Способ получения конъюгированной линолевой кислоты
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и пищевой промышленности. Способ получения конъюгированной линолевой кислоты предусматривает создание и инкубирование реакционной смеси, включающей микроорганизмы, способные к преобразованию линолевой кислоты в конъюгированную линолевую кислоту, и мицеллы, образованные поверхностно-активным веществом и линолевой кислотой. Полученный по способу продукт содержит, по меньшей мере, 75% цис-9,транс-11 изомер конъюгированной линолевой кислоты. Применение изобретения позволяет получить повышенный выход конъюгированной линолевой кислоты. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 ил.
Область изобретения
Изобретение относится к способу получения конъюгированной линолевой кислоты. В частности, способ описывает получение из линолевой кислоты путем ферментации конъюгированной линолевой кислоты и, в частности, ее цис-9, транс-11-изомера.
Предпосылки изобретения
CLA является общим термином для различных изомеров конъюгированной линолевой кислоты, из которых только два изомера (цис-9,транс-11-изомер, то есть бовиновая кислота, и транс-10,цис-12-изомер) обладают, как установлено, биологической активностью. В коммерческих препаратах CLA, получаемых синтетически, обычно содержатся все различные изомеры CLA и только 40% изомера цис-9,транс-11, несмотря на то, что в молоке содержится 80% изомера цис-9,транс-11 - 18:2.
Отдельные исследования показали, что животные жиры содержат жирную кислоту, которая наряду с другими функциями ингибирует рак у подопытных животных, действуя на факторы роста, и может регулировать количество жировой ткани в организме. Майкл Париза (Michael Pariza) при исследовании говядины рубленого бифштекса обнаружил, что в ней содержится жирная кислота, которая при анализе оказалась конъюгированной линолевой кислотой (CLA). В тестах на животных было обнаружено, что в группах, которые получали пищу с содержанием CLA, число случаев рака молочной железы, желудка и прямой кишки было ниже по сравнению с контрольной группой (Pariza M.W., Loretz L.J., Storkson J.M. and Holland N.C., Mutagens and modulator of mutagenesis in fried ground beef. Cancer Res. (Suppl.), 1983, 43:2444s-2446s и Pariza M.W. and Hargraves W.A., A beef-derived mutagenesis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumors by 7,12-dimethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 1985, 6:591-593). В тканевых культурах клеток человека CLA также была способна ингибировать развитие раковых клеток. Механизм действия до сих пор не известен, но было обнаружено, что CLA действует на различные стадии онкогенеза, многочисленные факторы роста и, возможно, также на метаболизм канцерогенных веществ в печени. Также было предположено, что возможно CLA действует как антиоксидант (Ip, С., Chin S.F., Scimeca J.A. and Pariza M.W., Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid. Cancer Res., 1991, 51:6118-6124), за счет чего соединения могли бы защищать клеточные мембраны от негативного действия свободных радикалов. Также был исследован эффект снижения холестерина и было обнаружено, что соединение не снижает количество «хорошего» липопротеина с высокой плотностью (HDL), как это делают препараты, снижающие уровень холестерина (Lee K.N., Kritchevsky D. and Pariza M.W., Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis, 1994, 108:19-25). CLA может также использоваться как средство для похудения, так как было обнаружено, что соединение расщепляет жировые ткани (Park et al.. Changes in Body Composition in Mice during Feeding and Withdrawal of Conjugated Linoleic Acid, Lipids, 1999, 34:243-248).
Наряду с этим сообщалось о том, что неконъюгированная линолевая кислота имеет негативные эффекты, например стимулирует рак груди. Также хорошо известен противомикробный эффект неконъюгированной линолевой кислоты.
CLA может быть получена химически или ферментативной изомеризацией. Природная CLA образуется, например, в рубцовом отделе желудка жвачных животных из полиненасыщенных жирных кислот в результате биологической активности бактерий Butyrivibrio fibrisolvens и секретируется как в молоко, так и в мясо, которые, как было показано, являются наилучшими источниками CLA.
Было обнаружено, что получаемое из пищи количество CLA значительно уменьшилось за прошедшие десятилетия. В исследованиях питания было подсчитано, что в 1970-ых годах в пище в среднем содержалось приблизительно 0,45 г CLA ежедневно. Так как потребление молока и молочных продуктов уменьшилось, то в настоящее время ежедневное среднее потребление составляет 0,25 г CLA. Увеличение природной CLA в пище является важнейшей задачей здравоохранения, так как в соответствии с исследованиями увеличение потребления CLA в два раза могло бы, например, снизить риск заболевания раком.
Отдельные исследования показали, в частности, важность молока среди всех пищевых продуктов как источника CLA. Например, в соответствии с финским эпидемиологическим исследованием (Knekt et al., устное заявление), употребление молока снижает риск заболевания раком груди. В настоящее время концентрация CLA в жире молока значительно изменяется в зависимости от сезона (от 2,4 до 28,1 мг/г жира) в зависимости от качества корма.
В желудочно-кишечном тракте были обнаружены микробы, способные образовывать CLA. В частности, были исследованы бактерия Butyrivibrio fibrisolvens, встречающаяся в рубцовом отделе желудка, и ее фермент изомераза. Однако эта бактерия является настолько анаэробной, что с помощью ее невозможно получать CLA в промышленном масштабе, так как абсолютно анаэробные условия, требуемые для штамма, являются сложной и экономически не доступной задачей (патент США № 5856149, Pariza et al.)
Также было обнаружено, что Propionibacterium acnes продуцирует CLA, но данный патогенный штамм, кроме того, синтезирует фермент редуктазу, которая затем восстанавливает полученную CLA до других жирных кислот (Verhulst et al., System. Appl. Microbiol., 9:12-15(1987).
