентичны сигналам их материнских соединений.

Соединение формулы (I), имеющее следующую структурную формулу

представляет собой аморфное твердое вещество, R_f (гексан/AcOEt 1:1) 0,3. ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): 8,09 (д, J=7,6, o-H); 7,65 (д, J=7,6, HN-C(7')); 7,58 (т, J=7,6, p-H); 7,47 (т, J=7,6, m-H); 7,40 (с, Н-С(8')); 7,31 (д, J=9,5, H-C(12')); 7,07 (д, J=9,5, H-С(11')); 6,55 (с, Н-С(4')); 5,57 (д, J=7,4, H-C(2)); 5,50 (дд, J=10,5, 6,6, Н-С(7)); 5,24 (с, Н-С(10)); 4,93-4,78 (м, Н-С(13)); 4,92 (д, J=9,3, H-C(5)); 4,83-4,70 (м, Н-С(7')); 4,29 (д, J=8,3, Н_а-С(20)); 4,15 (д, J=8,3, Н_b-С(20)); 4,01 (д, J=7,4, Н-С(3)); 3,93 (с, МеО); 3,91 (с, МеО); 3,66 (с, МеО); 2,75-2,20 (м, янтарный CH₂, СН₂(5'), Н_n-С(6), Н_n-С(6'), СН₂(14)); 2,42 (с, MeS);,25 (с, ОСОМе); 2,02-1,75 (м, Н_b-С(6), Н_b-С(6')); 2,01 (с, Ме(18)); 1,76 (с, Ме(19)); 1,02 (с, Ме(17)); 0,95 (с, Ме(16)). ¹³C-ЯМР (CDCl₃, 100 МГц; величины со звездочками могут быть взаимозаменяемыми): 205,4 (С(9)); 182,4 (С(9')); 171,7, 171,1 (янтарный СО); 170,7 (ОСОМе); 166,9 (COPh); 158,2 (C(10')); 153,6 (С(3')); 151,6 (С(7'а)); 151,2 (С(1')); 142,6 (С(12)); 141,6 (С(2')); 138,5 (С(12'а)); 134,8 (С(12')); 134,4 (С(4'а), С(11)); 133,9 (р-С); 130,1 (2 о-С); 129,5 (C(Ph)); 128,6 (2 m-С), С(8')); 126,8 (С(11')); 125,6 (С(1'а)); 107,4 (С(4')); 83,8 (С(5)); 80,4 (С(4)); 78,8 (С(1)); 76,5 (С(20)); 75,0 (С(10)); 74,8 (С(2)); 72,1 (С(7)); 67,7 (С(13)); 61,8 (МеО); 61,4 (МеО); 56,2 (С(8)); 56,1 (МеО); 52,1 (С(7')); 46,7 (С(3)); 42,5 (С(15)); 38,7 (С(14)); 36,8 (С(6')); 33,3 (С(6)); 30,0*, 29,0* (С(5'), янтарный СН₂); 26,6 (С(17)); 22,5 (ОСОМе); 19,6 (С(16)); 15,1 (MeS); 14,8 (С(18)); 10,7 (C(19)); CI-MS: 1000 ([М+Н]⁺).

Соединение формулы (I), имеющее следующую структурную формулу

представляет собой аморфное твердое вещество, R_f (гексан/AcOEt 7:3) 0,25. [α]_D ²=-94 (EtOH, c=0,30). ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): 8,12 (д, J=7,6, o-H); 7,62 (т, J=7,6, p-H); 7,51 (т, J=7,6, m-Н); 7,40 (м, о-Н'), m-Н'); 7,33 (м, p-H'); 7,29 (с, Н-С(8")); 7,28 (д, J=10,4, Н-С(12")); 7,05 (д, J=10,4, H-C(11'')); 6,54 (с, Н-С(4")); 6,40 (с, Н-С(10)); 6,22 (т, J=9,0, H-C(13)); 5,72 (д, J=6,5, H-C(2)); 5,58 (дд, J=10,0, 7,0, Н-С(7)); 5,26 (м, Н-С(3')); 4,92 (д, J=9,2, Н-С(5)); 4,65 (м, Н-С(7")); 4,64 (м, Н-С(2'); 4,31 (д, J=8,4, H_a-C(20)); 4,20 (д, J=8,4, Н_b-С(20)); 3,94 (с, МеО); 3,93 (д, J=6,5, Н-С(3)); 3,91 (с, МеО); 3,65 (с, МеО); 2,58 (м, 1Н, янтарный СН2), 2,54 (м, Н_а-С(6)), 2,50 (м, янтарный CH₂), Н_а-С(5''), 2,42 (с, MeS); 2,42 (м, 1Н, янтарный СН₂), 2,37 (с, МеСОО-С(4)); 2,34 (м, СН₂(14)); 2,27 (м, Н_b-С(5''), 2,23 (м, Н_b-С(6''); 1,92 (с, Me (18)); 1,85 (м, Н_b-С(6)); 1,83 (с, Ме(19)); 1,76 (м, Н_b-С(6"); 1,48, 1,37 (2с, Ме₃С); 1,29 (с, Ме(16)); 1,26 (с, Ме(17)). ¹³С-ЯМР (CDCl₃, 100 МГц; величины со звездочками могут быть взаимозаменяемыми): 200,5 (С (9)); 182,5 (С(9")); 172,7, 171,2 (янтарный СО); 172,6 (C(1')); 170,2 (ОСОМе); 167,0 (COPh); 158,4 (С (10")); 155,4, 155,3 (COOtBu); 153,7 (С(3''); 151,4 (С(1")); 150,8 (С(7"а)); 142,0 (С(2")); 141,5 (С(12)); 138,5 (2С) (C(Ph')); 138,3 (С(12"а)); 134,3 (С(12"), (С(4"а), 133,7 (р-С); 132,4 С(11)); 130,2 (2 о-С); 129,3 (C(Ph)); 128,9 (2 m-С), 128,7 (2 о-С', С (8"), 2 m-С'); 128,1 (2р-С'); 126,9 (C(11')); 125,8 (С(1"а)); 107,8 (С(4'')); 83,9 (С(5)); 81,2 (С(4)); 80,2 (2 Ме₃С); 78,8 (С(1)); 76,7 (С(2'), (С(10)); 76,5 (С(20)); 74,6 (С(2)); 73,7 (С(7)); 72,3 (С(13)); 61,6 (МеО); 61,3 (МеО); 56,5 (С(8)); 56,2 (МеО); 52,1 (СО'), (С(7")); 47,0 (С(3)); 43,4 (С(15)); 36,8 (С(6")); 35,6 (С (14)); 33,4 (С(6)); 30,8*, 29,9* (янтарный СН₂); 30,0 (С(5'')), 28,3 (2 Ме₃С); 26,6 (С(17)); 22,5 (ОСОМе); 21,3 (С(16)); 15,1 (MeS); 14,6 (С(18)); 11,0 (C(19)); HR-FAB-MS: 1526,6130 ([C₈₁H₉₅N₃O₂₄S+H]⁺; расчет. 1526,6104).