Также хорошо известно, что некоторые пропионово-кислые бактерии способны преобразовывать линолевую кислоту до ее конъюгированной цис-9,транс-11 формы.
Кроме того, хорошо известно, что преобразование свободной линолевой кислоты в CLA является более эффективным, чем преобразование жирной кислоты в триглицеридной форме. Однако свободная линолевая кислота даже в относительно небольших концентрациях оказывает ингибирующее действие на рост пропионово-кислых бактерий, что до настоящего времени препятствовало крупномасштабному получению конъюгированной линолевой кислоты и, в частности, ее цис-9,транс-11 формы.
В патенте США № 5856149 (Pariza и Yang) описан способ получения цис-9,транс-11 жирной кислоты путем преобразования неконъюгированной ненасыщенной (двойные связи в положениях 9 и 12) жирной кислоты штаммом Lactobacillus reuterii, предпочтительно L. reuterii PYR8. В публикации описано выделение штаммов, продуцирующих CLA, и утверждается, что только четыре из 45 выделенных штаммов обладали желаемой линолеатизомеразной активностью, и, таким образом, были способны продуцировать CLA из линолевой кислоты. Проведенные исследователями наблюдения показали, что количество продуцируемой CLA было прямо пропорционально количеству клеток, и было сделано предположение о том, что линолеатизомераза является накапливающимся ферментом, который не имеет функционального значения для клеточного роста. В публикации не упоминается об ингибиторном влиянии линолевой кислоты на бактериальный рост и, следовательно, не описываются подходы к решению данной проблемы.
В статье «Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures», J. Appl. Microbiol., 85 (1998), стр. 95-102, J. Jiang, L. Bjorck и R. Fonden указано, что пропионово-кислые бактерии способны преобразовать линолевую кислоту в CLA. Jiang et al. исследовали способность 19 различных бактериальных заквасок преобразовывать добавленную в среду для роста линолевую кислоту до CLA, после того, как они наблюдали, что созревшие сыры содержат более высокие уровни CLA, чем другие молочные продукты. Они исследовали способность 7 штаммов лактобацилл, 4 штаммов лактококков, 2 штаммов стрептококков и 6 штаммов пропионово-кислых бактерий продуцировать CLA из линолевой кислоты в MRS, молоке и Na-лактатной среде. Кроме того, проводились исследования различных концентраций линолевой кислоты в водном растворе детергента Tween 80 посредством добавления линолевой кислоты в MRS-бульон. Лишь у нескольких пропионово-кислых бактерий из исследованных бактерий наблюдалась биопреобразующая активность; активность демонстрировали три из шести штаммов, а именно Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii PFF и PFF6 и P. freudenreichii ssp. shermanii PFS. Самый высокий выход был получен у штамма PFF6, и он составил 265 мкг/мл CLA при начальной концентрации линолевой кислоты, равной 750 мкг/мл. Среди полученной CLA от 70 до 90% вещества являлось биологически активным цис-9,транс-11-изомером. Ни лактобациллы, ни лактококки, ни стрептококки не продуцировали CLA.
Таким образом, показывающие наилучшие результаты пропионово-кислые бактерии, а именно штамм PFF6, были способны преобразовывать лишь 5% добавленной линолевой кислоты до CLA по способу, описанному Jiang et al. Исследователи обнаружили, что продукция CLA пропионово-кислыми бактериями положительно коррелирует с их толерантностью к линолевой кислоте. Таким образом, данное исследование также подтвердило уже известный факт, что линолевая кислота обладает антимикробным эффектом, который замедляет рост бактерий. В публикации утверждается, что антимикробный эффект жирных кислот может быть снижен при использовании поверхностно-активных веществ, таких как детергенты, например Tween 80, или белки. Однако исследований в этом направлении не проводили, и в публикации не описаны возможные полезные способы.
Заявка WO 99/29886 J.Jiang, L.Bjorck и R.Fonden частично основана на результатах исследований, приведенных в вышеуказанной статье. Она относится к использованию специфических бактерий, применяемых в пищевых продуктах, для получения CLA in vitro. Кроме Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii и Р. freudenreichii ssp, shermanii, подходящие бактерии также включают Bifidobacterium breve. В соответствии с публикацией ферментация может проводиться в присутствии эмульгатора, как, например, Tween 80 и лецитин. Однако в примерах данной публикации не описано использование эмульгаторов, и наилучший полученный результат, как сообщается, совпадает с результатом вышеуказанной публикации: используя штамм PFF6 было получено 246,4 мкг/мл биологически активного цис-9,транс-11-изомера при начальной концентрации линолевой кислоты 750 мкг/мл. Выход, таким образом, составил меньше 33%.
Следовательно, все еще имеется очевидная потребность в разработке нового способа получения конъюгированной линолевой кислоты с улучшенными выходами. В том случае, если желательно использовать наибольшие из возможных количества свободной линолевой кислоты в качестве исходного продукта для CLA, важнейшей задачей является минимизация или устранение проблем, связанных с антимикробным эффектом свободной линолевой кислоты.
Краткое описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является новый способ получения конъюгированной линолевой кислоты с хорошим выходом.
Объектом настоящего изобретения также являются новые продукты, которые образуются при использовании способа по изобретению и которые содержат большое количество CLA.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на том, что ингибирующий эффект свободной линолевой кислоты на рост бактерий снижается при добавлении в среду линолевой кислоты в форме, которая не замедляет рост бактерий значительно, но доступна им в течение культивирования.
Согласно изобретению, было обнаружено, что когда в реакционный бульон добавляют линолевую кислоту в виде мицеллярной смеси, то она обладает значительно меньшим ингибирующим эффектом на рост бактерий, чем линолевая кислота в любой другой форме. Посредством добавления подходящего большого количества детергента линолевая кислота в условиях культивирования сохраняется в мицеллярной форме. Это также частично снижает ингибиторный эффект линолевой кислоты на рост бактерий. Использование мицеллярной линолевой кислоты и стабилизация мицелл в процессе культивирования также позволяют значительно улучшить выход CLA.
Используя линолевую кислоту в мицеллярной форме в качестве исходного продукта для ферментации и подбирая соответствующую пропорцию линолевой кислоты и детергента, можно достичь свыше 90% преобразования линолевой кислоты в CLA и свыше 97% секреции полученной CLA в среду. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением разработан способ для получения большого количества линолевой кислоты в форме, которая делает возможным эффективное преобразование линолевой кислоты бактериями в CLA, в частности в цис-9,транс-11-изомер, без ингибиторного эффекта линолевой кислоты на рост.
Изобретение, таким образом, относится к способу получения CLA из линолевой кислоты с помощью микроорганизмов, причем способ характеризуется тем, что используемая в качестве исходного продукта линолевая кислота добавляется в реакционный бульон в форме мицелл.
Мицеллы содержат свободную линолевую кислоту и поверхностно-активное вещество в соответствующей пропорции.
Изобретение, кроме того, относится к продуктам, изготовленным с помощью способа по изобретению, и использованию их как таковых или в производстве специальных пищевых продуктов и веществ, способствующих укреплению здоровья.
Образование мицелл можно проводить обычным способом путем смешения линолевой кислоты с детергентом, формирующим мицеллу, в соответствующей пропорции в щелочной среде. Получение не требует ни специальных условий, ни специального оборудования. Его можно просто, недорого и легко проводить в большом масштабе.
В соответствии с данным изобретением для образования мицелл используется свободная линолевая кислота. Свободная линолевая кислота является коммерчески доступной. Альтернативно, возможно также получать свободную линолевую кислоту из растительных масел, например сафлорового масла, кукурузного масла или подсолнечного масла, путем гидролиза до свободных жирных кислот, используя омыление способами, которые известны сами по себе (ср., например, Christie W.W., Gas Chromatography and Lipids - a Practical Guide, 2 edition, 1989, The Oily Press, Ayr, Scotland).
Это часто является экономической альтернативой, учитывая, что чистая свободная линолевая кислота является очень дорогой. Также, полученная синтетическим путем линолевая кислота не всегда подходит для использования в пищевых продуктах из-за химических примесей.
Сафлоровое масло является выгодным источником линолевой кислоты. Оно содержит до 78% линолевой кислоты, и получение из него свободной жирной кислоты в сотни раз более экономически выгодно, чем использование коммерчески доступной свободной линолевой кислоты.
С точки зрения изобретения, выбор поверхностно-активного вещества не является критическим параметром, например для данной цели хорошо подходят полиоксиэтиленсорбитановые эфиры [препараты Tween (несколько производителей, например Fluka и Sigma)] и PEG 20 сорбитанолеат Kotilen-0/1 VL (от Dr. W.Kolb AG), широко используемые в области микробиологии. Также можно использовать некоторые другие поверхностно-активные вещества.
Преобразование линолевой кислоты в форме мицелл, полученных вышеописанным способом, в CLA можно эффективно проводить путем ферментации. В ферментации возможно использовать любую бактерию, которая способна преобразовывать линолевую кислоту в CLA, из указанных в вышеописанных предпосылках изобретения. Однако ферментацию удобно выполнять с пищевыми бактериями, в частности с пропионово-кислыми бактериями. Подходящие штаммы включают в себя, например, штаммы вида Propionibacterium freudenreichii и, в частности, штаммы, принадлежащие к подвиду Р. freudenreichii ssp. freudenreichii и Р. freudenreichii ssp. shermanii.
Линолевую кислоту в форме мицелл стабилизируют добавлением поверхностно-активного вещества, то есть детергента, в среду в количестве, которое устраняет эффект среды. В качестве поверхностно-активных веществ могут использоваться вышеуказанные вещества, такие как Tween и Kotilen. Удобная концентрация поверхностно-активного вещества зависит от количества добавленной линолевой кислоты в форме мицелл и от используемой среды. Детергент обычно используется в количестве от 0,5 до 1,5%, предпочтительно 1%. Линолевую кислоту, полученную в форме мицелл, добавляют в таком виде в ферментативный бульон в качестве исходного продукта для CLA.
Новый способ по изобретению позволяет добавлять линолевую кислоту в ферментативный бульон, по крайней мере, до концентрации 1000 мкг/мл среды без значительного изменения роста бактерий или снижения эффективности превращения. Таким образом, биоконверсию значительно лучше проводить по данному способу, чем известными способами, то есть, по крайней мере, 80% линолевой кислоты преобразуется в CLA и, по крайней мере, от этого количества CLA 75% является наиболее биологически активным изомером.
Ферментацию проводят по существу известным способом. Для обеспечения оптимального выхода CLA подбирают среду и условия, чтобы удовлетворить требованиям в отношении используемого штамма. После того, как настоящее изобретение станет доступным общественности, выбор подходящих параметров ферментации будет очевиден для специалиста в данной области.