Цитотоксичность в отношении клеток рака молочной железы MCF7. Ингибирующие эффекты соединений на рост клеток опухоли молочной железы человека оценивали сульфородамином В (SRB) (Sigma Chemical Company), анализом на основе красителя, который косвенно определяет количество клеток измерением связанных с мембранами белков, как описано в публикации Р. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero et al., J. Natl. Canaer Inst., 1990, 82, 1113. Линии клеток рака молочной железы MCF7, полученные от Frederick, MD из Отделения лечения рака хранилища опухолей Национального института рака. Линии клеток культивировали при 37°, в 5% С0₂ в среде RPMI 1640 с добавлением 5% Nu-сыворотки, 5% фетальной бычьей сыворотки (Atlanta Biological, Atlanta, GA), 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина (Life Technologies, Grand Island, NY). Вкратце, 1х10⁵ экспоненциально пролиферирующих клеток высевали на 96-луночный титрационный микропланшет в полной ростовой среде и инкубировали при 37° в течение 15-18 ч для обеспечения возможности клеткам прикрепиться к субстрату перед добавлением соединений. Для каждого испытуемого соединения параллельно исследовали 5 96-луночных титрационных микропланшетов. Опухолевые клетки контактировали с 10-12 различными концентрациями каждого препарата, охватывая диапазон концентраций от 5 до 6 логарифмов при 37°, в 5% С0₂. MCF7 контактировали с препаратами в течение 72 ч (примерно 3,3 клеточных удвоений). Клетки фиксировали in situ в течение 1 ч при 4° с ледяным 50% CCl₃СООН. Затем планшеты промывали 6 раз Н₂0 и 150 мкл 0,4% SRB добавляли в каждую лунку. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре планшеты споласкивали 0,1% АсОН и сушили воздухом. Связанные SRB солюбилизировали добавлением 100 мкл Tris основания (рН 10,5) на лунку и давали возможность стоять при комнатной температуре в течение 5 мин. Оптическую плотность (OD) каждой лунки измеряли при 570 нм. В указанных условиях количество клеток пропорционально OD. Авторы определяли концентрацию каждого препарата, которая ингибировала 50% клеточного роста (ED₅₀), при эмпирически определенных концентрациях препаратов от 10 мкМ до 30 пкМ. ED₅₀ получали нанесением на график кривой зависимости эффекта от концентрации, как описано в публикации М.R.Vredenburg, I.Ojima, J.Veith, P.Pera, К.Kee et al., J.Natl. Canaer Inst., 2001, 93, 1234. Минимум 3 отдельных эксперимента использовали для получения представленных величин ED₅₀. Рассчитывали соотношение между ED₅₀ таксола и соединений.

1. Конденсированные производные тиоколхицина и баккатина общей формулы (I)

где n представляет собой целое число от 0 до 8;

R представляет собой остаток формулы а), b), c), d) или е):

где R₁ и R₂, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой водород или группу формулы

2. Соединение по п.1, где n представляет собой целое число от 1 до 7.

3. Соединение по п.2, где n равно 1.

4. Соединение по любому из пп.1-3 в качестве активного ингредиента лекарственного средства, обладающего антипролиферативной активностью.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по любому из пп.1-3 в смеси с подходящим носителем.