Используя линолевую кислоту в форме мицелл, стало возможным получать CLA в связи с ростом бактерий, устраняя ингибирующий эффект линолевой кислоты на рост бактерий. CLA также может быть получена наряду с клеточной продукцией, предназначенной для других целей. Одна из специфических особенностей способа по изобретению состоит в том, что CLA может также быть получена после культивирования клеток или отдельно от них, используя покоящиеся, то есть не растущие, клетки, посредством чего CLA может быть получена как в питательной среде, так и в буферном растворе. Для стабилизации линолевой кислоты в форме мицелл с детергентом не требуется отдельного добавления детергента в буферный раствор. Если желательно, получение CLA может также быть непосредственно объединено с производством (пищевых) продуктов в производственном процессе, в котором используют интересующую бактерию.
CLA, образуемая при ферментации и секретируемая из клеток, может быть выделена из ферментативного бульона с помощью способов, известных в данной области, и, если желательно, преобразована в продукт, содержащий CLA, высокой степени очистки известными сами по себе способами. Альтернативно, может быть использован ферментативный бульон, содержащий CLA и бактериальные клетки, как таковой, или CLA может быть сконцентрирована или высушена с бактериальными клетками.
Полученный продукт, содержащий CLA, может использоваться как таковой в качестве вещества, способствующего укреплению здоровья. Продукт может также использоваться при получении специальных пищевых продуктов, регулирующих физиологические процессы в организме, и тому подобное.
В настоящей заявке термин «пищевой» используется в широком смысле этого слова и охватывает все пищевые продукты, которые могут быть в твердой, желеобразной или жидкой форме, и охватывает как готовые к употреблению продукты, так и продукты, к которым продукт по настоящему изобретении добавляется в процессе потребления в качестве добавки или как составной компонент продукта. Например, пищевой продукт может быть продуктом молочной промышленности, мясной промышленности, пищевой промышленности, производства напитков, хлебобулочных изделий и кондитерской промышленности. Обычные продукты включают молочные продукты, такие как йогурт, створоженное молоко, творог, кислое молоко, масло и другие, подвергшиеся брожению молочные напитки, незрелые сыры и зрелые сыры, наполнители закусок и тому подобное. Напитки, такие как сыворотка, фруктовые напитки и пиво, составляют другую важную группу.
Лиофилизированные препараты, такие как капсулы, содержащие CLA, и порошки пропионово-кислых бактерий, и подвергшиеся брожению молочные продукты, содержание CLA в которых возрастает при действии пропионово-кислых бактерий, рассматриваются как предпочтительное воплощение.
Далее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Эти примеры предназначены только для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают его объем.
Ссылочный пример 1
Эффект образования мицелл на бактериальный рост и выработку CLA
Для подтверждения эффективности способа по изобретению проводили сравнительный анализ, в котором исследовали рост и продукцию CLA пропионово-кислыми бактериями в среде, содержащей свободную линолевую кислоту, свободную линолевую кислоту и детергент, линолевую кислоту в мицеллярной форме по примеру 1 и детергент. В качестве контроля использовали ту же среду без добавок (положительный контроль) и среду, к которой добавляли только детергент.
Для исследования в MRS-бульоне культивировали штаммы пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS), DSM 7067 и Р. freudenreichii ssp. Freudenreichii 131 (PI 31):
1) без добавок,
2) с 600 мкг/мл линолевой кислоты,
3) с добавлением 600 мкг/мл линолевой кислоты из основного раствора, содержащего 5 мг/мл линолевой кислоты и 1% Tween 80 в водном растворе (окончательное содержание Tween 0,2%),
4) с добавлением 0,9% Kotilen и 600 мкг/мл линолевой кислоты в форме мицелл по примеру 1,
5) с добавлением только 0,9% Kotilen (без линолевой кислоты).
Штамм PJS также культивировали в среде на основе сыворотки, которая содержала 5% пермеата молочной сыворотки (Valio Oy), 2% продукта гидролиза казеина (Valio Oy) и 1% дрожжевого экстракта (LabM) с вышеуказанными добавками с 1 по 5.
Каждый бактериальный штамм культивировали в культуральной среде дважды при 30°С в течение 72 часов, после чего каждый тестируемый бульон инокулировали 1% свежей культуры. Исследуемые культуры оценивали для определения клеточной плотности культуры по мутности метром Klett при 30°С в течение 4 дней. В конце культивирования (96 часов) количество образовавшейся CLA определяли с помощью газовой хроматографии, цис-9,транс-11-изомер отдельно, а другие изомеры вместе.
Исследуемые жирные кислоты подвергали тем же модификациям, как указано в статье M.Suutari, К. Liukkonen and S. Laakso «Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids», J. Gen. Microbiol., 136 (1990) 1469-1474. Образцы среды брали для анализа, и клетки разделяли центрифугированием (5000 g в течение 15 мин). Супернатант отфильтровывали на 0,2 мкм фильтре и брали образцы по 0,2-0,5 мл. Клеточную массу промывали водопроводной водой. Образцы супернатанта и промытые клетки лиофилизировали.
К лиофилизированным образцам добавляли 1 мл омыляющего агента, которым являлся 3,7 М раствор NaOH в 49% метаноле. Образцы обрабатывали азотом, смешивали и инкубировали в закрытых пробирках при 100°С на водяной бане в течение 30 минут, перемешивая один раз за это время. Образцы охлаждали до комнатной температуры и добавляли к ним 4 мл метилирующего агента, которым являлся 3,3 М раствор HCl в 48% метаноле. Образцы обрабатывали азотом, перемешивали, и пробирки с образцами инкубировали на водяной бане при 80°С в течение 10 минут, затем их охлаждали. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали добавлением к образцам 1,5 мл раствора гексан/метилтретбутиловый эфир (1:1) и энергичным встряхиванием пробирок в течение 10 минут. Нижнюю водную фазу удаляли пастеровской пипеткой. Органический слой промывали, добавляя в образцы 3 мл 0,3 М раствора NaOH и энергично встряхивая пробирки в течение 5 минут. Образцы центрифугировали (5000 g; в течение 20 минут) и органический слой образцов удаляли пастеровской пипеткой. Образцы сушили с помощью сульфата натрия и обрабатывали азотом.
Метиловые эфиры жирных кислот анализировали на газовом хроматографе (Hewlett Packard 5890 series II, Pennsylvania, США), к которому присоединяли пламенно-ионизационный детектор (FID) и устройство для автоматического взятия образцов (Hewlett Packard 7673А). При анализе использовали капиллярную колонку (HP-FFAP, 25 м × 0,2 м × 0,3 мкм). Образцы вводили с помощью инжектора с делением потока (деление потока составляло 1:20; скорость смывки с мембраны составляла от 1 до 2 мл/мин). Давление на входе колонки равнялось 150 кПа, а скорость потока газа-носителя (гелий) в колонку составляла приблизительно 1 мл/мин. Скорость потока основного газа (воздух) равнялась 30 мл/мин, а скорость потока водорода в детекторе составляла 40 мл/мин. Температура инжектора и температура детектора равнялись 250°С. Температура термостата составляла от 70 до 200°С. Температуру повышали со скоростью 25 градусов Цельсия в минуту. Результаты обрабатывали и выводили в конечном виде с помощью программного обеспечения HP Chemstation, прилагаемого к газовому хроматографу.
Жирные кислоты образцов были идентифицированы путем сравнения их времени удерживания с известными стандартами жирных кислот. Препарат от Sigma использовался для идентификации конъюгированной линолевой кислоты, причем препарат представлял собой смесь цис- и транс-9,11 и -10,12-изомеров CLA. Для количественного определения жирных кислот в качестве внутреннего стандарта использовали С19:0 метиловый эфир жирной кислоты (метиловый эфир нонадекановой кислоты, Sigma).
Результаты роста бактерий представлены в таблице 1.1.
| Таблица 1.1 Рост штаммов PJS и Р131 в среде MRS, содержащей линолевую кислоту (LA) | |||||
| PJS | 0 ч | 24 ч | 48 ч | 72 ч | 96 ч |
| 1) контроль | 2 | 38 | 180 | 325 | 415 |
| 2) LA | 78 | 84 | 96 | 106 | 110 |
| 3) LA + детергент | 40 | 49 | 68 | 94 | 120 |
| 4) LA (мицелла)+детергент | 11 | 36 | 125 | 252 | 370 |
| 5) детергент | 1 | 35 | 185 | 340 | 430 |
| Р131 | |||||
| 1) контроль | 8 | 37 | 122 | 270 | 425 |
| 2) LA | 80 | 90 | 97 | 107 | 115 |
| 3) LA + детергент | 55 | 60 | 74 | 95 | 114 |
| 4) LA (мицелла)+детергент | 1 | 20 | 71 | 160 | 270 |
| 5) детергент | 0 | 22 | 104 | 244 | 410 |
Из результатов следует, что линолевая кислота, имеющая концентрацию 600 мкг/мл как таковая, или добавленная из основного раствора, содержащего 1% Tween в водном растворе, ингибирует рост обоих штаммов по сравнению с контролем. Посредством использования соответствующего количества линолевой кислоты в форме мицелл по изобретению, ингибиторный эффект линолевой кислоты на рост был снижен и штамм рос почти так же, как в контроле.
Количество CLA, образуемое штаммами PJS и Р131 в бульоне, основанном на MRS, представлено в таблице 1.2, и аналогичный результат со штаммом PJS в среде, основанной на сыворотке, представлен в таблице 1.3.
| Таблица 1.2 Образование CLA с помощью штаммов PJS и Р131 в среде MRS, содержащей линолевую кислоту (LA) | ||||
| PJS | Всего CLA мкг/мл в культуре | CLA (цио-9, транс-11) мкг/мл в культуре | Выход CLA % | Доля цис-9,транс-11-изомеров в общем количестве CLA (%) |
| 1) контроль | 39 | 9 | - | 24 |
| 2) LA | 195 | 135 | 32 | 69 |
| 3) LA + детергент 0,2% | 279 | 227 | 47 | 81 |
| 4) LA (в мицеллах) + детергент 0,9% | 680 | 490 | 100 | 73 |
| 5) детергент 0,9% | 247 | 64 | - | 26 |
| Р131 | ||||
| 1) контроль | 41 | 11 | - | 26 |
| 2) LA | 66 | 16 | 11 | 25 |
| 3) LA + детергент 0,2% | 78 | 26 | 13 | 34 |
| 4) LA (в мицеллах) + детергент 0,9% | 308 | 134 | 51 | 44 |
| 5} детергент 0,9% | 232 | 63 | - | 27 |
| Таблица 1.3 Образование CLA с помощью штамма PJS в среде на основе пермеата молочной сыворотки, содержащей линолевую кислоту (LA) | ||||
| PJS | Всего CLA мкг/мл в культуре | CLA (цис-9, транс-11) мкг/мл в культуре | Выход CLA % | Доля цис-9,трано11 изомеров в общем количестве CLA (%) |
| 1) контроль | 16 | - | - | - |
| 2) LA | 13 | - | - | - |
| 3) LA + детергент 0,2% | 53 | 13 | 2 | 25 |
| 4) LA (в мицеллах) + детергент 0,9% | 440 | 420 | 73 | 96 |
Из результатов следует, что мицеллизация (перевод в форму мицелл) по изобретению делает возможным почти 100% превращение линолевой кислоты в CLA, где более 75% представляют собой полезный цис-9,транс-11-изомер CLA. При добавлении линолевой кислоты как таковой только 32% преобразовывалось в CLA, при добавлении линолевой кислоты в 1% растворе детергента в CLA превращалось только 47%. Таким образом, при мицеллизации в соответствии с изобретением достигаются значительно лучшие результаты как в отношении минимизации ингибирующего эффекта линолевой кислоты на бактериальный рост, так и максимизации производства CLA из линолевой кислоты.
Пример 1
Получение линолевой кислоты в форме мицелл
Для получения основного мицеллярного раствора в пробирку отвешивали 300 мг линолевой кислоты (цис-9,транс-12- октадекадиеновая кислота, L-1376, Sigma), добавляли 10 мл бескислородной дистиллированной воды, содержащей 0,36 мл (детергента) сорбитанолеата (Kotilen 0/1 или Tween 80), осторожно перемешивали. В смесь по каплям добавляли 2 н. раствор гидроксида натрия до тех пор, пока смесь не начинала осветляться (приблизительно 0,5-0,6 мл). Раствор переносили в 50 мл мерную колбу и заполняли ее до отметки бескислородной дистиллированной водой, посредством чего получали основной мицеллярный раствор, содержащий 6 мг/мл линолевой кислоты. Раствор разделяли на соответствующие порции, с помощью газообразного азота удаляли воздух и партии хранили в замороженном виде.
Основной мицеллярный раствор может также быть получен более концентрированным или более разбавленным, чем описанный выше. Существенным является то, что соотношение между количеством свободной линолевой кислоты и остатками детергента сорбитанолеата такое же, как в описанном выше растворе.
Пример 2
Действие линолевой кислоты и детергента на бактериальный рост и выработку CLA
Эффективность пропорции линолевой кислоты и детергента исследовали при культивировании пропионово-кислых бактерий в бульоне, основанном на сыворотке, и бульоне MRS (LabM) в культурах по 150 мл. Бульон на основе сыворотки содержал 2% пермеата молочной сыворотки (Valio Oy), 0,5% триптона (LabM) и 1% дрожжевого экстракта (LabM). В среду добавляли линолевую кислоту в виде описанного выше основного раствора в форме мицелл в таком количестве, чтобы концентрация свободной линолевой кислоты в среде составляла 600 мкг/мл. Отдельно в среду добавляли желаемое количество сорбитанолеатного детергента (Kotilen 0/1 или Tween 80). рН среды доводили до 6,3. В культурах в качестве 2% (об./об.) затравки использовали пропионово-кислые бактерии штамма Р. freudenreichii ssp. shermanii JS, которые культивировали в бульоне, основанном на сыворотке. Культивирование проходило при температуре 30°С. За ростом клеток наблюдали в течение 96 часов, измеряя мутность среды с помощью колориметра Klett-Summerson (фильтр №66). CLA и линолевую кислоту анализировали газовой хроматографией.
Результаты представлены в таблице 2. Выработка CLA относится здесь и в результатах по выработке CLA в примерах 3 и 4 к CLA, полученной микробными клетками PJS, и ее определяют вычитанием количества CLA, образующейся в среде с детергентом, из общих концентраций CLA. Выход CLA вычисляют следующим образом: г полученной CLA/ г начальной LA.
| Таблица 2 Действие концентраций детергента в бульоне на основе периеата молочной сыворотки и бульоне MRSх) на рост PJS и выработку CLA | ||
| Добавление детергента в бульон на основе пермеата молочной сыворотки | Значение ΔKlett | Выход CLA % |
| LA (контроль) | 34 | <1 |
| 0.9% Kotilen (контроль) | 365 | <1 |
| LA + 0.2% Kotilen | 77 | 33 |
| LA + 0.9% Kotilen | 306 | 65 |
| LA + 1.2% Kotilen | 309 | 67 |
| Добавление детергента в MRS бульон | ||
| LA + 0.1% Tween 80 | 56 | 51 |
| LA + 0.8% Tween 80 | 301 | 83 |
| x) бульон MRS содержит 0,1 Tween 80, следовательно, при добавлении 0,1% конечная концентрация возрастает до приблизительно 0,2%. |
Линолевую кислоту в мицеллярной форме можно добавлять в больших количествах в среду для роста штамма PJS без полного ингибирования клеточного роста. Как следует из результатов в таблице 2, добавление детергента, кроме того, позволяет снизить ингибиторный эффект линолевой кислоты. Если в среде подходящая пропорция линолевой кислоты и детергента, то количество линолевой кислоты в среде может быть увеличено таким образом, что ее превращение в CLA в сочетании с клеточным ростом происходит так же эффективно, как при малых концентрациях линолевой кислоты. Таким образом, достигаются промышленно значимые количества желаемого цис-9,транс-11-изомера CLA. В данном исследовании при концентрации линолевой кислоты 600 мкг/мл оптимальное содержание детергента составляло от 0,9 до 1%, но также могут быть использованы большие количества.
Пример 3
Получение CLA ферментацией при установленном рН
Наиболее эффективный способ культивирования пропионово-кислых бактерий в промышленном масштабе заключается в том, чтобы проводить его в ферментере, где может поддерживаться значение рН среды, оптимальное для клеточного роста. Исследовали процесс производства конъюгированной линолевой кислоты посредством выращивания клеток PJS в находящихся в ферментере культурах с объемом раствора, равным 2 литрам. В качестве среды для роста использовали бульон на основе пермеата молочной сыворотки примера 2. Бульон для выращивания содержал линолевую кислоту в форме мицелл в концентрации 400, 600, 1000 или 1400 мкг/мл и детергент Kotilen в количестве 0,6, 0,9 или 1,5% соответственно. В ходе культивирования рН среды для выращивания поддерживали равным 6,3 при концентрациях линолевой кислоты, равных 400, 600 и 1000 мкг/мл, и равным 6,5 при концентрации линолевой кислоты, равной 1400 мкг/мл, путем автоматического добавления раствора аммиака. Температура культивирования составляла 30°С, и скорость перемешивания равнялась 100 об/мин. Концентрацию жизнеспособных клеток пропионово-кислых бактерий определяли в забуференном лактатом натрия агаре, и чашки с агаром культивировали при 30°С, в анаэробных условиях в течение 5-7 дней.
На чертеже показано получение CLA из линолевой кислоты при добавлении в среду 400 мкг/мл линолевой кислоты и 0,6% сорбитанолеатного детергента. Преобразование линолевой кислоты в CLA происходит, как ясно видно, одновременно с ростом клеток PJS.
В таблице 3 приведено сравнение процесса образования CLA в ферментере после 94-часового культивирования при содержании линолевой кислоты в среде, равном 400, 600 и 1000 мкг/мл, и после 108- и 132-часового культивирования при содержании кислоты 1400 мкг/мл.
| Таблица 3 Получение CLA при культивировании клеток PJS при установленном рН | |||||
| 400 мкг/мл LA, 0,6% детерг. 94 час. | 600 мкг/мл LA, 0,9% детерг. 94 час. | 1000 мкг/мл LA, 1,5% детерг. 94 час. | 1400 мкг/мл LA, 1,5% детерг. 108 час. | 1400 мкг/мл LA, 1,5% детерг. 132 час. | |
| Клеточная концентрация (КОЕ/мл) | 1,3×1010 | 1,2×1010 | 1,4×1010 | 2,4×109 | 1,3×1010 |
| Концентрация CLA (мкг/мл) | 515 | 886 | 1270 | 1490 | 16500 |
| Выход CLA (%) | 84 | 77 | 63 | 79 | 91 |
| Доля внеклеточной CLA (%) | 98 | 99 | 98 | 99 | 99 |
| Доля цис-9, транс-11 (%) | 75 | 83 | 73 | 95 | 94 |
| Доля цис-9, транс-11 (%)* | - | - | - | 81 | 82 |
| Расход линолевой кислоты (%) | 93 | 94 | 92 | 90 | 92 |
| *содержит также CLA, происходящую из Kotilen. |
Пример 4
Получение CLA после фазы клеточного роста
Повторяя ферментацию примера 3, исследовали способность пропионово-кислых бактерий производить CLA после фазы клеточного роста клетки, с той лишь разницей, что линолевую кислоту и сорбитанолеатный детергент в мицеллярном растворе добавляли в бульон только в конце фазы быстрого роста клеток PJS, через 51 час от начала культивирования. Концентрация линолевой кислоты в среде составляла 600 мкг/мл, а детергента - 0,9%. Концентрация клеток в момент добавления равнялась 1,8×1010 КОЕ/мл. После этого клеточный рост останавливался приблизительно на три часа, а потом очень медленно продолжался.
Преобразование линолевой кислоты в CLA клетками проходило очень быстро: за три часа выход CLA составил 45% и за шесть часов - 58%. Преимуществами этого способа являются более короткая продолжительность ферментации (приблизительно 60 часов) по сравнению с соответствующим культивированием, когда линолевая кислота и детергент присутствуют в среде для выращивания с самого начала (приблизительно 100 часов).
Пример 5
Использование не растущих бактериальных клеток в буферном растворе для производства CLA
Клетки PJS выращивали в бульоне, основанном на сыворотке, в течение 3 дней при 30°С, клетки центрифугировали и промывали 0,1 М буфером фосфата натрия (рН 6,0). В 50 мл 0,1 М буфер фосфата натрия (рН 7,8) добавляли 2,0 г влажной клеточной массы, в результате чего концентрация клеток в буфере становилась равной приблизительно 3×1010 КОЕ/мл. Линолевую кислоту, полученную в виде мицелл по примеру 1, добавляли в таком количестве, чтобы концентрация линолевой кислоты в буферном растворе равнялась 600 мкг/мл. Раствор инкубировали при температуре 6°С или 30°С в течение 21 часа. CLA анализировали способом ГХ и измерением на спектрофотометре с длиной волны 235 нм.
Результаты представлены в таблице 4. Образование CLA в буферном растворе с помощью не растущих клеток PJS происходило при любой изучаемой температуре и было наиболее эффективным при 30°С. Получение CLA в питательном растворе требует добавления детергента для удержания линолевой кислоты в мицеллярной форме. Благоприятная концентрация детергента зависит от концентрации исходного вещества в растворе. В буферном растворе, в свою очередь, никакого отдельного добавления детергента к реакционному бульону не требуется, оно даже может быть губительно.
| Таблица 4 Выход CLA (г полученной CLA/ г LA с не растущими клетками PJS в фосфатном буфере, рН 7,8) | ||
| Выход CLA (%) | ||
| Реакционное время (ч) | 6°С | 30°С |
| 3 5 | 3 5 | 20 29 |
| 21 | 20 | 63 |
Пример 6
Получение CLA из сафлорового масла
а) Омыление сафлорового масла
Жирные кислоты выделяли из сафлорового масла омылением в мягких условиях с антиоксидантом, таким образом предотвращали окисление линолевой кислоты. Для омыления использовали гидроксид калия или натрия, этиловый спирт, воду и аскорбиновую кислоту, например, в следующих пропорциях: сафлоровое масло 10 г, насыщенный водный раствор КОН 5 мл, этиловый спирт 50 мл, вода 10 мл (количество также может быть меньшим) и аскорбиновая кислота 1 г. Смесь обрабатывали азотом и плотно закрывали крышку. Смесь омыляли в течение ночи при магнитном перемешивании. Неомыляемый остаток экстрагировали из раствора, например, с помощью 30 мл гексана. Для предотвращения эмульгирования в смесь можно также добавлять воду. После этого раствор подкисляли (рН от 2 до 3) концентрированной хлористоводородной кислотой. Жирные кислоты экстрагировали из раствора, например, дважды 40 мл гексана. Гексан упаривали на роторном испарителе, жир переносили в колбу с плотно привинчивающейся крышкой и несколько минут обрабатывали азотом. После этого смесь жиров была готова, и ее хранили в морозильнике для предотвращения окисления.
b) Образование мицелл
Мицеллы жирной кислоты получали в соответствии с настоящим изобретением из смеси свободных жирных кислот, полученных из сафлорового масла, с помощью Kotilen, воды и гидроксида натрия, например, в следующих пропорциях: препарат сафлорового масла 700 мг, вода 30 мл, Kotilen 0,75 мл, 2 н. раствор гидроксида натрия 1,5 мл. Перед смешиванием Kotilen и воду можно нагревать приблизительно до 40°С. Kotilen смешивали с водой, обработанной азотом. Препарат сафлорового масла добавляли к смеси при тщательном перемешивании. Наконец, по каплям добавляли раствор гидроксида натрия, в результате чего смесь осветлялась.
c) Получение CLA
CLA может быть получена из раствора жирных кислот с помощью бактерий, например, следующим образом: в среду для роста, которая содержит, например, 2% растворенной сыворотки, 0,5% гидролизата казеина, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,9% Kotilen, добавляли раствор, содержащий линолевую кислоту и 2% затравку культуры Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS, которую растили в течение трех дней. Выход CLA (%), продуцируемой бактериями при температуре 30°С, представлен в таблице 5.
| Таблица 5 Выход CLA в отношении к количеству добавленной линолевой кислоты | ||
| Время (дни) | Начальная концентрация линолевой кислоты мкг/мл | Выход CLA (цис-9,транс-11 % |
| 3 | 600 | 95 |
| 4 | 1500 | 86 |
Пример 7
Получение композиции, содержащей сухую CLA
Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS культивировали в среде на основе сыворотки, которая содержала 2% пермеата молочной сыворотки (Valio Оу), 0,5% гидролизата казеина (Valio Оу), 0,5% дрожжевого экстракта (LabM) и 0,2 г линолевой кислоты, полученной в виде мицелл, как описано в примере 1. В среду вводили затравку 1% свежей бактериальной культуры, рН поддерживали равным 6,5 с помощью блока автоматического регулирования рН и в процессе культивирования поддерживали температуру при 30°С. Через четыре дня культивирования клеточную культуру вместе со средой упаривали на роторном испарителе до одной четвертой от начального объема и полученный концентрат лиофилизировали в сушке Heto. Выход порошка составил 23-25 г/1000 мл. Полученный порошок содержал CLA в количестве 8,056 мг/г (193 мг/24 г порошка), то есть 96% первоначальной линолевой кислоты было преобразовано в CLA. Из общего количества CLA 79% представляло собой наиболее биологически активный изомер. Результаты представлены в таблице 6.
| Таблица 6 Получение CLA с помощью PJS в среде для выращивания | |
| PJS | |
| Общее количество CLA мг/г в виде порошка | 8,056 |
| Цис-9,транс-11-изомер, мг/г | 6,373 |
| Линолевая кислота, мг/г | 0,609 |
1. Способ получения конъюгированной линолевой кислоты из линолевой кислоты с помощью микроорганизмов, способных к преобразованию линолевой кислоты в конъюгированную линолевую кислоту, включающий составление реакционной смеси, содержащей клетки указанных микроорганизмов, поверхностно-активное вещество и линолевую кислоту, и инкубирование смеси в условиях, обеспечивающих возможность образования конъюгированной линолевой кислоты, отличающийся тем, что линолевую кислоту и поверхностно-активное вещество в реакционную смесь добавляют в форме мицелл.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что мицеллы образуются в результате взаимодействия свободной линолевой кислоты с поверхностно-активным веществом в щелочной среде.
3. Способ по из п.1 или 2, отличающийся тем, что мицеллы содержат смесь линолевой кислоты и полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что получают преимущественно цис-9, транс-11 изомер конъюгированной линолевой кислоты.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что преобразование проводят с помощью пропионовокислой бактерии.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что штамм пропионовокислых бактерий относится к виду Propionibackerium freudenreichii и предпочтительно к его подвидам Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii или Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пропионовокислая бактерия представляет собой Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii 131 или Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что получение конъюгированной линолевой кислоты происходит одновременно с бактериальным ростом.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что превращение происходит в присутствии поверхностно-активного вещества.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что поверхностно-активным веществом является полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, который используется в концентрации от 0,5 до 1,5%.
11. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что получение конъюгированной линолевой кислоты происходит после культивирования бактерий.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что превращение производится клетками, отделенными от среды для выращивания без отдельного добавления поверхностно-активного вещества.
13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что получение конъюгированной линолевой кислоты происходит в сочетании с получением пищевого продукта.
14. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что конъюгированную линолевую кислоту выделяют из реакционного бульона и, необязательно, сушат.
15. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что конъюгированную линолевую кислоту и бактериальные клетки концентрируют и, необязательно, сушат.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что конъюгированную линолевую кислоту и бактериальные клетки выделяют, концентрируют и лиофилизируют.
17. Продукт, содержащий конъюгированную линолевую кислоту, полученный способом по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что по меньшей мере 75% конъюгированной линолевой кислоты представляет собой цис-9, транс-11 изомер.
